一種高效制備重組人堿性成纖維細胞生長因子的方法【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高效制備重組人堿性成纖維細胞塵長因子(以下簡稱rh-bFGF)的方法，主要是提高rh-bFGF在大腸桿菌中表達量的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。其特征在于，對rh-bFGF的編碼基因進行重新設計，獲得特定的人工突變序列，具體序列如本發(fā)明SEQ?ID?No.1。將該序列的基因克隆到大腸桿菌表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)培養(yǎng)、誘導可以獲得比文獻報道水平顯著提高的表達效果，目標產(chǎn)物可以達到占全菌蛋白的25％以上。該方法在制備重組人堿性成纖維細胞生長因子的過程中具有很高的實用價值?！緦＠f明】一種高效制備重組人堿性成纖維細胞生長因子的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地涉及到一種重組人堿性成纖維細胞生長因子(rh-bFGF)的制備方法，同時涉及提高rh-bFGF在大腸桿菌中表達量的方法。[0002]發(fā)明背景[0003]重組人喊性成纖維細胞生長因子(RecombinantHumanBasicFibroblastGrowthFactor,rh-bFGF)是成纖維細胞生長因子(bFGF)家族的一個重要成員，目前所確定的bFGF分子量有18kD、22kD、22.5kD、24kD和34kD五種形式(FlorkiewiczRZ,SommerA.Humanbasicfibroblastgrowthfactorgeneencodesfourpolypeptides,threeinitiatetranslationfromnon-AUGcodons.ProcNatlAcadSciUSA,1989Jun,86(II):3978-3981；ArnaudE,TouriolC,BoutonnetC,GensacMC,VagnerS,PratsH,PratsAC.Anew34—kilodaltonisoformofhumanfibroblastgrowthfactor2iscapdependentlysynthesizedbyusinganon—AUGstartcodonandbehavesasasurvivalfactor.MolCellBiol,1999Jan,19(1):505-514)，其中分子量為18kD的bFGF包含155個氨基酸，不含N-端原子定位信號，且為bFGF活性的主要形式(PatryV,BuglerB,AmalricF,PromeJC,PratsH.Purificationandcharacterizationofthe210-aminoacidrecombinantbasicfibroblastgrowthfactorform(FGF-2).FEBSLett,1994Jul25,349(1):23-28)。[0004]從不同組織提取的bFGF肽鏈長短不一，分子量均少于18KD。如牛腦垂體bFGF是由146個氨基酸組成的單鏈非糖化多肽，分子量為16.4KD。這是由于不同的bFGF的分子量因其N末端不同而異，bFGF羧基末端較氨基末端穩(wěn)定，少于155個氨基酸的bFGF均為其氨基末端截取形式?，F(xiàn)已證實含155個氨基酸的bFGF其氨基末端截取少于25個氨基酸時并不影響其生物學活性。(`Chen-xiaoJiaetal,CloningandhighlevelnonfusionexpressionofrecombinanthumanbasicfibroblastgrowthfactorinEscherichiacol1.ActaPharmacolSin,2002sep；23(9):782-786)。[0005]bFGF在生物進化上具有很強的保守性，如:人bFGF(h-bFGF)和牛bFGF氨基酸順序同源性達98.7%，鳥類和牛bFGF完全相同。[0006]rh-bFGF具有重要的臨床應用價值，是基因工程重組蛋白質(zhì)類藥物，是治療人體燒傷、組織創(chuàng)傷、手術(shù)傷及難治性潰瘍(如褥瘡、糖尿病導致的膚體潰瘍伴有末梢神經(jīng)炎等)等疾病的首選藥物，是藥效明確、市場認可度高的品種之一。