一種大蒜芥抗旱基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，提供一種大蒜芥抗旱基因SaHRD，其堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。構(gòu)建SaHRD植物表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)SaHRD基因煙草；結(jié)果表明：SaHRD基因在煙草中表達(dá)，轉(zhuǎn)SaHRD基因的煙草有明顯的抗旱效果。
【專利說明】一種大蒜芥抗旱基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種大蒜芥抗旱基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水資源短缺一直都是人類面臨的難以解決的問題，目前全球有1/3以上的土地為干旱或半干旱的地區(qū)。干旱嚴(yán)重制約和影響著農(nóng)作物的生長和產(chǎn)量，因此提高農(nóng)作的抗旱性，培育抗旱品種也逐漸成為科學(xué)家的焦點(diǎn)，研究生物的抗旱性成為農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。國內(nèi)外學(xué)者經(jīng)過幾十年來的努力，在植物的抗旱機(jī)制以及相關(guān)抗旱基因的挖掘方面做出了很大的貢獻(xiàn)。近年來，隨著分子遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因表達(dá)調(diào)控的研究，也發(fā)現(xiàn)了一些與植物抵抗干旱脅迫相關(guān)的物質(zhì)，如脯氨酸、甜菜堿、丙二醛、抗氧化酶類等，并分離鑒定出這些物質(zhì)的基因以及相關(guān)的調(diào)控因子，初步揭示了植物抗旱的分子機(jī)制。隨著分子生物學(xué)與生物技術(shù)的快速發(fā)展，也實(shí)現(xiàn)了相關(guān)抗旱基因的克隆，利用基因工程手段將克隆出的抗旱相關(guān)基因?qū)胫参锏幕蚪M中，以此得到抗旱性較強(qiáng)的新品種。
[0003]短命植物是一類生長于干旱荒漠地區(qū)，具有生長發(fā)育節(jié)律快、生活周期短、能在短時間內(nèi)完成生活史等特性的特殊生態(tài)類型植物。根據(jù)生長季節(jié)可以將短命植物分為三類:冬季一年生植物、夏季一年生植物和早春短命植物。由于大多短命植物生長的環(huán)境較為嚴(yán)酷，分布于干旱荒漠地區(qū)的也有不少，所以它們具有一定的防風(fēng)固沙、保持水分的作用，對改善土壤環(huán)境具有重要意義。一些分布在新疆北疆地區(qū)的短命植物因?yàn)橹θ~嫩軟成為草原上家畜的優(yōu)良牧草。同時，它們開花時色彩鮮艷，具有觀賞價值，在花卉及園林綠化中發(fā)揮重要作用。此外， 也有一些短命植物是傳統(tǒng)中藥藥材，具有藥用價值。另一方面，短命植物在與逆境相適應(yīng)的同時逐漸產(chǎn)生了一定的抗逆性，其抗逆基因資源的研究和挖掘?qū)τ谧魑锟鼓嬗N也具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種大蒜芥抗旱基因，其喊基序列如SEQ ID N0:1所不。
[0005]本發(fā)明的第二個目的在于一種大蒜芥抗旱基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
[0006]本發(fā)明的第三個目的在于提供一種含有大蒜芥抗旱基因的表達(dá)載體。
[0007]所述表達(dá)載體為植物表達(dá)載體。
[0008]本發(fā)明的第四個目的在于提供大蒜芥抗旱基因在提高植物抗旱性中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的第五個目的在于提供一種提高植物抗旱性的方法，將大蒜芥抗旱基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，得到具有抗旱性的植物，所述大蒜芥抗旱基因是下述核苷酸序列之
[0010]I) SEQ ID NO:1 所示 DNA 序列；
[0011]2)編碼SEQ ID NO:2所示氨基酸殘基序列的DNA序列。
[0012]所述大蒜芥抗旱基因通過含有所述大蒜芥抗旱基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞。
[0013]所述植物表達(dá)載體為pCAMBIA2300-35S-SaHRD-0CS。
[0014]本發(fā)明的技術(shù)路線為:
[0015]I)利用分子生物學(xué)方法從大蒜芥中克隆抗旱基因，命名為SaHRD ；
[0016]2)構(gòu)建SaHRD植物表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)SaHRD基因煙草；
[0017]3)結(jié)果表明=SaHRD基因在煙草中表達(dá)，轉(zhuǎn)SaHRD基因的煙草有明顯的抗旱效果。
[0018]本發(fā)明克隆了一種大蒜芥抗旱基因SaHRD，構(gòu)建SaHRD植物表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)SaHRD基因煙草；結(jié)果表明=SaHRD基因在煙草中表達(dá)，轉(zhuǎn)SaHRD基因的煙草有明顯的抗旱效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1SaHRD植物表達(dá)載體構(gòu)建流程圖；
