專利名稱：天然藥物制劑中藁本內(nèi)酯的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種天然藥物制劑中藁本內(nèi)酯的測定方法。
背景技術(shù)：
藁本內(nèi)酯是中藥當歸、川芎中的重要活性 成份之一，其是具淡黃色帶香味的油狀液體，沸點為168 169°C，可溶于乙醇、甲醇、乙醚、乙酸乙酯、石油醚等有機溶劑，分子式為C12H14O2，相對分子質(zhì)量為190. 24，其結(jié)構(gòu)式如下
^ O。藁本內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)為不飽和的苯酞結(jié)構(gòu)，3位上有活潑的丁烯基，均為化學(xué)不穩(wěn)定性因素，容易發(fā)生多種異構(gòu)化反應(yīng)。目前，含有藁本內(nèi)酯的天然藥物制劑中藁本內(nèi)酯的含量測定方法主要有HPLC和GC方法，蔣偉，王長虹等人公開了一種利用HPLC對當歸提取物中藁本內(nèi)酯進行定量分析的方法(當歸提取物的制備工藝及其質(zhì)量控制，《華西藥學(xué)雜志》，2010，25 (I ):87 89)，采用C18色譜柱，以磷酸水溶液-乙腈二元系統(tǒng)為流動相進行梯度洗脫，流速I. OmL^mirT1，檢測波長350nm，以藁本內(nèi)酯純品作為對照，采用外標法測定樣品中的藁本內(nèi)酯含量。李桂生，馬成俊等人研究發(fā)現(xiàn)(藁本內(nèi)酯的穩(wěn)定性研究及異構(gòu)化產(chǎn)物的GC-MS分析，《中草藥》，2000，31 (6) :405 407)，藁本內(nèi)酯純品于室溫條件下保存可生成多種異構(gòu)化產(chǎn)物，其主要產(chǎn)物有8種，占異構(gòu)化產(chǎn)物的90. 81%。而藁本內(nèi)酯在揮發(fā)油中基本穩(wěn)定，不會出現(xiàn)純品狀態(tài)下的異構(gòu)化反應(yīng)。現(xiàn)有的藁本內(nèi)酯測定方法需要以藁本內(nèi)酯純品為對照品，由于藁本內(nèi)酯純品穩(wěn)定性極差，極易異構(gòu)化為其他結(jié)構(gòu)相近的苯酞類化合物，因此不能作為國家法定含量測定用對照品對藁本內(nèi)酯進行定量檢測，往往需要自行提取、純化，并且難以長期保存，給測定工作帶來極大的不變，增加了檢測的難度和成本。目前缺少一種操作簡便、穩(wěn)定、成本低廉的藁本內(nèi)酯測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定性好、成本低廉的藁本內(nèi)酯的測定方法，能夠簡便、準確地測定天然藥物制劑中藁本內(nèi)酯的含量。為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明人所采用的技術(shù)方案為
天然藥物制劑中藁本內(nèi)酯的測定方法，其包括以下步驟
(a)稱取含有藁本內(nèi)酯的天然藥物制劑內(nèi)容物，加入到含有堿金屬氫氧化物的乙腈水溶液中，搖勻后于2(T30°C下放置f 3天，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，加入乙腈水溶液定容，搖勻后過濾，續(xù)濾液為供試品溶液；
(b)稱取2-(I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸，加甲醇配制成對照品溶液，所述對照品溶液中2- (I-戊酮)-I，5-環(huán)已二烯甲酸的含量為O. 05 O. 4mg/mL ；
(c)采用高效液相色譜法分別測定對照品溶液和供試品溶液，色譜條件為采用以十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱，以乙腈或甲醇水溶液作為流動相，流動相的流速為O. 5 2mL/min，檢測波長為285nm，柱溫為2(T40°C，以外標法計算供試品溶液中2- (I-戊酮)-I,5-環(huán)已二烯甲酸的含量，按照藁本內(nèi)酯與2- (I-戊酮)-1，5-環(huán)已二烯甲酸的摩爾比I: I的比例，換算得到藁本內(nèi)酯的含量。本發(fā)明所述堿金屬氫氧化物最好為氫氧化鈉或氫氧化鉀，如此水解反應(yīng)更加迅速和充分。C步驟所述乙腈/水溶液其體積比為2(T45 :80-55 ；甲醇/水溶液的體積比為40^65:60^35 ;所述乙腈水溶液或甲醇水溶液的pH值控制在2 7 ;調(diào)節(jié)pH值時，可選用醋酸或磷酸進行調(diào)節(jié)。優(yōu)選乙腈/水的體積比為35 65 ；甲醇/水的體積比為55 :45。優(yōu)選上述條件時檢測時，色譜峰形好，2- (I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸與雜質(zhì)峰分尚度聞。b步驟所述2- (I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸的制備方法為
取當歸油，加入80倍體積比濃度為25%的乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中含有質(zhì)量體積比為2 — 3%的氫氧化鉀，2(T30°C下放置f 3天，加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至中性，加入等體積的二氯甲烷提取，提取液減壓濃縮，濃縮液上硅膠柱，依次以體積比濃度為10%、20%、30%丙酮/石油醚混合液進行梯度洗脫，分別收集不同的流份，進行檢測，檢測條件如下