同時rh-bFGF在治療腦中風后遺癥、腦呆、退行性神經(jīng)病變、缺血性心臟病和外周血管病等方面有多項進入臨床試驗(牟旭鵬，人堿性成纖維細胞生長因子cDNA的克隆及在畢赤酵母中的表達，吉林大學，2006，5；CHENQiong-yuetal.,HighandstableexpressionofananalogofhumanbasicfibroblastgrowthfactorinEscherichiacol1.ChineseJournalofPathophysiology2006,22(2):247-250)。[0007]bFGF來源于神經(jīng)組織、垂體、腎上腺皮質(zhì)、視網(wǎng)膜、黃體和胎盤等，但由于其含量極少，因此難以從純天然的組織中獲得。通過基因工程的手段在大腸桿菌中發(fā)酵不失為一種理想和常用的方法。[0008]自1986年Abraham等首次克隆了bFGF的cDNA以來，bFGF基因的克隆和表達研究在原核表達系統(tǒng)中取得了重大進展，Iwaneetal.、Foxetal.、Sqiresetal、Knoerzeretal、Keetal.、Rinasetal等構(gòu)建了各自不同的表達載體,在大腸桿菌中表達出具有生物活性的bFGF(IwataA,MasagoA,YamadaK.ExpressionofbFGFmRNAaftertransientfocalischemia:comparisionwithexpressionofc-fos,c-jun,andhsp70mRNA.NeuroTrauma,1997,14(4):201-209;FoxGM,SchifferSG,RohdeMF,TsaiLB,BanksAR,ArakawaT.Production,BiologicalActivity,andStructureofRecombinantBasicFibroblastGrowthFactorandanAnalogwithCysteineReplacedbySerine.JBiolChem，1988，263:18452-18458；SquiresCH,ChildsJ,EisenbergSP,PolveriniPJ,SommerA.ProductionandcharacterizationofhumanbasicfibroblastgrowthfactorfromEscherichiacol1.JBiolChem,1988,263:16297-16302;Knoerzerff.BinderHP.SchneiderK,GrussP,McCarthyJE,Risauff.ExpressionofSytheticgenescodesbovineandhumanbasicfibroblastgrowthfactors(bFGFs)inEscherichiacol1.Gene,1989,21:30；RinasU.SynthesisiratesofcellularproteinsinvolvedintranslationandproteinfoldingarestronglyalteredinresponsetooverproductionofbasicfibroblastgrowthfactorbyrecombinantEscherichiacoi1.BiotechnolProg,1996Mar-Apr,12(2):196-200)。[0009]目前，重組h-bFGF的生產(chǎn)主要依靠大腸桿菌表達系統(tǒng)，但是，h-bFGF的可溶性與穩(wěn)定性較低，在溶液中很不穩(wěn)定，靜止后極易形成二聚體、三聚體甚至多聚體，嚴重時出現(xiàn)絮狀沉淀，極大的影響蛋白質(zhì)活性；同時，非融合的h-bFGF在原核細胞中的表達量低。根據(jù)文獻，目前尚無bFGF表達量超過15%的報道。分析原因，主要是h-bFGF的翻譯起始區(qū)(TranslationInitiationRegion,TIR)GC含量高,大腸桿菌的偏好密碼子稀少的緣故。[0010]可見，優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)是提高表達效率的重要途徑。本發(fā)明基于GenBank中含有147個氨基酸(GENEBANKPROTEINIDAAQ73204.1)的rh-bFGF的核苷酸序列(GENBANK:AY367060.1)，對rh-bFGF的編碼基因進行重新設計，獲得特定的人工突變序列，克隆并在大腸桿菌中表達，獲得了優(yōu)于文獻報道的表達效果，使bFGF在大腸桿菌中的表達量達到并超過25%?