[0020]圖2SaHRD轉(zhuǎn)基因煙草RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，M =Marker, I和2分別代表不同的轉(zhuǎn)基因煙草植株；
[0021]圖3SaHRD轉(zhuǎn)基因煙草RT-PCR檢測電泳圖，M =Marker, I和2分別代表不同的轉(zhuǎn)基因煙草植株；
[0022]圖4A經(jīng)濃度為5%的PEG處理后，轉(zhuǎn)SaHRD基因煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草的生長狀況；
[0023]圖4B經(jīng)濃度為25%`的PEG處理后，轉(zhuǎn)SaHRD基因煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草的生長狀況；
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)路線做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0025]本發(fā)明用到的材料、試劑和儀器:
[0026]植物材料:大蒜芥種子采自烏魯木齊烈士陵園，采后于4°C保存。
[0027]菌株材料:大腸桿菌DH5 a。
[0028]質(zhì)粒材料:pMD18_T，購自TaKaRa公司。
[0029]試劑:氯仿，異戊醇，乙醇，異丙醇等購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)，溴乙錠(EB)購自天根生化科技有限公司；蛋白胨，酵母提取物、氨芐青霉素購自寶信生物科技公司。
[0030]試劑盒和酶:pMD18_T載體、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒購自TaKaRa公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；Taq酶購自購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。
[0031]LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨0.5g，酵母提取物lg，NaCl lg，調(diào)pH值至7.0_7.5，定容到 IOOmL。
[0032]LB固體體培養(yǎng)基:胰蛋白胨0.5g，酵母提取物lg，NaCl lg，瓊脂粉1.5g，調(diào)pH值至 7.0-7.5，定容到 100mL。
[0033]主要儀器:電熱恒溫水槽(DK-8D)、高速離心機(jī)(Centrifuge 5415R)、PCR儀(AG2233IHamburg)、電泳儀(DYY-6D)、超凈工作臺(BHC-1300A/B3)、凝膠成像系統(tǒng)(FluorChemFC2)。[0034]實(shí)施例1 SaHRD基因克隆
[0035]提取大蒜芥基因組DNA
[0036]參照CTAB法稍作改動。分別稱取大蒜芥和線果芥葉片0.5-lg置于研缽中，液氮充分研磨，迅速將粉末轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管；向離心管中加入700 μ L經(jīng)65°C水浴后的CTAB提取液，加入β -疏基乙醇30 μ L ;混勻置于65°C水浴lh，每隔20min上下顛倒混勻I次；4°C，12000rpm離心lOmin，取上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，充分混勻；4°C，12000rpm離心lOmin，取上清至新離心管中，加入2/3體積的異丙醇，輕輕混勻，于_20°C冰浴30min,6000rpm離心5min ;棄上清,70%乙醇洗漆沉淀2次；自然晾干后加Λ 40 μ LTE充分溶解DNA，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0037]擴(kuò)增SaHRD某閔
[0038]以大蒜芥基因組DNA做為擴(kuò)增目標(biāo)基因的模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度為549bp的DNA片段，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示，命名為:SaHRD。SaHRD基因其編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，蛋白分子量為:19.69KDa，等電點(diǎn)為:6.53，同時擁有一個由64個氨基酸組成的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。
[0039]引物序列為:
[0040]上游引物:5’-GGTACCATGCAAGGAACCTCCAAAGAC-3’
[0041 ]下游引物:5’ -CTGCAGTCATGGAAAATTCCACAAGT AAT-3’
[0042]上游引物上加KpnI酶切位點(diǎn)，下游引物上加Pst I酶切位點(diǎn)，以利于下一步擴(kuò)增產(chǎn)物連接到載體上。
[0043]
PCR 反應(yīng)體系:IOX Buffer2.0 μ?,
dNIP0.5 μ?..Taq B0,4 μ?
