專利名稱：一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1e蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法。
背景技術(shù)：
雞艾美耳球蟲是嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。雞球蟲在體內(nèi)繁殖過程中可導(dǎo)致上皮細胞發(fā)生損傷和炎癥反應(yīng)，廣泛損傷可引起雞發(fā)生腹瀉，脫水，體重喪失，直腸脫垂，痢疾等嚴重臨床疾病，有時可致雞死亡。全世界每年因球蟲病而造成的經(jīng)濟損失約為30億美元，其中80%是由于雞增重下降、飼料轉(zhuǎn)化率降低及死亡等直接原因，20%是由于化學(xué)藥物研究的費用。已經(jīng)證實頻繁使用化學(xué)藥物可導(dǎo)致耐藥性蟲株的出現(xiàn)，藥物殘留可帶來動物源性食品安全等問題。新型抗球蟲藥物研發(fā)的高額費用使制藥企業(yè)對開發(fā)新的抗球蟲藥物不感興趣。因此球蟲病的預(yù)防與控制已經(jīng)成為丞待解決的重要課題。從研究趨勢 看，蟲苗預(yù)防必將會逐漸發(fā)展為防治雞球蟲病的主要手段。乳酸菌是人和動物腸道內(nèi)常見益生菌，被公認為安全級(GRAS)微生物。乳酸菌作為表達外源蛋白的理想菌株安全、無毒，免疫途徑簡單。乳酸菌作為表達載體區(qū)別于其它未被歸于安全范圍內(nèi)的活疫苗載體(如減毒沙門氏菌，大腸桿菌和痘病毒等)。乳酸菌載體本身不會引起強烈免疫應(yīng)答，可以利用此載體對動物進行多次口服免疫。3-1E基因為雞艾美耳球蟲子孢子與裂殖子階段的表面抗原，蛋白分子量為18-27ku，序列全長1086bp，3-1E蛋白由170個氨基酸組成，在柔嫩艾美耳球蟲(E. tenella)、堆型艾美耳球蟲(E. acervulina)和毒害艾美耳球蟲(E. necatrix)之間均有很高同源性，可以作為基因工程疫苗的候選基因。但目前國內(nèi)外尚無在乳酸乳球菌中表達雞艾美耳球蟲子孢子/裂殖子階段表面抗原3-1E的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決目前乳酸乳球菌中無法表達雞艾美耳球蟲子孢子/裂殖子階段表面抗原3-1E的問題，提供一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法。本發(fā)明在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，按以下步驟進行—、將雞堆型艾美耳球蟲3-1E基因序列依照乳酸乳球菌的密碼子偏好性進行優(yōu)化，得到人工合成的3-1E基因，并在其5'端和3'端分別引入BamH I和Xba I的識別序列，之后與克隆載體PUC57連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，篩選陽性轉(zhuǎn)化子PUC57-3-1E ；二、將pUC57-3-lE和大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達載體ρΤΧ8048分別經(jīng)BamH 2和Xba2雙酶切后，分別回收3-1E片段和載體片段，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后構(gòu)建重組表達載體PTX8048-3-1E ；三、將ρΤΧ8048-3-1Ε經(jīng)電轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌NZ9000的感受態(tài)細胞中，經(jīng)篩選得到含有重組質(zhì)粒的陽性重組乳酸乳球菌ΝΖ9000/ρΤΧ8048-3-1Ε，從陽性重組乳酸乳球菌中用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，之后針對步驟一中人工合成的3-1E基因序列設(shè)計引物，分別進行PCR鑒定，酶切鑒定以及序列測定；四、將NZ9000/PTX8048-3-1E接種于含氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基中，經(jīng)30°C厭氧培養(yǎng)過夜后，以I : 50的體積比轉(zhuǎn)接入含氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)，300C厭氧培養(yǎng)至0D_為O. 4 O. 6，之后用10ng/ml的乳鏈菌肽繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3h，即完成了在乳酸乳球菌NZ9000中表達3-1E蛋白。雞艾美耳球蟲子孢子通過腸黏膜上皮細胞侵入機體內(nèi)，子孢子表面的一系列分泌抗原可以刺激感染雞產(chǎn)生免疫應(yīng)答?？梢员磉_外源蛋白的乳酸菌所激發(fā)的免疫應(yīng)答與球蟲的侵入途徑相似，可以激發(fā)動物體產(chǎn)生有效的腸道保護性免疫應(yīng)答。本發(fā)明在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白，解決了應(yīng)用其他一系列的乳酸菌表達載體均未能表達3-1E蛋白的問題。這將對今后研制基于雞源腸道共生乳 酸菌為宿主菌的乳酸菌口服疫苗研究奠定堅實的基礎(chǔ)。本發(fā)明將密碼子優(yōu)化后的經(jīng)人工合成的3-1E蛋白成功的在乳酸乳球菌NZ9000中進行了表達。


圖I為實施例的步驟三中PCR鑒定結(jié)果圖；圖2為實施例的步驟三中酶切鑒定結(jié)果圖；圖3為實施例中提取菌體總蛋白進行Western blot分析結(jié)果圖。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，按以下步驟進行一、將雞堆型艾美耳球蟲3-1E基因序列依照乳酸乳球菌的密碼子偏好性進行優(yōu)化，得到人工合成的3-1E基因，并在其5'端和3'端分別引入BamH 2和Xba 2的識別序列，之后與克隆載體PUC57連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，篩選陽性轉(zhuǎn)化子PUC57-3-1E ；二、將PUC57-3-1E和大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達載體ρΤΧ8048分別經(jīng)BamH 3和Xba3雙酶切后，分別回收3-1E片段和載體片段，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后構(gòu)建重組表達載體PTX8048-3-1E ；三、將ρΤΧ8048-3-1Ε經(jīng)電轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌NZ9000的感受態(tài)細胞中，經(jīng)篩選得到含有重組質(zhì)粒的陽性重組乳酸乳球菌ΝΖ9000/ρΤΧ8048-3-1Ε，從陽性重組乳酸乳球菌中用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，之后針對步驟一中人工合成的3-1E基因序列設(shè)計引物，分別進行PCR鑒定，酶切鑒定以及序列測定；四、將ΝΖ9000/ρΤΧ8048-3-1Ε接種于含氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基中，經(jīng)30°C厭氧培養(yǎng)過夜后，以I : 50的體積比轉(zhuǎn)接入含氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)，300C厭氧培養(yǎng)至0D_為O. 4 O. 6，之后用10ng/ml的乳鏈菌肽繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3h，即完成了在乳酸乳球菌NZ9000中表達3-1E蛋白。
