專(zhuān)利名稱(chēng)：一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的實(shí)現(xiàn)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的實(shí)現(xiàn)方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
一般的，乳腺炎是奶牛飼養(yǎng)中最為常見(jiàn)、最為復(fù)雜的疾病之一，也是造成奶牛養(yǎng)殖業(yè)損失最大的一種疾病。目前，全世界約有2. 6457億頭奶牛(FA0，2010年)，每年約有1/3的奶?；既橄傺住?jù)估計(jì)，大約95%的病例是由金黃色葡萄球菌(Staph, aureus)、鏈球菌(Strep, uberis)和大腸桿菌(E. coli)感染引起,每年因乳腺炎造成的損失高達(dá)350億美元(Wellenberg等，2002)。有關(guān)奶牛乳腺炎發(fā)病機(jī)理和防治的研究已有100多年的歷史，并取得了顯著的進(jìn)展。然而，奶牛乳腺炎是一種非常復(fù)雜的疾病，盡管許多國(guó)家都已經(jīng)對(duì)各種乳腺炎實(shí)施綜合防治措施，但它是一種受多因素影響的疾病，很難控制。目前，對(duì)乳腺炎 的控制與預(yù)防措施并沒(méi)有從整體上降低乳腺炎的發(fā)病率，而且乳腺炎也是奶牛生產(chǎn)中抗生素使用的最主要原因(Villli，2001)。因此，我們迫切需要探討其它途徑來(lái)降低乳腺炎的發(fā)病率，通過(guò)遺傳選擇來(lái)提高奶牛乳腺炎抗性被認(rèn)為是解決乳腺炎問(wèn)題的一種最好的長(zhǎng)期策略(Burton等，2001)。若通過(guò)遺傳育種手段，可使奶牛增強(qiáng)乳腺炎的抗性，減少藥物的使用量，改善牛奶質(zhì)量安全，減少經(jīng)濟(jì)損失，有望從根本上解決乳腺炎這一長(zhǎng)期困擾著世界奶業(yè)發(fā)展的難題。奶?？剐缘倪z傳力很低，基于表型選擇的遺傳改良效果不佳。而奶牛分子育種可以實(shí)現(xiàn)奶牛的早期選擇，大大縮短奶牛遺傳改良的世代間隔，節(jié)約選育成本，提高選擇效率?；蛑杏械姆肿訕?biāo)記，例如單核苷酸突變可影響基因的表達(dá)調(diào)控、基因功能等，對(duì)個(gè)體的表型具有重要的影響。因此，基于功能性的分子標(biāo)記輔助選擇的分子育種技術(shù)大有可為。α-2-巨球蛋白(Α2Μ)基因位于牛5號(hào)染色體，基因全長(zhǎng)48. 3kbp，包含37個(gè)外顯子和36個(gè)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生4. 9kbp的mRNA。A2M作為一種進(jìn)化上保守的非特異性廣譜蛋白酶抑制劑，抑制侵入機(jī)體的寄生蟲(chóng)和病原體釋放的多種蛋白酶與毒素，減少其對(duì)宿主的破壞，增強(qiáng)宿主的抗病力(Armstrong PB, Quigley JP. 1999. Alpha2-macroglobulin anevolutionarily conserved arm of the innate immune system. Dev Comp Immunol. 23,375-90)。它和補(bǔ)體系統(tǒng)中的補(bǔ)體成分3 (C3)，補(bǔ)體成分4 (C4)和補(bǔ)體成分5 (C5)都屬于α-巨球蛋白家族。可變剪切是一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，可以提高基因產(chǎn)物的多樣性?？勺兗羟惺钦婧松锏囊环N基本而又重要的調(diào)控機(jī)制，它精細(xì)協(xié)調(diào)基因的功能，高效調(diào)節(jié)基因的定量表達(dá)以及蛋白功能的多樣化，使一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在不同的發(fā)育階段、分化細(xì)胞和生理狀態(tài)下，通過(guò)不同的剪切方式，可以得到不同的mRNA和翻譯產(chǎn)物，從而影響蛋白質(zhì)與其各配體間的連接方式、酶的活性、空間結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞內(nèi)分布的改變，對(duì)細(xì)胞的分化、發(fā)育、生理功能和病理狀態(tài)都有重要意義。一個(gè)基因通過(guò)可變剪切可以產(chǎn)生多種mRNA，產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，但是對(duì)于其調(diào)節(jié)機(jī)制所知不多。