專利名稱：一種人胃癌多藥耐藥細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種人胃癌多藥耐藥細(xì)胞系。
背景技術(shù)：
胃癌在我國(guó)是死亡率位居前列的惡性腫瘤之一，化療是胃癌的主要療法之一，特別對(duì)于術(shù)后殘留癌細(xì)胞的清除、防止癌癥復(fù)發(fā)，化療具有重要的治療價(jià)值。但是，臨床上對(duì)應(yīng)用的化療藥物及給藥方案的總體評(píng)價(jià)并不理想，甚至有文獻(xiàn)報(bào)道胃癌的術(shù)后化療既不能降低復(fù)發(fā)率，也不能改善預(yù)后。研究表明，胃癌化療失敗主要與癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)有關(guān),多藥耐藥成為化療效果的阻礙。因此，胃癌多藥耐藥的機(jī)制、臨床意義及耐藥逆轉(zhuǎn)成為腫瘤研究中的熱點(diǎn)之一，建立實(shí)驗(yàn)需要的胃癌耐藥細(xì)胞模型更具有重要的意義?！つ[瘤細(xì)胞的MDR是指腫瘤細(xì)胞對(duì)某一化療藥物產(chǎn)生耐藥后，對(duì)其他化學(xué)結(jié)構(gòu)及機(jī)理不同的化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性。胃癌MDR指癌細(xì)胞在接觸一種抗惡性腫瘤藥后，同時(shí)對(duì)多種結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制各異的的藥物產(chǎn)生了耐受性。國(guó)內(nèi)曾用于MDR研究的胃癌耐藥細(xì)胞系，多是在體外用抗癌藥物逐漸誘導(dǎo)的方法建立的MDR細(xì)胞。該類方法建立的細(xì)胞系能很好地模擬人類腫瘤化療過程中經(jīng)常發(fā)生的MDR現(xiàn)象。但此方法建立的MDR細(xì)胞，有生物特性和敏感性差異，當(dāng)處于無化療藥物培養(yǎng)時(shí)，穩(wěn)定性較差，耐藥性容易丟失。另外，由該方法建立的細(xì)胞產(chǎn)生的MDR機(jī)制復(fù)雜，如SGC7901/VCR細(xì)胞MDR的產(chǎn)生，除P糖蛋白(P_gp)外，還有多藥耐藥相關(guān)蛋白基因MRP等參與，這不利于對(duì)MDR現(xiàn)象中單一機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)的研究，如逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞mdrl介導(dǎo)MDR的中藥活性成分篩選等。

發(fā)明內(nèi)容
mdrl是人類多藥耐藥基因的基因家族中唯一有功能的耐藥基因，編碼產(chǎn)物為P糖蛋白(P-gp)。人類的mdrl基因位于7q21. 1，mdrl基因組序列包括28個(gè)內(nèi)含子和26個(gè)分割讀碼框序列，由 Homo sapiens BAC clone CTB-60P12 和 CTB-137N13 from 7, completesequence提供，內(nèi)含子長(zhǎng)度不等,變化在126 15203 bp之間?；诒磉_(dá)載體對(duì)插入片段大小的限制，mdrl基因序列太大無法實(shí)現(xiàn)表達(dá)載體的構(gòu)建,mdrl cDNA序列長(zhǎng)度可以實(shí)現(xiàn)。pHaMDRl是缺陷病毒載體，需經(jīng)包裝細(xì)胞系提供結(jié)構(gòu)蛋白，才具有感染性，是在敲除癌基因的鼠哈維氏肉瘤病毒的基礎(chǔ)上構(gòu)建而成的。pHaMDRl載體插入mdrl cDNA序列，導(dǎo)入細(xì)胞后表達(dá)全長(zhǎng)的mdrl mRNA。本發(fā)明將轉(zhuǎn)錄病毒載體pHaMDRl轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，以產(chǎn)生具有感染性的病毒液。本發(fā)明目的是公開一種胃癌多藥耐藥細(xì)胞系，該胃癌多藥耐藥細(xì)胞系可按以下步驟建立(I)將SGC7901細(xì)胞放于含100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置37 °C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(2)將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pHaMDRl轉(zhuǎn)化至DH5 a大腸桿菌，擴(kuò)增并提取pHaMDRl，對(duì)提取的pHaMDRl進(jìn)行酶切；(3)用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將酶切后的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pHaMDRl轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，轉(zhuǎn)染后的包裝細(xì)胞293T繼續(xù)培養(yǎng)，收集病毒；(4)將病毒液加入步驟(I)所得的SGC7901細(xì)胞，37 °C培養(yǎng)6 h后，換用含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；(5)重復(fù)上述步驟(4)，將感染后的細(xì)胞培養(yǎng)于含60ng / ml秋水仙堿的培養(yǎng)基，培養(yǎng)至克隆形成為止，即得到具有耐藥性的SGC7901/mdrl 細(xì)胞系。