步驟一中克隆載體pUC57購買自南京金斯瑞生物科技有限公司。步驟二中大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達載體PTX8048已在《Microbial CellFactories,2011,10 66doi 10.1186/1475-2859-10-66, Expanding the moleculartoolbox for Lactococcus lactis -construction of an inducible thioredoxingene fusion expression system》即《微生物細胞工廠，2011,10 :66 doi 10. 1186/1475-2859-10-66，乳酸乳球菌分子工具盒的擴展-可誘導(dǎo)的含硫氧還蛋白基因的融合表達系統(tǒng)》中公開，由愛爾蘭考克大學(xué)van Sinderen D.教授饋贈。該載體的特點是引入了組氨酸標簽(6XHis)和硫氧還蛋白A(TrxA)，利于異源蛋白的融合表達。步驟三中乳酸乳球菌NZ9000購買自荷蘭NIZO研究所，其感受態(tài)細胞按照《ApplEnviron Microbiol, 1989 (55) :3119_3123》中的乳酸菌感受態(tài)制備方法制得。
具體實施方式
二 本實施方式是對具體實施方式
一所述的在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法步驟二中PUC57-3-1E雙酶切做進一步的說明，步驟二中 PUC57-3-1E雙酶切的體系如下
權(quán)利要求
1.一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，其特征在于在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，按以下步驟進行 一、將雞堆型艾美耳球蟲3-1E基因序列依照乳酸乳球菌的密碼子偏好性進行優(yōu)化，得到人工合成的3-1E基因，并在其5'端和3'端分別引入BamH I和Xba I的識別序列，之后與克隆載體PUC57連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，篩選陽性轉(zhuǎn)化子pUC57_3_lE ； 二、將pUC57-3-lE和大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達載體PTX8048分別經(jīng)BamHI和XbaI雙酶切后，分別回收3-1E片段和載體片段，經(jīng)T4DNA連接酶連接后構(gòu)建重組表達載體PTX8048-3-1E ； 三、將ρΤΧ8048-3-1Ε經(jīng)電轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌NZ9000的感受態(tài)細胞中，經(jīng)篩選得到含有重組質(zhì)粒的陽性重組乳酸乳球菌ΝΖ9000/ρΤΧ8048-3-1Ε，從陽性重組乳酸乳球菌中用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，之后針對步驟一中人工合成的3-1E基因序列設(shè)計引物，分別進行PCR鑒定，酶切鑒定以及序列測定； 四、將ΝΖ9000/ρΤΧ8048-3-1Ε接種于含氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基中，經(jīng)30°C厭氧培養(yǎng)過夜后，以I : 50的體積比轉(zhuǎn)接入含氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)，30°C厭氧培養(yǎng)至OD6tltl為O. 4 O. 6，之后用10ng/ml的乳鏈菌肽繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3h，即完成了在乳酸乳球菌NZ9000中表達3-1E蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，其特征在于步驟二中PUC57-3-1E雙酶切的體系如下成分川.M:PUC57-3-1E14pLIOxII Buffer4pLBamM I2μΕ Xba IddH20WpL 酶切反應(yīng)條件為37 V反應(yīng)3h。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，其特征在于步驟二中表達載體PTX8048雙酶切的體系如下 成分表達載體PTX804814pL Κ.) N ,ιΠα4μΙBamH 22μΙ_ Xha 22pLddH20ISpL 酶切反應(yīng)條件為37 V反應(yīng)3h。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，其特征在于步驟二中的連接體系如下
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，其特征在于步驟三中PCR鑒定的反應(yīng)體系如下
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，其特征在于步驟四中含氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基為含5 μ g/mL氯霉素和質(zhì)量濃度.O.5%葡萄糖的M17肉湯培養(yǎng)基。
全文摘要
一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，涉及一種表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法。本發(fā)明是要解決目前乳酸乳球菌中無法表達雞艾美耳球蟲子孢子/裂殖子階段表面抗原3-1E的問題。方法將雞堆型艾美耳球蟲3-1E基因序列依照乳酸乳球菌的密碼子偏好性進行優(yōu)化，插入克隆載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，得陽性轉(zhuǎn)化子；將陽性轉(zhuǎn)化子和乳酸菌表達載體酶切后連接，構(gòu)建重組表達載體；轉(zhuǎn)化乳酸菌感受態(tài)細胞，鑒定；進行重組菌培養(yǎng)及誘導(dǎo)，即完成在乳酸乳球菌NZ9000中表達3-1E蛋白。本發(fā)明將密碼子優(yōu)化后的經(jīng)人工合成的3-1E蛋白成功的在乳酸乳球菌中進行了表達。本發(fā)明方法用于球蟲病的預(yù)防領(lǐng)域。
文檔編號C12N15/74GK102816788SQ20121030258
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者馬德星, 馬春麗, 馮興軍, 高銘揚, 葛俊偉, 李廣興, 李一經(jīng) 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)