專利名稱：單核苷多態(tài)性rs3888188在檢測結(jié)核病易感性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單核苷多態(tài)性rs3888188在檢測結(jié)核病易感性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是當(dāng)今全球關(guān)注的三大傳染病之一,嚴(yán)重威脅著民眾的健康。我國結(jié)核病患者數(shù)量居世界第二位，開展結(jié)核病的遺傳易感研究對消除結(jié)核病、降低死亡率、保障人民健康以及推動首都經(jīng)濟(jì)、衛(wèi)生事業(yè)健康持續(xù)發(fā)展有重要科學(xué)價值和社會效益。結(jié)核病主要的致病菌為結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis, MTB),而結(jié)核病的發(fā)病是一個多因素綜合作用的結(jié)果。結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展和臨床結(jié)局，不僅受環(huán)境和MTB毒力的控制，而且受到宿主遺傳免疫的影響。研究顯示感染了 MTB的個體中僅有10%最 終進(jìn)展為結(jié)核病，這提示宿主遺傳差異在結(jié)核病的發(fā)病中起主導(dǎo)作用。在以病例-對照研究為基礎(chǔ)的基因相關(guān)性分析和全基因組關(guān)聯(lián)分析，都已取得了令人信服的證據(jù)，即個體對結(jié)核病易感的差異性部分是由宿主基因決定的。目前，尚沒有研究證明干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白3(IFITM3)及其基因IFITM3與結(jié)核病易感關(guān)聯(lián)。由于基因的啟動子序列能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控因子，因而其對基因自身的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)至關(guān)重要。啟動子區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性(SNP)可能通過改變啟動子與轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控因子的結(jié)合能力影響著基因的轉(zhuǎn)錄活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供單核苷多態(tài)性rs3888188在結(jié)核病方面的新用途。所述新用途為檢測人基因組中rs3888188多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備如下I) -4)中任一所述產(chǎn)品中的應(yīng)用I)檢測與結(jié)核病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品；2)檢測結(jié)核病易感性或患有結(jié)核病風(fēng)險的廣品；3)鑒定或輔助鑒定結(jié)核病易感基因的產(chǎn)品；4)篩查結(jié)核病患者的產(chǎn)品。本發(fā)明保護(hù)含有用于檢測人基因組中rs3888188多態(tài)性或基因型的物質(zhì)的上述O-4)中的任一所述產(chǎn)品。所述用于檢測人基因組中rs3888188多態(tài)性或基因型的物質(zhì)含有擴(kuò)增包括rs3888188在內(nèi)的人基因組DNA片段的PCR引物對。所述PCR引物對具體可由序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成。本發(fā)明保護(hù)檢測人基因組中rs3888188、rs7478728和rs6598045多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備上述I) -4)中任一所述產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種檢測結(jié)核病易感性或患有結(jié)核病風(fēng)險的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品為一比對卡，所述比對卡上設(shè)置如下序列人IFITM3基因啟動子區(qū)域中包括rs3888188、rs6598045 和 rs7478728 的任意一段 DNA 序列，所述 DNA 序列中 rs3888188、rs6598045和rs7478728的堿基分別為G、T和T，或分別為C、A和A。若待測個體的在rs3888188、rs6598045和rs7478728三個位點(diǎn)的堿基與比對卡的相同或互補(bǔ)，則判定該待測個體結(jié)核病易感性或患有結(jié)核病風(fēng)險增高。本發(fā)明保護(hù)所述比對卡在制備篩查結(jié)核病產(chǎn)品中的應(yīng)用。在本發(fā)明的實施例中，所述結(jié)核病具體為中國北方漢族兒童結(jié)核病。所述rs3888188為refSNP ID，是人IFITM3基因(位于染色體11ρ15. 5)核心啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游103bp處或翻譯起始位點(diǎn)ATG上游204bp處的T/G 二等位多態(tài)性的SNP位點(diǎn)。所述rs3888188的基因型是GG、GT或TT。所述GG是rs3888188位點(diǎn)為G的純合型，所述TT是rs3888188位點(diǎn)為T的純合型，所述GT是rs3888188位點(diǎn)為T和G的雜合型。所述檢測人基因組中rs3888188的多態(tài)性或基因型具體可為檢測rs3888188的核苷酸種類。