引物IΙμΙ
引物2ΙμΙ
模板DNA2 pL
ddH20補(bǔ)充至20 μ￡
[0044]混勻，短暫離心至管底，進(jìn)行以下PCR程序:
[0045]94 dC 預(yù)變性5min
[0046]
94 °C 變ft50 s -η
50 °CiM火50 s r*- 35cycles
72 eC延伸I min」
[0047]72 °C 徹底延伸IOmin
[0048]4 °C保存
[0049]PCR擴(kuò)增目的條帶進(jìn)行回收然后連接PMD18-T載體進(jìn)行測序，驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。[0050] 連接體系如下:
[0051 ] 純化的目的DNA 4.5 μ L
[0052]pMD18-T0.5 μ L
[0053]Solution I5 μ L
[0054]連接條件:16 °C水浴過夜。
[0055]實(shí)施例2 SaHRD植物表達(dá)載體構(gòu)建
[0056]SaHRD植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-SaHRD_0CS構(gòu)建過程參見圖1。
[0057]用限制性內(nèi)切酶KpnI和PstI分別雙酶切載體pCAMBI2300-35s_0CS和目的基因SaHRD的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶進(jìn)行粘性末端的連接，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a進(jìn)行PCR檢測，得到SaHRD植物表達(dá)載體，命名為pCAMBIA2300-35S-SaHRD-0CS。
[0058]實(shí)施例3SaHRD植物表達(dá)載體農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草
[0059]1、農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
[0060]將含有SaHRD的質(zhì)粒pCAMBIA2300-35S-SaHRD_0CS用液氮凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌AgrO感受態(tài)中，條件:液氮凍3min，37°C 5min。篩選陽性單菌落，用含Rif (50mg/L),Sm(100mg/L)和Kan(100mg/L)的液體LB中28°C振蕩培養(yǎng)2d至對數(shù)生長期。
[0061]2、農(nóng)桿菌侵染及再生苗培養(yǎng)
[0062]將W38煙草無菌苗葉片切`成0.5cm2的小塊(傷口)，用經(jīng)過MS0液體培養(yǎng)基稀釋的農(nóng)桿菌菌液侵染15min，侵染后的葉片用無菌紙吸干，除去多余的農(nóng)桿菌菌液，將侵染后的葉片放入MS0培養(yǎng)基中共培養(yǎng)(暗培養(yǎng))2d。
[0063]將共培養(yǎng)后的葉盤轉(zhuǎn)移到含MSq+6_BA (2mg/mL)+Car (500mg/mL) +NAA (lmg/mL)+PPT (lOmg/mL)的分化培養(yǎng)基上。待分化出的芽Icm左右大小時，轉(zhuǎn)到含MSO+PPT (IOmg/L) +Car (500mg/L)的生根培養(yǎng)基上，3周左右形成不定根。將生根后的煙草苗移栽至溫室中。
[0064]3、轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定
[0065]提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片的總DNA和RNA，進(jìn)行PCR和RT-PCR檢測。
[0066]PCR 反應(yīng)體系(20 μ L)為:10 X buffer 2 μ L;
[0067]dNTPs (2.5mmol/L) 2 μ L;
[0068]引物各 I μ L;
[0069]模板 I μ L;
[0070]Taq DNA 聚合酶(10000U/mL) 0.5 μ L。
[0071]反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min ；94°C 30s,55°C 30s, 72°C lmin30s，30 個循環(huán)；然后72°C IOmin。
[0072]SaHRD轉(zhuǎn)基因煙草RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2所示，所提RNA結(jié)構(gòu)完整，符合接下來的RT-PCR檢測要求。
[0073]SaHRD轉(zhuǎn)基因煙草RT-PCR檢測結(jié)果如圖3所示，根據(jù)RT-PCR結(jié)果來看，篩選出的轉(zhuǎn)基因煙草RNA水平都有SaHRD基因的表達(dá)。
