專利名稱：一種生產(chǎn)水解淀粉生成果葡糖漿的酶系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及構(gòu)建微生物工程菌生產(chǎn)重組酶。具體是應(yīng)用微生物工程菌生產(chǎn)水解淀粉為果葡糖漿的酶系。
背景技術(shù)：
果葡糖漿是一種新型甜味 劑。果葡糖漿的甜度最高，相當(dāng)于蔗糖I. 8倍，并且果葡糖漿具有類似蜜糖的風(fēng)味和不易引起血糖升高的性能。當(dāng)前，國內(nèi)外需求量大，主要應(yīng)用于食品領(lǐng)域的飲料、面包、奶制品、罐頭、果糖和其它食品。淀粉是制備果葡糖漿的主要是原料。用不甜的淀粉為原料轉(zhuǎn)變成具有甜味的葡萄糖，再通過異構(gòu)化反應(yīng)轉(zhuǎn)變葡萄糖生成果糖，生產(chǎn)果葡糖漿(果糖和葡萄糖的混合物)。淀粉由直鏈和支鏈組成。支鏈由a-1，6糖苷鍵連接，而直鏈的糖分子之間由a -1，4糖苷鍵連接。在天然的淀粉質(zhì)原料中，支鏈淀粉的含量約占70% 95%，而直鏈淀粉的含量< 30%。異淀粉酶(Isoamylase，E. C. 3. 2. I. 68)能專一性地分解支鏈淀粉中分支點(diǎn)的a-1，6糖苷鍵，將支鏈淀粉轉(zhuǎn)化為直鏈淀粉，因此又稱為脫支酶。葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase,E. C. 3. 2. I. 3)，簡稱糖化酶。葡萄糖淀粉酶能催化直鏈淀粉水解為葡萄糖。在異淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的聯(lián)合作用下，淀粉水解生成葡萄糖。木糖異構(gòu)酶具有異構(gòu)葡萄糖為果糖的功能。酶法生產(chǎn)果葡糖漿是果葡糖漿生產(chǎn)的主要途徑。當(dāng)前，酶法生產(chǎn)果葡糖漿的方法是先生產(chǎn)異淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，通過異淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的作用，將淀粉水解生成葡萄糖；然后，再用木糖異構(gòu)酶異構(gòu)葡萄糖為果糖，生產(chǎn)果糖與葡萄糖混合的果葡糖漿。這些酶的分別生產(chǎn)需要大量的人力和能耗。當(dāng)前市面上只有這些酶的單種酶，尚沒有混合表達(dá)這些酶的菌種和混合酶產(chǎn)品。畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)都是常用于生產(chǎn)重組蛋白的宿主菌，但各具有特征。畢赤酵母的主要特征是分泌極少自身蛋白有利于表達(dá)產(chǎn)物的純化的特點(diǎn)，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母具有兼性需氧的特性，適合于固態(tài)厭氧發(fā)酵生產(chǎn)重組酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)異淀粉酶和葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶具有聯(lián)合水解淀粉生成果葡糖漿的作用(即異淀粉酶和葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶是水解淀粉生成果葡糖漿的酶系)，市場上還沒有異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶的水解淀粉生成果葡糖漿的酶系產(chǎn)品；畢赤酵母、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌是常用于表達(dá)外源蛋白的宿主菌，而通過分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建含異淀粉酶基因表達(dá)框架(說明.表達(dá)框架啟動(dòng)子-信號(hào)肽-基因-轉(zhuǎn)錄終止子)、葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架和木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌。用含異淀粉酶基因表達(dá)框架、葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架和木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產(chǎn)水解淀粉為果葡糖漿的酶系(異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶)。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是I.克隆酶基因應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，從假單胞桿菌(pseudomonas)基因組中擴(kuò)增異淀粉酶基因，從曲霉(Aspergillus)基因組中擴(kuò)增葡萄糖淀粉酶基因，從棲熱菌(Thermus)基因組中擴(kuò)增木糖異構(gòu)酶基因。2.獲得構(gòu)建表達(dá)載體所需的啟動(dòng)子，重組序列，信號(hào)肽，轉(zhuǎn)錄終止子序列和抗性基因。3.構(gòu)建如附圖I的畢赤酵母表達(dá)載體、附圖2的釀酒酵母表達(dá)載體和附圖3的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體。4.應(yīng)用電轉(zhuǎn)化方法將含異淀粉酶基因表達(dá)框架、葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架、木 糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母；應(yīng)用電轉(zhuǎn)化方法將含異淀粉酶基因表達(dá)框架、葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架、木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母；應(yīng)用電轉(zhuǎn)化方法將含異淀粉酶基因表達(dá)框架、葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架、木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌。分別篩選高表達(dá)異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶的畢赤酵母重組子、釀酒酵母重組子和枯草芽孢桿菌重組子作為含異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌。5.分別發(fā)酵含異淀粉酶基因表達(dá)框架、葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架和木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產(chǎn)水解淀粉生成果葡糖漿的酶系(異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶)。本發(fā)明構(gòu)建含異淀粉酶基因表達(dá)框架、葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架和木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產(chǎn)異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)于(I)針對(duì)異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶具有協(xié)同水解淀粉生成果葡糖漿的特性，即異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶是水解淀粉生成葡萄糖的酶系，而市場上需求這種酶系產(chǎn)品。本發(fā)明通過構(gòu)建工程菌，應(yīng)用工程菌生產(chǎn)重組混合異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶，一方面提供混合異淀粉酶、a淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的新產(chǎn)品，另一方面取代分別發(fā)酵含異淀粉酶基因的菌株生產(chǎn)異淀粉酶，發(fā)酵含葡萄糖淀粉酶基因的菌株生產(chǎn)葡萄糖淀粉酶，發(fā)酵含木糖異構(gòu)酶基因的菌株生產(chǎn)木糖異構(gòu)酶。即用一個(gè)發(fā)酵工序生產(chǎn)整個(gè)水解淀粉生成果葡糖漿的酶系取代用多個(gè)工序分別生產(chǎn)水解淀粉生成果葡糖漿的三種酶。達(dá)到節(jié)省了原材料、能耗和人力資源的作用。(2)畢赤酵母、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)重組蛋白方面各具特征，本發(fā)明分別構(gòu)建含異淀粉酶基因表達(dá)框架、葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架和木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌，為其重組酶生產(chǎn)提供多種宿主選擇。


附圖I.含異淀粉酶基因表達(dá)框架、葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架和木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體
P.畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子；S. a因子信號(hào)肽；iso.假單胞桿菌的異淀粉酶基因；gai.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因；xi.棲熱菌的木糖異構(gòu)酶基因；T.轉(zhuǎn)錄終止子序列；G418.抗性基因(應(yīng)用于篩選畢赤酵母重組子)；ColEl.大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；AMP.氨節(jié)青霉素抗性基因(應(yīng)用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子)；P. pastoris rDNA.畢赤酵母的rDNA序列。附圖2.含異淀粉酶基因表達(dá)框架、葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架和木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母表達(dá)載體P.釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子；S. a因子信號(hào)肽；iso.假單胞桿菌的異淀粉酶基因；gai.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因；xi.棲熱菌的木糖異構(gòu)酶基因；T.轉(zhuǎn)錄終止子序列；G418.抗性基因(應(yīng)用于篩選釀酒酵母重組子)；ColEl.大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；AMP.氨節(jié)青霉素抗性基因(應(yīng)用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子)；S. cerevisiae rDNA.釀酒酵母的rDNA序列。附圖3.含異淀粉酶基因表達(dá)框架、葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架和木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體P.巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子；S. a因子信號(hào)肽；iso.假單胞桿菌的異淀粉酶基因；gai.曲霉的葡萄糖淀粉酶基因；xi.棲熱菌的木糖異構(gòu)酶基因；T.轉(zhuǎn)錄終止子序列；G418.抗性基因(應(yīng)用于篩選枯草芽孢桿菌重組子)；ColEl.大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；AMP.氨芐青霉素抗性基因(應(yīng)用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子)；B. subtilis rDNA.枯草芽孢桿菌的rDNA序列。
具體實(shí)施例方式下面用非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例I :I. I構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體I. I. I構(gòu)建克隆載體由專業(yè)的DNA序列合成公司合成含氨芐青霉素(AMP)基因序列、多克隆接頭和大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的兩條堿基互補(bǔ)的雙鏈，并且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過DNA連接酶的作用使其環(huán)化，形成DNA克隆載體。將其克隆載體命名為pPGI. I. 2猶取基因①PCR擴(kuò)增假單胞桿菌(Pseudomonas)的異淀粉酶基因引物I :5，CGGATATCGCCATCAACAGCATGAGC3，[說明引物5’端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基)]