其中，步驟(3)中所收集病毒的病毒滴度為2. 7X IO5 CFU/ml。其中，步驟(5)中每天重復(fù)上述步驟(4)，共重復(fù)三次。本發(fā)明的胃癌多藥耐藥細(xì)胞系是采用基因克隆構(gòu)建人胃癌多藥耐藥細(xì)胞系，其構(gòu)建方法是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體，將mdrl cDNA基因克隆到胃癌細(xì)胞，使其表達(dá)有功能的mdrl，產(chǎn)生穩(wěn)定的耐藥性，從而建立胃癌mdr細(xì)胞系，以克服上述缺點(diǎn)?！け景l(fā)明所述的胃癌多藥耐藥細(xì)胞系，可應(yīng)用于胃癌mdr細(xì)胞模型的研究，篩選化療藥物及判斷化療藥物的敏感性，分析腫瘤化療多藥耐藥機(jī)制。利用本發(fā)明方法建立的胃癌耐藥細(xì)胞系，經(jīng)過細(xì)胞克隆檢測(cè)，并利用SPSS17. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，克隆細(xì)胞系mdrl mRNA的表達(dá)水平、P-gp的表達(dá)水平升高，細(xì)胞內(nèi)ADR蓄積量及細(xì)胞對(duì)ADR的敏感性減少，均區(qū)別于親本細(xì)胞SGC7901，接近于SGC7901/VCR。該結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入的mdr I基因在克隆細(xì)胞系中得到了高表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)的P_gp及mdrl mRNA的表達(dá)量顯著增加，細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性有了較大提高，從而證明mdrl基因編碼的P-gp是細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制之一。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是①提高了胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。轉(zhuǎn)入的mdrl基因在感染細(xì)胞克隆組得到了高表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)的P-gp及mdrl mRNA的表達(dá)量顯著增加，細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性有了較大提高，從而證明mdrl基因編碼的P-gp是細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制之一；②構(gòu)建了單一 mdrl介導(dǎo)胃癌MDR的研究平臺(tái)，為研究胃癌mdrl介導(dǎo)MDR及其逆轉(zhuǎn)打下基礎(chǔ)；③利用生物轉(zhuǎn)基因方法建立的胃癌MDR細(xì)胞，將為深入研究胃癌MDR提供理想的細(xì)胞模型。


圖I pHaMDRl質(zhì)粒圖譜。圖2秋水仙堿篩選兩周的感染組細(xì)胞生長(zhǎng)情況(100X)，感染細(xì)胞突起明顯，呈貼壁狀。圖3感染細(xì)胞克隆的外源基因整合檢測(cè)結(jié)果。I為SGC7901 / VCR組；2為SGC7901組；3為感染細(xì)胞克隆組；4為陽性對(duì)照；M為DNA Marker。圖4各組細(xì)胞的P-gp表達(dá)(400X)。P-gp免疫組化陽性顆粒位于細(xì)胞膜，呈棕黃色。①SGC7901/VCR組；②SGC7901 ;③感染細(xì)胞克隆組。圖5流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染后細(xì)胞內(nèi)ADR蓄積量的變動(dòng)。左側(cè)圖為未加ADR組，右側(cè)圖為加入ADR組；A為SGC7901/VCR組，B為SGC7901組，C為感染細(xì)胞克隆組。實(shí)施例實(shí)施例I細(xì)胞培養(yǎng)
將SGC7901細(xì)胞放于含100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置37 °C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0. 2%胰蛋白酶消化傳代。實(shí)施例2 pHaMDRl質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增
將pHaMDRl加入大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，冰上作用30 min, 42 °C水浴90 S，冰上作用2 min ;加入400 的LB培養(yǎng)基，37 °C搖床200 r/min 45 min ;隨后接種到含100U g/ml Amp的LB冷平板上，將平板倒置入37 °C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；用接種環(huán)分別挑取已轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pHaMDRl的DH5 a大腸桿菌，37 1搖菌過夜；
實(shí)施例3質(zhì)粒pHaMDRl的包裝及病毒滴度測(cè)定·
