專利名稱：一種鑒別大菱鲆卵子質(zhì)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)動物卵子質(zhì)量檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒別大菱鲆卵子質(zhì)量的方法。
背景技術(shù)：
大菱鲆(Scophthalmus maximus )是當(dāng)前歐洲的重要海水養(yǎng)殖魚類之一，自1992年大菱鲆被引進中國以來，在水產(chǎn)科研工作者和養(yǎng)殖企業(yè)的共同努力下，大菱鲆在工業(yè)化養(yǎng)殖領(lǐng)域取得了重大成效，最高年產(chǎn)量達5萬噸以上，年產(chǎn)值逾40億元，從而成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)一個新的經(jīng)濟增長點。在大菱鲆等硬骨魚類人工繁養(yǎng)殖過程中，卵子的質(zhì)量是影響繁殖性能的一個關(guān)鍵因素，它直接關(guān)系到胚胎的發(fā)育以及仔、稚、幼魚的成活和生長速率，因此，卵子質(zhì)量的好壞與養(yǎng)殖效率密切相關(guān)。此外，卵子質(zhì)量還可以反饋親魚培育、對指導(dǎo)苗種生產(chǎn)也具有重要意義；同時高質(zhì)量卵子也為深入研究海水硬骨魚類胚胎發(fā)育調(diào)控機制提供了有效的平臺和保障。目前對大菱鲆卵子質(zhì)量的評價通常是對其外觀形態(tài)及生產(chǎn)性狀檢測，如色澤、沉浮性、受精率、孵化率和仔魚畸形率等，對卵子和卵巢液的基礎(chǔ)生化組成等方面的研究相對較少。從外觀上對卵子進行檢測雖然速度快，但準(zhǔn)確率低；而通過受精率、孵化率和仔魚畸形率等生產(chǎn)性狀來評價卵子質(zhì)量，涉及到后期養(yǎng)殖，試驗周期長，易受外界環(huán)境因子(因素)的干擾，往往影響最后的統(tǒng)計結(jié)果，同時又不能在繁殖早期判斷卵子質(zhì)量，避免不必要損失。目前，國內(nèi)外還沒有使用多種方法對大菱鲆卵子進行篩選，對其卵子質(zhì)量的評價方法單一，不能全面反映其卵子的特性，因此需要提供一種有效的大菱鲆卵子質(zhì)量評價方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種評價大菱鲆卵子質(zhì)量的方法，采用此方法可以彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，解決現(xiàn)有的魚類卵子質(zhì)量檢測方法中缺少綜合評價，導(dǎo)致評價方法存在偏差問題，進一步完善魚類卵子質(zhì)量評價體系。本發(fā)明技術(shù)方案是在大菱鲆繁殖周期內(nèi)，分別收集同一樣品同一時期的未受精卵和卵巢液，再分別測定未受精卵和卵巢液的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)的活性，同時結(jié)合相應(yīng)的卵子受精率、孵化率和仔魚畸形率的測定，建立一種綜合評價大菱鲆卵子質(zhì)量的新方法，為大菱鲆卵子質(zhì)量評價提供可靠的技術(shù)手段。本發(fā)明提供一種檢測大菱鲆卵子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)大菱鲆未受精卵的堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性分別為2. 18±0. 48U/gprot,70. 87±9. 74U/gprot時，且卵巢液堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性在50. 78±15. 58U/gprot，24. 53±7. 47U/gprot時，受精率和孵化率最高，仔魚畸形率最低，此時卵子質(zhì)量符合生產(chǎn)的要求。當(dāng)檢測的未受精卵和卵巢液的堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性不在上述范圍內(nèi)時，所檢測的卵子并沒有處于最佳的質(zhì)量范圍。在大菱鲆規(guī)?；N苗生產(chǎn)過程中，當(dāng)卵子受精率低于50%時，養(yǎng)殖企業(yè)生產(chǎn)成本最高，養(yǎng)殖經(jīng)濟效益降低，獲利最低，卵子質(zhì)量不能滿足實際生產(chǎn)需要。本發(fā)明針對不同產(chǎn)卵時期卵子和卵巢液中兩種重要的參與能量代謝的酶的檢測，結(jié)合受精率、孵化率和仔魚畸形率的驗證，減少了外界環(huán)境因子(因素)的影響，客觀準(zhǔn)確的反應(yīng)了卵子的質(zhì)量，所用設(shè)備簡單，價格低廉，可節(jié)省時間和成本。