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0011]本發(fā)明的目的就是提供一種制備重組人堿性成纖維細胞生長因子(rh-bFGF)的方法，提高rh-bFGF在大腸桿菌中表達量的方法，從而在制備藥用重組人堿性成纖維細胞生長因子方面得到應用。通過對rh-bFGF的編碼基因進行重新設計，獲得特定的人工突變序列。將該序列的基因克隆到大腸桿菌表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)培養(yǎng)、誘導可以獲得比文獻報道水平顯著提高的表達效果，目標產(chǎn)物可以達到占全菌蛋白的25%以上。該方法在制備重組人堿性成纖維細胞生長因子的過程中具有很高的實用價值，在制備藥用重組人堿性成纖維細胞生長因子中的應用前景廣闊。[0012]本發(fā)明的目的通過這樣的技術(shù)方案來實現(xiàn):[0013]I)本發(fā)明基本的核苷酸序列基于GENEBANK報道的編碼rh-bFGF的核苷酸序列如SEQIDN0.2(GenBank:AY367060.1)，氨基酸序列如SEQIDN0.5。通過對rh-bFGF的編碼基因進行重新設計，獲得如SEQIDN0.1所述的人堿性成纖維細胞生長因子的人工編碼序列，人工合成該序列，5’及3’端包括可以接受的限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點保護堿基、限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(如EcoRI和BamHI)、起始密碼子ATG和終止密碼子TAA，序列差異如附圖3；[0014]2)采用適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶酶切上一步驟合成的基因，并采用DNA連接酶連接到同樣酶切的可接受的大腸桿菌表達載體，該載體可以是但不限于pBV220、pET系列載體等原核表達載體；[0015]3)將步驟2)獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得表達重組人堿性成纖維細胞生長因子的基因工程菌，所述大腸桿菌可以是但不限于JM109、DH5a、BL21等大腸桿菌；[0016]4)步驟3)獲得的大腸桿菌經(jīng)過誘導表達、發(fā)酵、提取純化，獲得重組人堿性成纖維細胞生長因子原料?！緦＠綀D】【附圖說明】[0017]圖1是誘導表達rh-bFGF的SDS-PAGE圖。左起第I道:rh_bFGF序列改造前，未誘導全菌；第2道:rh-bFGF序列改造前，誘導6h全菌；第3道:rh_bFGF標準品；第4道:實施例二rh-bFGF序列重新設計后，未誘導?’第5道:實施例二rh-bFGF序列重新設計后，誘導6h全菌；第6道:實施例一rh-bFGF序列重新設計后，誘導6h全菌；第7道:實施例三rh-bFGF序列重新設計后，誘導6h全菌；第8道:實施例一rh-bFGF序列重新設計后，未誘導全菌[0018]圖2是rh-bFGF提取純化SDS-PAGE檢測圖。左起第I道:實施例二中菌株發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)純化后效果；左起第2道:實施例一中菌株發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)純化后效果；左起第3道:bFGF標準品；左起第6道:實施例三中菌株發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)純化后效果[0019]圖3是SEQIDN0.1-4序列差異對比圖。實施例[0020]實施例按【