將2 ill lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，加入到含50 U I無血清、無抗生素的培養(yǎng)基的200 u I管中混勻，室溫孵育5 min ;將稀釋的質(zhì)粒加入稀釋的Lipofectamine 2000中混勻，室溫放置20 min，使DNA- Lipofectamine 2000復(fù)合物形成；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的293T細(xì)胞，用無抗生素的培養(yǎng)基稀釋，以2X IO5個(gè)/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；培養(yǎng)24 h后，用無血清、無抗生素的培養(yǎng)基洗滌兩次，而后加入0. 5 ml洗滌用培養(yǎng)基；從孔的一邊至另一邊逐滴加入DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物到換液后的細(xì)胞中，邊加邊前后搖動(dòng)培養(yǎng)板，使DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物和培養(yǎng)基充分混勻。轉(zhuǎn)染后的包裝細(xì)胞293T繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集上清液，于4 °CU0000 rpm、離心15 min，離心后的上清部分富含病毒即病毒液，將轉(zhuǎn)染后的病毒細(xì)胞液用培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，同時(shí)再加終濃度為8mg/L的聚凝胺；48 h后培養(yǎng)基中加入60 ng / ml的秋水仙堿培養(yǎng)，每2^3天換液，連續(xù)培養(yǎng)I周，一周后計(jì)數(shù)克隆數(shù)，克隆數(shù)除以病毒稀釋度為病毒滴度。實(shí)施例4 SGC7901細(xì)胞感染
將SGC7901細(xì)胞去除培養(yǎng)基；將病毒滴度測(cè)定符合轉(zhuǎn)染要求的病毒液室溫解凍后加入細(xì)胞，同時(shí)加入polybrene使其終濃度為8 mg / L ；37 °C培養(yǎng)6 h后，換用含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；如上感染，每天進(jìn)行一次，共3次。將感染后的SGC7901細(xì)胞培養(yǎng)于含60 ng / ml秋水仙堿的培養(yǎng)基，2 3天換液，直至克隆形成。結(jié)果見圖2。實(shí)施例5感染細(xì)胞克隆的外源基因整合檢測(cè)
按2X 105/ml的細(xì)胞密度分別接種SGC7901/VCR、SGC7901、感染細(xì)胞克隆組的細(xì)胞于25ml的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；取培養(yǎng)液用0.01 M PBS清洗一次，加入I ml的DNAiso Reagent進(jìn)行裂解；取細(xì)胞裂解液，10，OOOXg 4 °C離心lOmin，得上清；向上清液中加入DNAisoReagent 1/2體積量的無水乙醇,混勻,4，OOOXg室溫離心2 min,棄上清,再加入I ml75%的乙醇，洗滌沉淀，12，OOOXg 4 V離心5 min，棄上清；將DNA沉淀在室溫下干燥5 15 S，緩加入50 滅菌水溶解，備用。取滅菌的0. 2 ml EP管，依次加入下列試劑，使擴(kuò)增體系為25 iU :
IOXbuffer2. 5 U I
dNTP (2nM)2. 5 U I
MgC12 (25mM)I. 5 u I
mdrIcDNA 上游引物(50 u M)0. 5 U I
mdrlcDNA 下游引物(50 u M)0. 5 U IDNA2 u I
Taq 酶(5 U/u I)0. 2 U I
ddH2015.3 u I0將上述擴(kuò)增體系混勻，離心5s后置于PCR儀上擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95 °C預(yù)變性5min, 94 °C變性30 S，55 °C退火30 S，72 °C延伸50 S，循環(huán)30次，最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后72°C延伸5 min。同時(shí)以質(zhì)粒pHaMDRl為模板設(shè)為陽性對(duì)照。制備I. 2%瓊脂糖凝膠，取5 ill PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加樣，60 V恒壓電泳，溴酚藍(lán)染料遷移至凝膠陽極緣3/4處結(jié)束。以DL 2000 DNA Marker作參照,凝膠圖像分析儀觀察條帶的位置，并照像。結(jié)果見圖3。

實(shí)施例6細(xì)胞免疫組化檢測(cè)P-gp的表達(dá)