逐一吸取各流份與二氯甲烷提取液，分別點于同一硅膠GF254板上，以體積比為7 :1. 5的石油醚/丙酮混合液為展開劑展開，取出，晾干，置254nm紫外燈下檢視，二氯甲烷提取液色譜中，比移值在O. 38之間斑點最大的物質(zhì)即為2-(1-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸，收集與此斑點比移值相同的流份，減壓濃縮后，用氮氣流吹干有機溶劑即得油狀的2- (I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸。2- (I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下
O
卜.:..' i:'. , OH。
Ii
O采用Bruker ARX-300核磁共振譜圖測定產(chǎn)物2_戊酰基_1，5_環(huán)己二烯_1_羧酸，質(zhì)譜采用Agilent 1100LC/MSD測定，紅外光譜采用CN61M/H630測定；
MS :231.20[M+Na], 247.08[M+K].
1H-NMR: (CDCl3, 300 MHz) : 6. 14 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 5. 96 (m, 1H)，2. 60 (m,1H), 2.46 (m, 2H)，2. 39 (m, 1H), 2. Ol (m, 1H), 1.81 (m, 1H), I. 33 (m, 2H), I. 20(m, 1H), 0.89 (m, 3H).
13C-NMR: (CDCl3, 300 MHz) : 169.3，158.7，130.1，126.0，116.3，107.4，35.9,
25.I, 22. 5, 19. 3, 13. 8.
IR: 3366， 3050， 2957， 1739， 1668， 1436， 1280， 893， 699.
本發(fā)明所述的天然藥物制劑為含有藁本內(nèi)酯的天然藥物制劑，如川芎粉或當歸油。本發(fā)明的藁本內(nèi)酯測定方法穩(wěn)定性好、成本低廉，能夠簡便、準確地測定天然藥物制劑中藁本內(nèi)酯的含量。發(fā)明人通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，將2- (I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸、藁本內(nèi)酯分別置于4°C下保存，結(jié)果30天內(nèi)，2- (I-戊酮)_1，5-環(huán)已二烯甲酸純度無明顯變化，而藁本內(nèi) 酯的純度已降到了 70%以下。由此可見，2-(1-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸相對藁本內(nèi)酯而言，其穩(wěn)定性要強得多。由于藁本內(nèi)酯自然降解過程中，很少會產(chǎn)生2- (I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸，因此，在測定天然藥物(例如當歸、川芎)的原料、中間體及制劑中藁本內(nèi)酯的含量時，選擇2- (I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸作對照品比選擇藁本內(nèi)酯操作更方便，穩(wěn)定性更好。


圖I是對照品2- (I-戊酮)_1，5-環(huán)已二烯甲酸的紅外光譜 圖2是對照品2- (I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸的氫譜圖，
圖3是對照品2- (I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸的碳譜圖。
具體實施例方式下面用具體實施例來進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但并不以任何方式意味著對本發(fā)明進行限制。本實施例中使用的當歸油及當歸油軟膠囊均來自神威藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，其制備工藝依專利CN00103336. O所述，當歸油中的藁本內(nèi)酯
含量在50%左右，當歸油軟膠囊中藁本內(nèi)酯含量在5%左右。實施例I 2- (I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸對照品的制備 (O制備含有堿金屬氫氧化物的乙腈水溶液
按照乙腈/水的體積比為25 :75計，配制成乙腈濃度為25%的乙腈水溶液；在每IOOml:乙腈水溶液中，加入2g氫氧化鉀。(2)取當歸油5g，加入80倍體積的上述含有堿金屬氫氧化物的乙腈水溶液。30°C下放置3天，加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至中性，加入等體積的二氯甲烷提取，提取液減壓濃縮，濃縮液上硅膠柱，分別以丙酮體積分數(shù)為10%、20%、30%的丙酮石油醚混合物進行梯度洗脫(所述石油醚的沸程為3(T60°C)，分別收集不同的流份，進行檢測，檢測條件如下
逐一吸取不同的流份與二氯甲烷提取液，分別點于同一硅膠GF254板上，以體積比為7:1.5的石油醚/丙酮混合物為展開劑展開，所述石油醚的沸程為3(T60°C，取出，晾干，置254nm紫外燈下檢視，二氯甲烷提取液色譜中，比移值在O. 3 O. 8之間斑點最大的物質(zhì)即為2- (I-戊酮)-I，5-環(huán)已二烯甲酸，收集與此斑點比移值相同的流份，減壓濃縮后，用氮氣流吹干有機溶劑即得油狀的2- (I-戊酮)-I，5-環(huán)已二烯甲酸I. 2g。2-(I-戊酮)-l，5-環(huán)已二烯甲酸的紅外光譜圖見圖1，氫譜圖見圖2，碳譜圖見圖3。[M+Na], 247. 08 [M+K] ·
1H-NMR: (CDCl3, 300 MHz) : 6. 14 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 5. 96 (m, 1H)，2. 60 (m,1H), 2.46 (m, 2H)，2. 39 (m, 1H)，2.01 (m, 1H)，1.81 (m, 1H)，I. 33 (m, 2H)，I. 20(m, 1H), 0.89 (m, 3H).