具體實施例方式本發(fā)明的方法，包括有如下的步驟I)在大菱鲆繁殖季節(jié)，選取發(fā)育一致的雌性親魚若干尾，分別收集卵子和卵巢液，卵子用生理鹽水研磨制備成10%組織勻漿，離心取上清，用試劑盒(南京建成生物工程研究所，酶標(biāo)法JC-A0059)在酶標(biāo)儀下測定堿性磷酸酶和酸性磷酸酶酶活性；卵巢液稀釋5倍后，同上述方法檢測堿性磷酸酶和酸性磷酸酶酶活性。每個樣品重復(fù)三次，結(jié)果取平均值， 所得實驗數(shù)據(jù)采用SAS (9. 0版本)軟件中GLM過程進行方差分析和Duncan氏多重比較。2)通過受精率和孵化率檢測該方法的準(zhǔn)確度受精率統(tǒng)計卵子受精2 4小時后，在倒置顯微鏡下觀察受精卵發(fā)育情況(正常受精卵此時發(fā)育至四細(xì)胞期，未受精卵發(fā)育停止)，計算得出卵子受精率；受精率=正常發(fā)育卵子數(shù)/總卵數(shù)孵化率統(tǒng)計卵子受精后，每間隔12小時，吸取沉于孵化網(wǎng)箱底部的死卵(發(fā)育正常的卵子浮于水層表面)，計數(shù)發(fā)育失敗的卵子數(shù)；待仔魚孵化后，統(tǒng)計孵化仔魚總數(shù)，計算得出孵化率；孵化率=孵化仔魚數(shù)/ (沉卵總數(shù)+孵化仔魚數(shù))仔魚畸形率統(tǒng)計仔魚孵化后在倒置顯微鏡下觀察仔魚形態(tài)，計數(shù)畸形仔魚數(shù)，統(tǒng)計孵化仔魚總數(shù)，計算得出仔魚畸形率。畸形率=畸形仔魚數(shù)/孵化仔魚數(shù))。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的方法進行詳細(xì)描述2011年在天源水產(chǎn)有限公司親魚車間內(nèi)進行試驗，取產(chǎn)卵期的雌性親魚12尾，分別擠卵后用吸管分別吸取兩次各IOml的卵子和卵巢液，其中IOml的卵子用于進行受精率和孵化率的檢測，IOml用于堿性磷酸酶和酸性磷酸酶檢測。將20組的數(shù)據(jù)進行分析后，得到如下表數(shù)據(jù)，單位U/gpix)t (國際單位/每克蛋白)。表I :大菱鲆繁殖周期內(nèi)卵子和卵巢液AKP、ACP活性變化及相對應(yīng)受精率、孵化率和仔魚畸形率
權(quán)利要求
1.一種鑒別大菱鲆卵子質(zhì)量的方法，其特征在于，是用大菱鲆未受精卵和卵巢液的堿性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性作為評價的標(biāo)準(zhǔn)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)如下大菱鲆未受精卵的堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性分別為2. 18±0. 48U/gprot、70. 87±9. 74U/gprot ;卵巢液的堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性分別為50. 78±15. 58U/gprot、24. 53±7. 47U/gprot。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其具體步驟如下 分別收集大菱鲆的未受精卵和卵巢液，然后將未受精卵用生理鹽水研磨制備成10%組織勻漿，離心取上清，在酶標(biāo)儀下測定堿性磷酸酶和酸性磷酸酶酶活性；卵巢液稀釋5倍后檢測堿性磷酸酶和酸性磷酸酶酶活性，并將檢測結(jié)果與權(quán)利要求2所述的標(biāo)準(zhǔn)進行比較，最終確定未受精卵的質(zhì)量；當(dāng)處于權(quán)利要求2所述的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)，為符合生產(chǎn)要求的卵。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鑒別大菱鲆卵子質(zhì)量的方法，是用大菱鲆未受精卵和卵巢液的堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性作為評價的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)大菱鲆未受精卵的堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性分別為2.18±0.48U/gprot、70.87±9.74U/gprot；卵巢液的堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性分別為50.78±15.58U/gprot、24.53±7.47U/gprot時，卵子的質(zhì)量符合生產(chǎn)要求。本發(fā)明針對不同產(chǎn)卵時期卵子和卵巢液中兩種重要的參與能量代謝的酶的檢測，結(jié)合受精率、孵化率和仔魚畸形率的驗證，減少了外界環(huán)境因子(因素)的影響，客觀準(zhǔn)確的反應(yīng)了卵子的質(zhì)量，所用設(shè)備簡單，價格低廉，可節(jié)省時間和成本。
文檔編號C12Q1/42GK102719516SQ20121023219
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者劉新富, 孟振, 賈玉東, 雷霽霖, 高淳仁 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所