分別選擇SGC7901、感染細(xì)胞克隆組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用SABC法進(jìn)行細(xì)胞免疫，用tiger圖像分析系統(tǒng)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。用0. 2%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞至細(xì)胞回縮，加培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度達(dá)f2X106/ml，按5 u I/斑點(diǎn)，將細(xì)胞懸液滴加于涂有多聚賴氨酸的載玻片上；滴片在4 °C干燥24 h后，4%多聚甲醛固定20 min, 0.01 M PBS充分洗滌；冷風(fēng)吹干4 6 h，用含0. 3%Triton X-100的0. 01 M PBS溶液透化處理15 min，傾去多余液體，用0.3% H2O2溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶5 min,0.01 M PBS洗滌；繼續(xù)用正常羊血清封閉20 min，棄去不洗；兔抗人P-gp多克隆抗體(I: 50)，濕盒內(nèi)4 °C過夜(12 20 h)，室溫復(fù)溫I h，PBS洗5 minX 3次；生物素化山羊抗兔IgG (1:100),37 V 45 min，PBS洗
5minX3 次；SABC (1:100),37 °C 30 min，PBS 洗 5 minX3 次；DAB 顯色，自來水終止；自然晾干，香柏油封片。同時(shí)以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果見圖4。實(shí)施例7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)阿霉素(ADR)的蓄積
用0. 2%胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2 X 105/ml，接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h ;換用含10 u g/ml ADR的RPMI-1640培養(yǎng)液，作用90 min ；0. 2%胰酶消化，收取細(xì)胞；用4 °C保存的0.01 M PBS洗滌細(xì)胞3次，70%乙醇冰上固定5 min, 2000 rpm室溫離心5 min，重懸于冷PBS I ml，備用；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，接收波長(zhǎng)為575nm。同時(shí)設(shè)同樣處理、PBS取代ADR的同種細(xì)胞為空白對(duì)照。結(jié)果見圖5。
權(quán)利要求
1.一種胃癌多藥耐藥細(xì)胞系，其特征在于胃癌多藥耐藥細(xì)胞系按以下步驟建立(1)將SGC7901細(xì)胞放于含100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(2)將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pHaMDRl轉(zhuǎn)化至DH5 α大腸桿菌并擴(kuò)增；(3)用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pHaMDRl轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，轉(zhuǎn)染后的包裝細(xì)胞293T繼續(xù)培養(yǎng)，收集病毒；(4)將病毒液加入步驟(I)所得的SGC7901細(xì)胞，37 °C培養(yǎng)6 h后，換用含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；(5)重復(fù)上述步驟(4)，將感染后的細(xì)胞培養(yǎng)于含60ng / ml秋水仙堿的培養(yǎng)基，培養(yǎng)至克隆形成為止，即得到具有耐藥性的SGC7901/mdrl細(xì)胞系。
2.權(quán)利要求I所述的一種胃癌多藥耐藥細(xì)胞系，其特征在于，步驟(3)中收集病毒的病毒滴度為 2. 7 X IO5 CFU/ml。
3.權(quán)利要求I所述的一種胃癌多藥耐藥細(xì)胞系，其特征在于步驟(5)中重復(fù)上述步驟三次，每天一次。
4.權(quán)利要求I所述的一種胃癌多藥耐藥細(xì)胞系，可應(yīng)用于胃癌mdr細(xì)胞模型的研究。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胃癌多藥耐藥細(xì)胞系。該胃癌多藥耐藥細(xì)胞系是采用基因克隆構(gòu)建人胃癌多藥耐藥細(xì)胞系，其構(gòu)建方法是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體，將mdr1cDNA基因克隆到胃癌細(xì)胞，使其表達(dá)有功能的mdr1，產(chǎn)生穩(wěn)定的耐藥性，從而建立胃癌mdr細(xì)胞系。該方法建立的人胃癌多藥耐藥細(xì)胞系，提高了胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，同時(shí)構(gòu)建了單一mdr1介導(dǎo)胃癌多藥耐藥的研究平臺(tái)，在研究胃癌mdr1介導(dǎo)多藥耐藥及其逆轉(zhuǎn)的作用機(jī)理以及深入研究胃癌多藥耐藥提供細(xì)胞模型等方面具有應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/867GK102787098SQ20121032296
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月4日
發(fā)明者侯銳, 包巍, 李勇莉, 李晉雪, 李紅軍, 王國(guó)棟, 程珊, 路軍秀, 高福蓮 申請(qǐng)人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院