發(fā)明內(nèi)容】的方法進行，更為詳盡地描述了本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明。[0021]實施例一:[0022]具體步驟:[0023]I)基因的來源:基于GENEBANK報道的編碼rh-bFGF的核苷酸序列如SEQIDN0.2(GenBank:AY367060.1)。對該編碼基因進行重新設計；[0024]2)目的序列的重新設計:對步驟I)中rh-bFGF序列N端起的第5、6、11、12、13、15、21、22、23、26、120、123、125、126、127、130、131、133、137、138、139、140位氨基酸編碼基因進行重新設計，確保其編碼的氨基酸不變的情況下，對其密碼子進行修改，得到如SEQIDN0.1所示序列；[0025]3)目的序列的獲得:通過人工合成的方式，獲得目的突變序列；[0026]4)突變基因與特定表達質(zhì)粒的連接重組:設計酶切位點EcoRI和BamHI，選用pbv220表達質(zhì)粒，獲得突變基因與表達質(zhì)粒的重組子，連接方法依照《分子克隆實驗指南》，連接體系為10μL，其中T4連接酶IμL，bufferIμL，目的片段6μL，表達質(zhì)粒2μL，連接溫度16°C過夜連接；[0027]5)重組子的轉(zhuǎn)化:選擇大腸桿菌BL21，作為宿主菌株。將4)中獲得的重組子轉(zhuǎn)化到BL21中。轉(zhuǎn)化方法依照《分子克隆實驗指南》；[0028]6)目的蛋白(rh-bFGF)的誘導表達:采用大腸桿菌溫度誘導方式進行誘導表達，其中誘導溫度42°C，連續(xù)誘導6小時，誘導前濃度OD6tltl為0.6，經(jīng)過誘導，該菌株的rh-bFGF蛋白表達量可占全菌蛋白的25%以上，誘導前后SDS-PAGE檢測結(jié)果如附圖1，左起第7道；[0029]7)大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng):按常規(guī)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)進行，培養(yǎng)溫度37°C，誘導溫度42°C，誘導10小時；[0030]8)蛋白分離純化:采用常規(guī)離子交換層析法進行分離純化，平衡液為0.6mol/LNaCl+20mmol/LPBS(ρΗ7.0)，洗脫液為1.0mol/LNaCl+20mmol/LPBS(ρΗ7.0)沖洗，1.8mol/LNaCl+20mmol/LPBS(pH7.0)洗脫，收集洗脫峰，SDS-PAGE分析鑒定，結(jié)果如附圖2，左起第2道。[0031]實施例二:[0032]I)基因的來源:基于GENEBANK報道的編碼rh-bFGF的核苷酸序列如SEQIDN0.2(GenBank:AY367060.1)。通過對rh-bFGF的編碼基因進行重新設計；[0033]2)目的序列的重新設計:對步驟I)中對rh-bFGFN端起的第5、6、11、12、13、15、21、22、23、26位氨基酸編碼基因進行重新設計，確保其編碼的氨基酸不變的情況下，對其密碼子進行修改，得到如SEQIDN0.3所示序列；[0034]3)目的序列的獲得:通過人工合成的方式，獲得目的突變序列；[0035]4)突變基因與特定表達質(zhì)粒的連接重組:設計酶切位點EcoRI和BamHI，選用pbv220表達質(zhì)粒，獲得突變基因與表達質(zhì)粒的重組子，連接方法依照《分子克隆實驗指南》，連接體系為10μL，其中T4連接酶IμL，bufferIμL，目的片段6μL，表達質(zhì)粒2μL，連接溫度16°C過夜連接；[0036]5)重組子的轉(zhuǎn)化:選擇大腸桿菌BL21，作為宿主菌株。將4)中獲得的重組子轉(zhuǎn)化到BL21中。轉(zhuǎn)化方法依照《分子克隆實驗指南》；[0037]6)目的蛋白(rh-bFGF)的誘導表達:采用大腸桿菌溫度誘導方式進行誘導表達，其中誘導溫度42°C，連續(xù)誘導6小時，誘導前濃度OD6tltl為0.6，經(jīng)過誘導，該菌株的rh-bFGF蛋白表達量占全菌蛋白的15%以上，誘導前后SDS-PAGE檢測結(jié)果如附圖1，左起第4道及第5道；[0038]7)大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng):按常規(guī)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)進行,培養(yǎng)溫度37°C,誘導溫度42°C，誘導10小時；[0039]8)蛋白分離純化:采用常規(guī)離子交換層析法進行分離純化，平衡液為0.6mol/LNaCl+20mmol/LPBS(ρΗ7.0)，洗脫液為1.0mol/LNaCl+20mmol/LPBS(ρΗ7.0)沖洗，1.8mol/LNaCl+20mmol/LPBS(pH7.0)洗脫，收集洗脫峰，SDS-PAGE分析鑒定，結(jié)果如附圖2，左起第I道。