13C-NMR: (CDCl3, 300 MHz) : 169.3，158.7，130.1，126.0，116.3，107.4，35.9,
25.I, 22. 5, 19. 3, 13. 8. IR: 3366， 3050， 2957， 1739， 1668， 1436， 1280， 893， 699.
實施例2當歸油軟膠囊中藁本內(nèi)酯的含量測定 (O制備含有堿金屬氫氧化物的乙腈水溶液
按照乙腈/水的體積比為25 :75計，配制成乙腈濃度為25%的乙腈水溶液；在每IOOml:乙腈水溶液中，加入2g氫氧化鉀。( 2 )供試品溶液的制備
Ca)稱取當歸油軟膠囊內(nèi)容物O. 3g，加入到20mL上述含有氫氧化鉀的乙腈水溶液中，搖勻后于30°C下放置I天，加入2M的鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，加入體積比為40 60的乙腈/水溶液定容于50ml量瓶，濾過，濾液即為供試品溶液。(b)對照品溶液的制備
稱取實施例I所制備的2- (I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸，加乙腈配制成對照品溶液，所述對照品溶液中2- (I-戊酮)-1，5-環(huán)已二烯甲酸的含量為O. 3835mg/mL。(C)液相色譜條件
采用高效液相色譜法分別測定對照品溶液和供試品溶液，色譜條件為采用以十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱，以體積比為55:45的甲醇/水混合液為流動相，用醋酸溶液調(diào)混合液Ph值至3. 5，流動相的流速為I mL/min，檢測波長為285nm，柱溫為30°C。(d)測定法
分別吸取對照品與供試品溶液各10μ 1，注入液相色譜儀中，以外標法計算供試品溶液中2- (I-戊酮)-1，5-環(huán)已二烯甲酸的含量，按照藁本內(nèi)酯與2- (I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸的摩爾比1:1的比例，換算得到藁本內(nèi)酯的含量。(e)方法學(xué)考察
線性關(guān)系考察取2- (I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸，加50%乙腈配制成濃度為
O.4794mg/ml的溶液，分別吸取1、2、4、5、10、20 μ 1，注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積，以對照品進樣量(X μ g)為橫坐標對峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線，得2- (I-戊酮)-1，5-環(huán)已二烯甲酸線性回歸方程y = 9·754χ + O. 1604，R=O. 9999。精密度試驗取供試品溶液,重復(fù)進樣6次，每次進樣10 μ 1，按色譜條件測定，2-(1-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸峰面積平均值的RSD值為O. 66%，表明儀器的精密度良好。穩(wěn)定性試驗按上述制備供試品溶液一份，于配制后0、1、2、4、6、8小時進樣，測定，記錄峰面積，計算。結(jié)果2-(1-戊酮)-1，5-環(huán)已二烯甲酸的RSD值為I. 28%，表明供試品溶液在8小時內(nèi)穩(wěn)定。
重復(fù)性試驗取當歸油軟膠囊內(nèi)容物約O. 3g，精密稱定，共五份，依法制備供試品溶液，測定，以2- (I-戊酮)-I，5-環(huán)已二烯甲酸峰面積平均值計算含量，結(jié)果含量的RSD值為O. 83%,表明該方法重復(fù)性較好。加樣回收試驗取當歸油軟膠囊內(nèi)容物6份，每約O. 15g，精密稱定，置50ml量瓶中，分別加入含I. 034mg/ml的2- (I-戊酮)-I，5-環(huán)已二烯甲酸的25%乙腈溶液12、12、
10、10、8、8ml，補加25%乙腈至20ml，各加入O. 5g氫氧化鉀，室溫放置水解I天，加入2M鹽酸調(diào)節(jié)PH值至中性，加入40%乙腈至刻度，搖勻過濾即得供試品溶液。按照本發(fā)明所述方法測定，計算含量。結(jié)果2-(1-戊酮)-1，5-環(huán)已二烯甲酸的平均回收率為99.77%，1 0為
I.77%。 (f)測定結(jié)果
當歸油軟膠囊含藁本內(nèi)酯以2- (I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸計，測得結(jié)果為5.23%。
權(quán)利要求