外顯子剪接增強(qiáng)子(ESE)作為引起可變剪切的順式作用原件之一，在產(chǎn)生可變剪切的過(guò)程中發(fā)揮了非常重要的作用。單核苷酸多態(tài)(SNPs)是基因突變之一，可以引起前體mRNA的異常剪切，包括外顯子跳躍、內(nèi)含子保留等。最近，許多報(bào)道證明SNPs是導(dǎo)致基因產(chǎn)生異常可變剪切的主要原因。(Montgomery SB, SammethM，Gutierrez-Arcelus M，Lach RP, Ingle C，Nisbett J，Guigo R，Dermitzakis ET.2010.Transcriptome genetics using second generation sequencing in a Caucasianpopulation. Nature. 464，773-777)。已經(jīng)報(bào)道許多異常的可變剪切和人的許多疾病是有關(guān)聯(lián)的。到目前為止沒(méi)有牛A2M基因存在可變剪切和引起可變剪切的功能性SNPs的報(bào)道，也沒(méi)有A2M基因功能性SNPs和奶牛抗乳腺炎病的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的實(shí)現(xiàn)方法及其應(yīng)用。 本發(fā)明的技術(shù)方案是按以下方式實(shí)現(xiàn)的一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法，其通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR和同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量iTRAQ的方法提供一個(gè)奶牛乳腺炎易感/抗性A2M候選基因；通過(guò)反轉(zhuǎn)錄RT-PCR和克隆測(cè)序分析可變剪切，同時(shí)通過(guò)基因直接測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到該基因的單核苷酸多態(tài)性SNPs，利用軟件分析可變剪切和SNPs的關(guān)系，同時(shí)對(duì)體細(xì)胞評(píng)分SCS和A2M基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，判斷SNPs位點(diǎn)為功能性位點(diǎn)，選擇有利的等位基因型個(gè)體作為奶牛抗乳腺炎能力留種。改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法，其步驟是a :篩選A2M基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性候選基因，al :對(duì)A2M mRNA進(jìn)行熒光定量PCR，紀(jì)錄結(jié)果，a2 :利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量iTRAQ的方法對(duì)A2M蛋白進(jìn)行相
對(duì)定量，記錄結(jié)果；b :利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及克隆測(cè)序分析可變剪切；c A2M基因的功能性SNP位點(diǎn)鑒別；d:SNPs和可變剪切關(guān)系的分析。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法，其特征在于a :篩選A2M基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性候選基因，al :對(duì)A2M mRNA進(jìn)行熒光定量PCR步驟是首先分別選擇3頭正常的和3頭患乳腺炎的乳腺組織，利用SYBR Premix ExTaqTM II (大連寶生物工程公司，中國(guó))和LightCycler 480 II(Roche Diagnostics)儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)，基因的相對(duì)表達(dá)水平用持家基因β-actin (序列號(hào)NM_173979. 3)做內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次；20 μ I RT-qPCR擴(kuò)增體系10. 0μ I SYBR Premix Ex TaqTM ΙΙ(2Χ)，0·4μΜ上下游引物A2M-F SEQ ID NO. 1，A2M-R SEQ ID NO. 2 ；或β -actinF SEQ ID NO. 3，β -actin-R SEQ ID NO. 4 ；2. 0 μ I A2M cDNA( < IOOng)或