[0040]實施例三:[0041]I)基因的來源:基于GENEBANK報道的編碼rh-bFGF的核苷酸序列如SEQIDN0.2(GenBank:AY367060.1)。通過對rh-bFGF的編碼基因進行重新設計；[0042]2)目的序列的重新設計:對步驟I)中對rh-bFGFN端起的第120、123、125、126、127、130、131、133、137、138、139、140位氨基酸編碼基因進行重新設計，確保其編碼的氨基酸不變的情況下，對其密碼子進行修改，得到如SEQIDN0.4所示序列；[0043]3)目的序列的獲得:通過人工合成的方式，獲得目的突變序列；[0044]4)突變基因與特定表達質(zhì)粒的連接重組:設計酶切位點EcoRI和BamHI，選用pbv220表達質(zhì)粒，獲得突變基因與表達質(zhì)粒的重組子，連接方法依照《分子克隆實驗指南》，連接體系為10μL，其中T4連接酶IμL，bufferIμL，目的片段6μL，表達質(zhì)粒2μL，連接溫度16°C過夜連接；[0045]5)重組子的轉(zhuǎn)化:選擇大腸桿菌BL21，作為宿主菌株。將4)中獲得的重組子轉(zhuǎn)化到BL21中。轉(zhuǎn)化方法依照《分子克隆實驗指南》；[0046]6)目的蛋白(rh-bFGF)的誘導表達:采用大腸桿菌溫度誘導方式進行誘導表達，其中誘導溫度42°C，連續(xù)誘導6小時，誘導前濃度OD6tltl為0.6，經(jīng)過誘導，該菌株的目標產(chǎn)物占全菌蛋白的10%。誘導前后SDS-PAGE檢測結(jié)果如附圖1，左起第8道及第6道；[0047]7)大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng):按常規(guī)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)進行,培養(yǎng)溫度37°C,誘導溫度42°C，誘導10小時；[0048]8)蛋白分離純化:采用常規(guī)離子交換層析法進行分離純化，平衡液為0.6mol/LNaCl+20mmol/LPBS(ρΗ7.0)，洗脫液為1.0mol/LNaCl+20mmol/LPBS(ρΗ7.0)沖洗，1.8mol/LNaCl+20mmol/LPBS(pH7.0)洗脫，收集洗脫峰，SDS-PAGE分析鑒定，結(jié)果如附圖2，左起第6道。`【權(quán)利要求】1.一種采用基因工程方法高效制備重組人堿性成纖維細胞生長因子(rh-bFGF)的方法，其主要步驟是:1)人工合成如SEQIDN0.1所述的人堿性成纖維細胞生長因子的人工編碼序列，該序列的5’及3’端還可包含可以接受的限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點保護堿基、限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點、起始密碼子和終止密碼子；2)采用適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶酶切上一步驟合成的基因，并采用DNA連接酶連接到同樣酶切的可接受的大腸桿菌表達載體，該載體可以是但不限于PBV220、pET系列載體等原核表達載體；3)將步驟2)獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得表達重組人堿性成纖維細胞生長因子的基因工程菌，所述大腸桿菌可以是但不限于JM109、DH5a、BL21等大腸桿菌；4)步驟3)獲得的大腸桿菌經(jīng)過誘導表達、發(fā)酵，菌體中的目標產(chǎn)物可以達到全菌蛋白的25%以上，然后經(jīng)提取純化，獲得重組人堿性成纖維細胞生長因子原料。2.權(quán)利要求1所述方法在制備藥用重組人堿性成纖維細胞生長因子中的應用?！疚臋n編號】C12N15/70GK103667329SQ201210341883【公開日】2014年3月26日申請日期:2012年9月17日優(yōu)先權(quán)日:2012年9月17日【發(fā)明者】徐明波,賈東晨,王俊玲,王喜鶴,秦富景,陳獻華,吳彥卓申請人:北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司,北京雙鷺生物技術(shù)有限公司