1.天然藥物制劑中藁本內(nèi)酯的測定方法，其特征在于如下步驟 (a)稱取含有藁本內(nèi)酯的天然藥物制劑內(nèi)容物，加入到含有堿金屬氫氧化物的乙腈/水溶液中，搖勻后于2(T30°C下放置f 3天，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，加入乙腈水溶液定容，搖勻后過濾，續(xù)濾液為供試品溶液； (b)稱取2-(I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸，加乙腈或甲醇配制成對照品溶液，所述對照品溶液中2- (I-戊酮)-1，5-環(huán)已二烯甲酸的含量為O. 05 0. 4mg/mL ； (c)采用高效液相色譜法分別測定對照品溶液和供試品溶液，色譜條件為采用以十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱，以乙腈或甲醇水溶液作為流動相，流動相的流速為O. 5 2mL/min，檢測波長為285nm，柱溫為2(T40°C，以外標法計算供試品溶液中2- (I-戊酮)-I,5-環(huán)已二烯甲酸的含量，按照藁本內(nèi)酯與2- (I-戊酮)-1，5-環(huán)已二烯甲酸的摩爾比I: I的比例，換算得到藁本內(nèi)酯的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的天然藥物制劑中藁本內(nèi)酯的測定方法，其特征在于所述堿金屬氫氧化物為氫氧化鈉或氫氧化鉀。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的天然藥物制劑中藁本內(nèi)酯的測定方法，其特征在于所述乙腈/水溶液中含有質(zhì)量體積比為2—3%的氫氧化鉀。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的天然藥物制劑中藁本內(nèi)酯的測定方法，其特征在于c步驟所述乙腈/水溶液其體積比為20 45 80—55 ；甲醇/水溶液的體積比為40 65:60 35 ；所述乙腈水溶液或甲醇水溶液的PH值控制在2 。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的天然藥物制劑中藁本內(nèi)酯的測定方法，其特征在于所述乙腈/水的體積比為35 65 ；甲醇/水的體積比為55 :45。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的天然藥物制劑中藁本內(nèi)酯的測定方法，其特征在于b步驟所述2- (I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸的制備方法為 取當歸油，加入80倍體積比濃度為25%的乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中含有質(zhì)量體積比為2—3%的氫氧化鉀，2(T30°C下放置廣3天，加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至中性，加入等體積的二氯甲烷提取，提取液減壓濃縮，濃縮液上硅膠柱，依次以體積比濃度為10%、20%、30%丙酮/石油醚混合液進行梯度洗脫，分別收集不同的流份，進行檢測，檢測條件如下 逐一吸取各流份與二氯甲烷提取液，分別點于同一硅膠GF254板上，以體積比為7 :1. 5的石油醚/丙酮混合液為展開劑展開，取出，晾干，置254nm紫外燈下檢視，二氯甲烷提取液色譜中，比移值在O. 3 O. 8之間斑點最大的物質(zhì)即為2-(1-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸，收集與此斑點比移值相同的流份，減壓濃縮后，用氮氣流吹干有機溶劑即得油狀的2- (I-戊酮)-1，5_環(huán)已二烯甲酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的天然藥物制劑中藁本內(nèi)酯的測定方法，其特征在于所述的天然藥物制劑為當歸油。
全文摘要
天然藥物制劑中藁本內(nèi)酯的測定方法，以藁本內(nèi)酯的水解產(chǎn)物2-(1-戊酮)-1，5-環(huán)已二烯甲酸為對照品，測定天然藥物制劑中藁本內(nèi)酯的含量，使藁本內(nèi)酯制劑在含有堿金屬氫氧化物的乙腈水溶液中充分水解，再利用高效液相色譜，測定樣品中的2-(1-戊酮)-1，5-環(huán)已二烯甲酸含量，再按照摩爾比1:1的比例換算成藁本內(nèi)酯的含量。本發(fā)明的方法穩(wěn)定性好、成本低廉，能夠簡便、準確地測定天然藥物制劑中藁本內(nèi)酯的含量。
文檔編號G01N30/02GK102809619SQ201210304749
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月25日
發(fā)明者陳浩達, 劉軍鋒, 楊學(xué)林, 黃從海, 高鈞, 張綱, 張狀年, 姜海 申請人:神威藥業(yè)集團有限公司