一種牛骨骼肌特異性表達(dá)基因mstn啟動(dòng)子的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種牛骨骼肌特異性表達(dá)基因MSTN啟動(dòng)子，其核心啟動(dòng)子（-129至472）包含如SEQIDNo.1所示的DNA序列，其長(zhǎng)度為601bp。本發(fā)明根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)牛MSTN基因5′調(diào)控區(qū)具有骨骼肌特異性啟動(dòng)特性，并利用這一特性設(shè)計(jì)了一種骨骼肌特異性表達(dá)啟動(dòng)子載體，該啟動(dòng)子可以在轉(zhuǎn)基因牛的培育中應(yīng)用，具有骨骼肌特異性啟動(dòng)特性，而在除骨骼肌外的多種細(xì)胞中均無(wú)啟動(dòng)活性，能在骨髂肌中特異性地啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，為轉(zhuǎn)基因載體提供了一種重要的元件。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種牛骨骼肌特異性表達(dá)基因MSTN啟動(dòng)子
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，尤其是一種牛骨骼肌特異性表達(dá)基因MSTN啟動(dòng)子。【背景技術(shù)】
[0002]真核生物基因表達(dá)的時(shí)間和水平嚴(yán)格按照發(fā)育順序進(jìn)行。某些特定基因表達(dá)的調(diào)節(jié)由轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合于調(diào)控區(qū)相關(guān)元件，成為轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵步驟，并最終導(dǎo)致基因的時(shí)間和空間表達(dá)。編碼組織特異蛋白的基因嚴(yán)格按照組織特異性和發(fā)育階段性表達(dá)，為基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了很好的研究|吳式。在特異聞效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，獲得能廣泛應(yīng)用的特異性啟動(dòng)子非常重要。但啟動(dòng)子的特異性由多個(gè)元件控制，在不同種類(lèi)和不同發(fā)育時(shí)期起關(guān)鍵作用的調(diào)控元件并不相同，調(diào)控元件和反式作用因子之間的相互作用也十分復(fù)雜。因此要使外源基因能夠在動(dòng)物組織中特異高效地表達(dá)，必須構(gòu)建一個(gè)可以特異高效表達(dá)的動(dòng)物表達(dá)載體，其中啟動(dòng)子的選擇是重要的條件之一。
[0003]肌生長(zhǎng)抑制素(Myostatin，MSTN),又稱(chēng)為⑶F8，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子& (transforming growth factor & , TGF- & )超家族的一員，是控制骨骼肌生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與肌肉生長(zhǎng)和肉質(zhì)有著密切的關(guān)系，利用其基因調(diào)控區(qū)的相關(guān)元件構(gòu)建骨骼肌特異性表達(dá)載體是一種有效的方法。但是上述的研究均還處在起步階段，對(duì)于轉(zhuǎn)基因牛的培育和肉品品質(zhì)的提高均沒(méi)有起到較好的促進(jìn)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是:提供一種牛骨骼肌特異性表達(dá)基因MSTN啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在牛骨骼肌中具有明顯啟動(dòng)特性，在牛骨骼肌中特異性地啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達(dá)的要求，為通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)提高牛肉的品質(zhì)提供了一種重要的調(diào)控元件。`
[0005]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:牛骨骼肌特異性表達(dá)基因MSTN啟動(dòng)子，其核心啟動(dòng)子(-129至472)包含如SEQ ID N0.1所示的DNA序列(PCR擴(kuò)增時(shí)，設(shè)計(jì)的上游引物:GACTTGTGACAGACAGGGT,下游引物:GGCGTGGTAGTCATCGTC)，其長(zhǎng)度為 601bp。
[0006]所采用的重組核酸序列，其中含有上述的啟動(dòng)子或其片段，這樣就可以使位于啟動(dòng)子下游的目的基因在骨骼肌中特異性表達(dá)，作為分析、開(kāi)發(fā)、改造骨骼肌特性的研究模型。還可以利用已有的分子生物學(xué)操作技術(shù)獲得包含目的基因的重組核酸，通過(guò)顯微注射等基因?qū)爰夹g(shù)獲得轉(zhuǎn)基因胚胎，用于建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。重組核酸序列中的目的基因，含有下列的至少一種功能基因，主要包括提高肌肉品質(zhì)基因，加快生長(zhǎng)速度基因，抗病基因，提高飼料報(bào)酬的基因以及生產(chǎn)特定藥物的基因，這樣就可以在獲得骨骼肌特異性啟動(dòng)特性之外，提高該重組核酸序列的性能，為轉(zhuǎn)基因牛的培養(yǎng)提供更多的功能性方向，增加其附加產(chǎn)值。
[0007]本發(fā)明主要通過(guò)報(bào)告基因分析確定該啟動(dòng)子的啟動(dòng)特征。進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn):
1、牛MSTN啟動(dòng)子全長(zhǎng)的克隆及序列分析用軟件分析牛MSTN啟動(dòng)子區(qū)域，設(shè)定為Pl片段，用在線軟件設(shè)計(jì)特異性引物，由生物工程有限公司合成；從牛背部最長(zhǎng)肌組織提取組織DNA ;采用基因組PCR步移技術(shù)擴(kuò)增出MSTN的啟動(dòng)子。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增引物；對(duì)應(yīng)物進(jìn)行純化；送生物公司進(jìn)行序列分析。
[0008]2、牛MSTN啟動(dòng)子全長(zhǎng)報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
將提純后的目的基因和PGL3 — Basic進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建含有MSTN啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒PGL3 一 MSTN-PI,并對(duì)其進(jìn)行篩選和鑒定。
[0009]3、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)報(bào)告質(zhì)粒MSTN啟動(dòng)子的活性