β-actin 質(zhì)粒 DNA, 6· 4 μ I 蒸懼水；擴(kuò)增反應(yīng)條件94°C 5min ;然后94°C 15s，56°C 15s，這一步共40個(gè)循環(huán)；最后70°C 5s,分析熒光定量的結(jié)果，比較A2M mRNA在患乳腺炎奶牛的乳腺組織中的表達(dá)量和正常的乳腺組織中的表達(dá)量；a2 :利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量iTRAQ的方法對(duì)A2M蛋白進(jìn)行相對(duì)定量步驟是利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量iTRAQ的方法對(duì)3頭正常的和3頭患乳腺炎的乳腺組織A2M蛋白進(jìn)行相對(duì)定量，牛的蛋白參考數(shù)據(jù)庫(kù)為UniProt ID Q9H0H5, iTRAQ的結(jié)果 比較患乳腺炎組織A2M蛋白表達(dá)量和正常的組織表達(dá)量；b :利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及克隆測(cè)序分析可變剪切的步驟是以奶牛乳腺組織提取的cDNA為模板，根據(jù)A2M基因cDNA序列(NCBI參考序列NM_001109795. I)設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增A2M cDNA片段，特異引物上游引物A2MF序列為SEQID NO. 9，下游引物 A2MR 序列為SEQ IDN0. 10，25 μ I PCR 體系反應(yīng)成分包括DNA(100ng/y I) I μ I, A2MF, A2MR 引物(lOymol/L)各O. 5 μ 1，2 X Taq PCR MasterMix (北京諾維森生物公司)12. 5 μ 1，重餾水補(bǔ)至25 μ 1，PCR 程序?yàn)?4 V 4min,然后 94 °C 30s, 64. 9 V 30s, 72 V 30s，共 35 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin,PCR產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了 4623bp PCR目的帶外，還有4條清晰的帶，對(duì)這4條帶純化后連接到pGEM -T Easy載體，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)2種新的可變剪切形式,標(biāo)記為A2M-AS1和A2M-AS2 ； c A2M基因的功能性SNP位點(diǎn)鑒別步驟是根據(jù)引起基因可變到切機(jī)制的相關(guān)背景資料，參考NCBI中牛A2M基因序列(序列號(hào)NC_007303. 4)，以奶牛DNA為模板，設(shè)計(jì)F1/R1和F2/R2引物擴(kuò)增發(fā)生可變剪切位置附近的DNA序列引物序列Fl 為SEQ ID NO. 5 ；R1 為SEQ ID NO. 6 ；引物序列F2 為SEQ ID NO. 7 ；R2 為SEQ ID NO. 8 ；25 μ I PCR體系，PCR反應(yīng)，然后對(duì)產(chǎn)物直接測(cè)序，使用DNAStar軟件包中的SeqMan軟件分析測(cè)序結(jié)果，在Α2Μ基因的29和37外顯子上發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)SNPs位點(diǎn)c. 3535A > T和c. 4520T > C(NCBI 參考序列ΝΜ_001109795. I);其中，c. 3535A > T 是位于擴(kuò)增片段 SEQID NO. 12第642bp處的單核苷酸位點(diǎn)；c. 4520T > C位于擴(kuò)增片段SEQ ID NO. 14第526bp處的單核苷酸位點(diǎn)，選擇A2M基因序列上鑒別到的2個(gè)SNPs位點(diǎn)在338頭中國(guó)荷斯坦奶牛個(gè)體中采用直接測(cè)序的方法進(jìn)行SNP基因分型，采用SAS8. I軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，通過(guò)關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果，分別發(fā)現(xiàn)這2個(gè)位點(diǎn)的AA和TT基因型型具有比較高的SCS，根據(jù)這2個(gè)基因型和SCS的表型有關(guān)，篩選出乳腺炎抗性/易感功能性分子標(biāo)記，通過(guò)對(duì)奶牛個(gè)體基因型的判定，通過(guò)標(biāo)記輔助選擇的方法，可選育乳腺炎抗性個(gè)體，培育出抗乳腺炎的奶牛新品系；d:SNPs和可變剪切關(guān)系的分析為了分析測(cè)序發(fā)現(xiàn)的SNPs和可變剪切的關(guān)系，利用ESEfinder3. O對(duì)這2個(gè)SNP進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)SNP正好是位于剪切增強(qiáng)子內(nèi)ESE，其中，c. 