所述rs6598045為refSNP ID，是人IFITM3基因(位于染色體11ρ15. 5)核心啟動子區(qū)域翻譯起始位點(diǎn)ATG上游188bp處的C/T 二等位多態(tài)性的SNP位點(diǎn)。所述rs7478728為refSNP ID，是人IFITM3基因(位于染色體11ρ15. 5)核心啟動子區(qū)域翻譯起始位點(diǎn)ATG上游181bp處的C/T 二等位多態(tài)性的SNP位點(diǎn)。實驗證明，rs3888188 (_204T/G)SNP位點(diǎn)的G等位基因在中國北方漢族兒童結(jié)核病患兒中所占比例顯著高于正常對照(66. 2%vs. 60. 5%, P=O. 007)，即rs3888188G為結(jié)核病易感的風(fēng)險因素，rs3888188的多態(tài)性與結(jié)核病具有很高的相關(guān)性。因此，通過檢測該位點(diǎn)的核苷酸種類、判斷該位點(diǎn)的基因型可用于檢測結(jié)核病的易感性或患有結(jié)核病風(fēng)險，如檢測得到的rs3888188基因型為GG的個體與TT個體相比，更容易患有結(jié)核病或患有結(jié)核病的風(fēng)險聞。實驗證明，不同rs3888188基因型(GG、GT、TT)的正常人外周淋巴細(xì)胞經(jīng)IFN-Y誘導(dǎo)后，GG個體的IFITM3基因mRNA表達(dá)水平最低，未受干擾素IFN- Y誘導(dǎo)而明顯增高，說明IFITM3基因表達(dá)量不足為結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險因素，即IFITM3基因為結(jié)核病易感基因。因此，通過檢測該位點(diǎn)的核苷酸種類，判斷該位點(diǎn)的基因型，可用于鑒定或輔助鑒定與該位點(diǎn)相關(guān)的基因是否為結(jié)核病易感基因。實驗證明，rs3888188的G等位基因在結(jié)核病患兒中所占比例顯著增加(66. 2%vs. 60. 5%, P=O. 007)。因此，在實際應(yīng)用中，可將檢測該位點(diǎn)多態(tài)性的物質(zhì)與其它物質(zhì)(如檢測其它的與結(jié)核病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì))聯(lián)合在一起制備篩查結(jié)核病患者的廣品。其中，檢測人基因組中rs3888188的多態(tài)性的物質(zhì)可為通過下述至少一種方法確定rs3888188的多態(tài)性所需的試劑和/或儀器DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性高效液相色譜和SNP芯片。所述產(chǎn)品可為試劑或試劑盒，還可為試劑或試劑盒和儀器的組合產(chǎn)品，如由引物和DNA測序儀組成的組合產(chǎn)品，由PCR試劑和DNA測序試劑和DNA測序儀組成的組合產(chǎn)品。本發(fā)明實施例采用PCR引物擴(kuò)增包括rs3888188在內(nèi)的基因組DNA片段，對得到的346bp的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列檢測，確定rs3888188的多態(tài)性和基因型。所述PCR引物在序列上沒有特殊要求，只要能擴(kuò)增出包括rs3888188在內(nèi)的基因組DNA片段即可，具體可為序列表序列I和序列2所示的單鏈DNA。本發(fā)明所提供的應(yīng)用和產(chǎn)品在診斷并治療結(jié)核病，從而在合理預(yù)防結(jié)核病方面具有重要意義和價值。


圖I為三種單體型啟動子對螢光素酶活性的影響。圖2為IFN-Y誘導(dǎo)下rs3888188基因型不同的外周淋巴細(xì)胞中IFIT M3基因mRNA表達(dá)水平。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、rs3888188的單核苷酸多態(tài)性與結(jié)核病相關(guān)(病例-對照分析)對來自中國北方漢族兒童的951例正常對照(即正常對照組)和368例結(jié)核病(SP結(jié)核病例組)DNA樣本的IFITM3基因核心啟動子序列(如序列表序列3所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物在I. 5%的瓊脂糖凝膠上電泳分離，回收并純化346bp的條帶進(jìn)行測序。使用在線Shesis 軟件(http://analysis. bio_x. cn/SHEsisMain. htm)對測序所見SNP位點(diǎn)進(jìn)行等位基因頻率和基因型頻率的統(tǒng)計、針對等位基因和基因型分別進(jìn)行結(jié)核病例組和正常對照組的卡方檢測和odds ratio (優(yōu)勢比)的計算、位點(diǎn)間連鎖分析、單倍體分析等遺傳學(xué)統(tǒng)計分析，共獲得2個與結(jié)核病顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)rs3888188和rs7478728，及I個與結(jié)核病不相關(guān)的SNP位點(diǎn)rs6598045，對這三個SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型的結(jié)果如表I所示。