將MSTN啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒和PRL-TK共轉(zhuǎn)染到牛前脂肪細(xì)胞中，24h后裂解細(xì)胞，并收集裂解液進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)。
[0010]4、牛MSTN核心啟動(dòng)子區(qū)的定位
(I)MSTN-Pl的5’端截短載體的構(gòu)建以及MSTN核心啟動(dòng)子區(qū)的初步鑒定設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)MSTN-Pl 5’端進(jìn)行截短，并構(gòu)建重組報(bào)告質(zhì)粒以檢測(cè)其啟動(dòng)活性。截短片段分別命名為P2、P3。構(gòu)建重組報(bào)告質(zhì)粒PGL3-MSTN-P2、PGL3-MSTN-P3,并進(jìn)行篩選，鑒定。然后對(duì)其進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。
[0011](2)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)道質(zhì)粒(pGL3_啟動(dòng)子)和內(nèi)參質(zhì)粒PRL-TK共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，并檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)活性。
[0012](3)將缺失突變載體按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)后，測(cè)定熒光素酶表達(dá)活性，并觀察不同缺失突變體對(duì)熒光素酶表達(dá)活性的影響。以上實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。
[0013](4)通過(guò)對(duì)缺失載體啟動(dòng)子活性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后，初步定位核心啟動(dòng)子的位置。
[0014]5、對(duì)核心啟動(dòng)子測(cè)序并進(jìn)行功能分析
將pGL3-啟動(dòng)子與PRL-TK共轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞系、小鼠脂肪細(xì)胞及原代小鼠乳腺細(xì)胞等10種細(xì)胞中，進(jìn)行表達(dá)特異性驗(yàn)證。
[0015]通過(guò)PCR或者片段捕獲等技術(shù)獲得骨骼肌中特異性表達(dá)的MSTN的啟動(dòng)子，長(zhǎng)度為601bp，將該片段插入PGL3-basic載體，得到啟動(dòng)子報(bào)告基因分析載體。質(zhì)粒去內(nèi)毒素后，轉(zhuǎn)染C2C12小鼠成肌細(xì)胞系，同時(shí)轉(zhuǎn)染牛原代腎上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞為對(duì)照，轉(zhuǎn)染24h后更換含牛血清的誘導(dǎo)培養(yǎng)基至成肌細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞分化融合，48h后用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，分析啟動(dòng)子特性。
[0016]由于采用了上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)牛MSTN基因啟動(dòng)子具有骨骼肌特異性啟動(dòng)特性，并利用這一特性設(shè)計(jì)了一種骨骼肌特異性表達(dá)啟動(dòng)子載體，該啟動(dòng)子可以在轉(zhuǎn)基因牛的培育中應(yīng)用。該啟動(dòng)子載體具有骨骼肌特異性啟動(dòng)特性，而在除骨骼肌外的多種細(xì)胞中均無(wú)啟動(dòng)活性，可見(jiàn)該啟動(dòng)子在骨髂肌中特異性地啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，能夠滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達(dá)的要求，為轉(zhuǎn)基因載體提供了一種重要的元件。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]附圖1為MSTN基因核心啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜；
其中M為表示DNA marker (MarkerVII) ；1表示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；附圖2為確認(rèn)核心啟動(dòng)子的實(shí)驗(yàn)框圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明的實(shí)施例:針對(duì)牛骨骼肌特異性表達(dá)基因MSTN啟動(dòng)子，設(shè)計(jì)上游引物:CTGCTCCCAGACCTTACC,下游引物:CTGGCGTGGTAGTCATCG，通過(guò)PCR擴(kuò)增，克隆獲得核心啟動(dòng)子(-129至472)包含如SEQ ID N0.1所示的DNA序列，其長(zhǎng)度為60Ibp。
[0019]核心啟動(dòng)子的序列為:GACTTGTGACAGACAGGGTT TTAACCTCTG ACAGCGAGATTCATTGTGGA GCAAGAGCCA ATCACAGATC CCGACGACAC TTGTCTCATC AAAGTTGGAA TATAAAAAGCCACTTGGAAT ACAGTATAAA AGATTCACTG GTGTGGCAAG TTGTCTCTCA GACTGGGCAG GCATTAACGTTTGGCTTGGC GTTACTCAAA AGCAAAAGAA AAGTAAAAGG AAGAAGTAAG AACAAGGGAA AAGATTGTATTGATTTTAAA ACCATGCAAA AACTGCAAAT CTCTGTTTAT ATTTACCTAT TTATGCTGAT TGTTGCTGGCCCAGTGGATC TGAATGAGAA CAGCGAGCAG AAGGAAAATG TGGAAAAAGA GGGGCTGTGT AATGCATGTTTGCGGAGGGA AAACACTACA TCCTCAAGAC TAGAAGCCAT AAAAATCCAA ATCCTCAGTA AACTTCGCCTGGAAACAGCT CCTAACATCA GCAAAGATGC TATCAGACAA CTTTTGCCCA AGGCTCCTCC ACTCCTGGAACTGATTGATC AGTTCGATGT CCAGAGAGAT GCCGGCAGTG ACGGCTCCTT GGAAGACGAT GACTACCACGC
【權(quán)利要求】
1.一種牛骨骼肌特異性表達(dá)基因MSTN啟動(dòng)子，其特征在于:其核心啟動(dòng)子(-129至472)包含如SEQ ID N0.1所示的DNA序列，其長(zhǎng)度為60Ibp。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103509793SQ201210219174
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月29日
【發(fā)明者】許厚強(qiáng), 劉敏, 陳偉, 陳祥 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)