3535A > T突變?cè)黾恿薙C35 and SRp40兩種剪切蛋白的結(jié)合，c. 4520T > C突變?cè)黾恿?SRp40剪切蛋白的結(jié)合，同時(shí)對(duì)奶牛DNA進(jìn)行測(cè)序，并且提取它們相應(yīng)的總RNA，利用RT-PCR和克隆測(cè)序技術(shù)分析c. 3535和c. 4520位點(diǎn)的基因型和異常可變剪切體的關(guān)系。一對(duì)擴(kuò)增奶牛A2M不同可變剪切體所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物，其特征在于上游引物A2MF序列為SEQ ID NO. 9，下游引物A2MR序列為SEQ ID NO. 10，其PCR擴(kuò)增的異?？勺兗羟畜wA2M-AS1的產(chǎn)物大小為1242bp，序列如SEQ IDN0. 16 ;異?？勺兗羟畜wA2M-AS2的產(chǎn)物大小為3607bp，序列如SEQ IDN0. 17。一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性A2M基因可產(chǎn)生異?？勺兗羟畜wA2M-AS1的核苷酸序列及其功能性單核苷酸位點(diǎn)，其特征在于其序列如SEQID NO. 12，并且擴(kuò)增片段第642bp處的單核苷酸位點(diǎn)為A或T。一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性A2M基因可產(chǎn)生異常可變剪切體A2M-AS2的核·苷酸序列及其功能性單核苷酸位點(diǎn)，其特征在于其序列如SEQID NO. 14，并且擴(kuò)增片段第526bp處的單核苷酸位點(diǎn)為T(mén)或C。所述的核苷酸序列及其功能性單核苷酸位點(diǎn)在奶牛乳腺炎抗性育種中的應(yīng)用。影響奶牛乳腺炎易感/抗性的A2M基因功能性分子標(biāo)記位點(diǎn)在奶牛乳腺炎抗性遺傳改良中的應(yīng)用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比所產(chǎn)生的有益效果是本發(fā)明通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)手段，可實(shí)現(xiàn)對(duì)奶牛個(gè)體或群體的乳腺炎抗性早期選擇，改變現(xiàn)有的只根據(jù)表型選擇效果不佳狀況，可顯著提供奶牛乳腺炎抗性選擇的準(zhǔn)確性和可靠性。本發(fā)明通過(guò)遺傳育種手段，可增加乳腺炎抗性基因在群體中的分布，可增加奶牛群體對(duì)乳腺炎的抗性，降低發(fā)病率，減少藥物的使用量，改善牛奶質(zhì)量安全，減少經(jīng)濟(jì)損失。本發(fā)明鑒別了 2個(gè)功能性的SNPs位點(diǎn)，可導(dǎo)致奶牛產(chǎn)生2種A2M基因異?？勺兗羟畜w，通過(guò)分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)檢測(cè)個(gè)體奶牛A2M基因的這2個(gè)位點(diǎn)的基因型，并且通過(guò)和奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定(DHI)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析后選擇有利的基因型個(gè)體留種，可以提高A2M乳腺炎抗性基因型個(gè)體在群體中的比例，降低奶牛乳腺炎病的發(fā)病率，減少經(jīng)濟(jì)損失。本發(fā)明為奶牛的乳腺炎抗性遺傳改良提供了一種新的方法。


圖IA2M基因在正常和乳腺炎組織中的差異表達(dá)，A :mRNA差異表達(dá)B :蛋白差異表達(dá)。圖2A2M cDNA擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在I %瓊脂糖的檢測(cè)。圖3可變剪切體A2M-AS1和A2M-AS2的模式示意圖。圖4c. 3535A > T突變前后ESE的變化。圖5c. 4520T > C位點(diǎn)攜帶牛的基因測(cè)序峰圖。圖6c. 4520T > C突變前后ESE的變化。