弓I 物 2 : 5，C A GCGGCCGCC T A jATGATGATGATGATGATG
CTTGGAGATCAACAGCAGCAGCGATTG3’ [說明5’的10個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和酶識(shí)別位點(diǎn)(8個(gè)堿基)，方框中的18個(gè)堿基是編碼6個(gè)組氨酸的DNA序列。]應(yīng)用常規(guī)的細(xì)菌基因組DNA提取的方法提取假單胞桿菌的基因組DNA，以基因組DNA為模板，應(yīng)用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是假單胞桿菌的異淀粉酶基因序列。
②反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增曲霉(Aspergillus)的葡萄糖淀粉酶基因(包括信號(hào)肽)引物I:
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)水解淀粉生成果葡糖漿的酶系的方法，其特征在于，其具體步驟如下 1)、應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆假單胞桿菌的異淀粉酶基因、曲霉的葡萄糖淀粉酶基因和棲熱菌的木糖異構(gòu)酶基因； 2)、分別構(gòu)建含上述基因的表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體、釀酒酵母表達(dá)載體和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體； 3)、將上述構(gòu)建的畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母獲得畢赤酵母重組子，將上述構(gòu)建的釀酒酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母獲得釀酒酵母重組子，將上述構(gòu)建的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌獲得枯草芽孢桿菌重組子； 4)、篩選高表達(dá)以上所述的異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶的畢赤酵母重組子作為含假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架、曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架和棲熱菌的木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌，篩選高表達(dá)以上所述的異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶的釀酒酵母重組子作為含假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架、曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架和棲熱菌的木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程，篩選高表達(dá)以上所述的異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶的枯草芽孢桿菌重組子作為含假單胞桿菌的異淀粉酶基因表達(dá)框架、曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架和棲熱菌的木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌工程； 5)、分別發(fā)酵以上所述的畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產(chǎn)水解淀粉生成果葡糖漿的酶系(異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種生產(chǎn)水解淀粉生成果葡糖漿的酶系的方法，其特征在于利用權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)水解淀粉生成果葡糖漿的酶系的方法制備水解淀粉生成果葡糖漿的酶系(異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶)產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)水解淀粉生成果葡糖漿的酶系的方法。屬生物技術(shù)領(lǐng)域。首先分別克隆假單胞桿菌的異淀粉酶基因、曲霉的葡萄糖淀粉酶基因和棲熱菌木糖異構(gòu)酶基因；構(gòu)建含上述三種基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體、釀酒酵母將表達(dá)載體和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體，并將載體轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主菌而獲得工程菌。發(fā)酵畢赤酵母工程菌、釀酒酵母工程菌和枯草芽孢桿菌工程菌生產(chǎn)重組混合異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和木糖異構(gòu)酶(水解淀粉生成果葡糖漿的酶系)。本發(fā)明用一道工序同時(shí)生產(chǎn)水解淀粉生成果葡糖漿的酶系，解決分別生產(chǎn)這三種酶的成本高而制約酶法生產(chǎn)果葡糖漿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的問題，為市場提供上述酶系新產(chǎn)品，有利于加速酶法生產(chǎn)果葡糖漿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
文檔編號(hào)C12N9/34GK102747062SQ20121025183
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月9日
發(fā)明者尹慧祥, 張?zhí)碓? 張愛聯(lián), 符仙, 羅進(jìn)賢 申請(qǐng)人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所