[0074]實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性實(shí)驗(yàn)
[0075]種子脅迫處理[0076]轉(zhuǎn)SaHRD基因煙草種子和非轉(zhuǎn)基因煙草分別經(jīng)過75%酒精處理之后，用無菌水潤洗數(shù)次，再播種于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿播種30粒，做3次重復(fù)，濾紙事先分別用0%，5%，10%, 15%和20%PEG-6000水溶液完全浸潤，然后封口置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，考察種子萌發(fā)特性。
[0077]在PEG濃度為20%時，轉(zhuǎn)SaHRD基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草基本不萌發(fā)，而在PEG的濃度在15%時，非轉(zhuǎn)基因煙草不萌發(fā)，轉(zhuǎn)SaHRD基因煙草的發(fā)芽率為56%。當(dāng)PEG的濃度在5%-10%時，轉(zhuǎn)SaHRD基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草都發(fā)芽，但轉(zhuǎn)SaHRD基因煙草的發(fā)芽率要高于非轉(zhuǎn)基因煙草。結(jié)果表明:轉(zhuǎn)SaHRD基因煙草在干旱脅迫中保持較高的萌發(fā)率，表現(xiàn)出較好的抗旱性。
[0078]幼苗脅迫處理
[0079]轉(zhuǎn)SaHRD基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草培養(yǎng)幼苗四周后采用0%，5%，10%, 15%，20%，25%PEG-6000水溶液澆灌，做3次重復(fù)，觀察葉片變化。
[0080]干旱處理后，PEG濃度為5%時，轉(zhuǎn)SaHRD基因煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草的生長狀況相比無表型上的差別(如圖4A所示)，隨著濃度的增加，葉片開始發(fā)生不同程度的萎蔫，當(dāng)PEG濃度達(dá)到25%時，非轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出失水嚴(yán)重的現(xiàn)象，轉(zhuǎn)SaHRD基因煙草葉片有部分萎蔫，還有部分發(fā)生卷曲，表現(xiàn)出對干旱脅迫具有一定的耐受性(如圖4B所示)。
[0081]SaHRD基因在干旱脅迫中的表達(dá)變化
[0082]用濃度為20%的PEG溶液澆灌轉(zhuǎn)SaHRD基因煙草，分別提取經(jīng)干旱脅迫處理8小時、12小時、24小時和48小時的轉(zhuǎn)SaHRD基因煙草葉片RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增SaHRD，
比較基因表達(dá)量的變化。
`[0083]轉(zhuǎn)基因煙草SaHRD基因在脅迫初期持續(xù)上調(diào)，至8h時達(dá)到最大值，為脅迫前的25.3倍，隨后在12h和24h時出現(xiàn)不同程度的下降，48h時出現(xiàn)大幅度下降，此時表達(dá)量僅為比脅迫前高出1.2倍。
【權(quán)利要求】
1.一種大蒜芥抗旱基因，其減基序列如SEQ ID N0:1所不。
2.權(quán)利要求1所述的大蒜芥抗旱基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQID N0:2所/Jn o
3.含有權(quán)利要求1所述大蒜芥抗旱基因的表達(dá)載體。
4.權(quán)利要求3所述表達(dá)載體為植物表達(dá)載體。
5.權(quán)利要求1所述大蒜芥抗旱基因在提高植物抗旱性的作用。
6.一種提高植物抗旱性的方法，將大蒜芥抗旱基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，得到具有抗旱性的植物，所述大蒜芥抗旱基因是下述核苷酸序列之一: 1)SEQ ID NO:1 所示 DNA 序列； 2)編碼SEQID NO:2所示氨基酸殘基序列的DNA序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述大蒜芥抗旱基因通過含有所述大蒜芥抗旱基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入 植物組織或細(xì)胞。
【文檔編號】C12N15/82GK103667307SQ201210319380
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月31日
【發(fā)明者】陳全家, 曲延英, 許春華, 孫國清 申請人:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)