其中，rs3888188 (-204T/G) SNP位點(diǎn)的G等位基因以及rs7478728(-181C/T)的T等位基因在結(jié)核病患兒中所占比例顯著增加(66. 2%vs. 60. 5%, P=O. 007 ；82. 6%vs. 77. 9%, P=O. 008)，即rs3888188G和rs7478728T為兒童結(jié)核病易感的風(fēng)險因素。由上述三個SNP構(gòu)成的單倍體分析顯示(表2)，人群中存在三個主要的單體型(>10%)，分別為GTT、TTC和TCT，其中，GTT單體型在結(jié)核病人中顯著增加(63. 6%vs. 56. 6%，P=O. 002，OR=L 32)，而 TTC 單體型在對照組中顯著增加(21. 8%vs. 17. 0%, P=O. 005，OR=O. 73)。表I.基因分型結(jié)果
權(quán)利要求
1.檢測人基因組中rs3888188多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備如下1)_4)中任一所述產(chǎn)品中的應(yīng)用 1)檢測與結(jié)核病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品； 2)檢測結(jié)核病易感性或患有結(jié)核病風(fēng)險的產(chǎn)品； 3)鑒定或輔助鑒定結(jié)核病易感基因的產(chǎn)品； 4)篩查結(jié)核病患者的產(chǎn)品。
2.一種檢測與結(jié)核病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品，其特征在于所述產(chǎn)品中含有用于檢測人基因組中rs3888188多態(tài)性或基因型的物質(zhì)。
3.—種檢測結(jié)核病易感性或患有結(jié)核病風(fēng)險的產(chǎn)品，其特征在于所述產(chǎn)品中含有用于檢測人基因組中rs3888188多態(tài)性或基因型的物質(zhì)。
4.一種鑒定或輔助鑒定結(jié)核病易感基因的產(chǎn)品，其特征在于所述產(chǎn)品中含有用于檢測人基因組中rs3888188多態(tài)性或基因型的物質(zhì)。
5.一種篩查結(jié)核病患者的產(chǎn)品，其特征在于所述產(chǎn)品中含有用于檢測人基因組中rs3888188多態(tài)性或基因型的物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的應(yīng)用或產(chǎn)品，其特征在于所述用于檢測人基因組中rs3888188多態(tài)性或基因型的物質(zhì)含有擴(kuò)增包括rs3888188在內(nèi)的人基因組DNA片段的PCR引物對。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用或產(chǎn)品，其特征在于所述PCR引物對由序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成。
8.檢測人基因組中rs3888188、rs6598045和rs7478728多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備權(quán)利要求I中所述的I) -4)中任一所述產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9.一種檢測結(jié)核病易感性或患有結(jié)核病風(fēng)險的產(chǎn)品，其特征在于所述產(chǎn)品為一比對卡，所述比對卡上設(shè)置如下序列人IFITM3基因啟動子區(qū)域中包括rs3888188、rs6598045和 rs7478728 的任意一段 DNA 序列，所述 DNA 序列中 rs3888188、rs6598045 和 rs7478728的堿基分別為G、T和T，或分別為C、A和A。
10.權(quán)利要求9所述產(chǎn)品在制備篩查結(jié)核病患者產(chǎn)品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了單核苷多態(tài)性rs3888188在檢測結(jié)核病易感性中的應(yīng)用。所述SNP為rs3888188，位于人IFITM3基因核心啟動子區(qū)域(即轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游103bp處/翻譯起始位點(diǎn)ATG上游204bp處)，rs3888188G為結(jié)核病易感的風(fēng)險因素，rs3888188的多態(tài)性與結(jié)核病具有很高的相關(guān)性。當(dāng)該位點(diǎn)的基因型為GG時，待測個體的結(jié)核病易感性或患有結(jié)核病的風(fēng)險增高。本發(fā)明在診斷并治療結(jié)核病，從而為合理預(yù)防結(jié)核病方面重要意義和價值。
文檔編號C12Q1/68GK102808030SQ20121029895
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者申阿東, 申晨, 吳喜蓉, 孫琳, 焦偉偉, 綦輝 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院