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的實(shí)現(xiàn)方法及其應(yīng)用作以下詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的目的一是通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)和同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)的方法提供一個(gè)奶牛乳腺炎易感/抗性A2M候選基因的方法；通過(guò)RT-PCR和克隆測(cè)序新發(fā)現(xiàn)了 2種可變剪切，同時(shí)通過(guò)基因直接測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到該基因的2個(gè)SNPs，利用ESEfinder 3. O軟件分析新發(fā)現(xiàn)的2種可變剪切和SNPs的關(guān)系，同時(shí)對(duì)體細(xì)胞評(píng)分(SCS)和A2M基因型進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)SNPs位點(diǎn)為功能性位點(diǎn)。選擇有利的等位基因型個(gè)體留種，可以改善奶牛的抗乳腺炎能力，提高產(chǎn)奶量和奶品質(zhì)。本發(fā)明的目的之二是影響奶牛乳腺炎易感/抗性的A2M基因功能性分子標(biāo)記位點(diǎn)在奶牛乳腺炎抗性遺傳改良中的應(yīng)用。目的一實(shí)現(xiàn)的方法具體如下 I、篩選A2M基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性候選基因I. 1A2M mRNA 進(jìn)行熒光定量 PCR首先分別選擇3頭正常的和3頭患乳腺炎的乳腺組織，利用SYBR Premix ExTaqTM 11(大連寶生物工程公司，中國(guó))和LightCycler 480 II (Roche Diagnostics)儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)?；虻南鄬?duì)表達(dá)水平用持家基因β-actin(序列號(hào)ΝΜ_173979· 3)做內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。20 μ I RT-qPCR擴(kuò)增體系10. O μ I SYBR Premix Ex TaqTM II (2 X)，O. 4 μ M 上下游引物(A2M-F :SEQ ID NO. 1，A2M-R :SEQ ID NO. 2或 β-actinF :SEQ ID NO. 3, β -actin-R SEQ ID NO. 4), 2. 0 μ I A2M cDNA ( < IOOng)或β -actin質(zhì)粒DNA，6. 4μ I蒸餾水。擴(kuò)增反應(yīng)條件如下-MV 5min ;然后94°C 15s，56。。15s，這一步共40個(gè)循環(huán)；最后70°C 5s.熒光定量的結(jié)果表明A2M mRNA在患乳腺炎奶牛的乳腺組織中的表達(dá)顯著高于正常的乳腺組織，見(jiàn)圖I。I. 2A2M蛋白進(jìn)行相對(duì)定量利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)的方法對(duì)3頭正常的和3頭患乳腺炎的乳腺組織A2M蛋白進(jìn)行相對(duì)定量。牛的蛋白參考數(shù)據(jù)庫(kù)為UniProt ID :Q9H0H5。iTRAQ的結(jié)果顯示患乳腺炎組織A2M蛋白表達(dá)量比起正常的組織上調(diào)了將近3. 5倍，見(jiàn)圖I。2、利用RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及克隆測(cè)序分析以奶牛乳腺組織提取的cDNA為模板，根據(jù)已報(bào)道的A2M基因cDNA序列(NCBI參考序列NM_001109795. I)設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增A2M cDNA片段。特異引物上游引物A2MF序列為SEQ ID NO. 9，下游引物A2MR序列為=SEQID NO. 10。25 μ I PCR 體系反應(yīng)成分包括DNA(100ng/y I) I μ I, A2MF, A2MR 引物(lOymol/L)各O. 5μ l，2XTaq PCR MasterMix (北京諾維森生物公司)12. 5 μ 1，重餾水補(bǔ)至25 μ I。PCR 程序?yàn)?4°C 4min ;然后 94°C 30s, 64. 9°C 30s, 72°C 30s，共 35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0PCR產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了 4623bp PCR目的帶外，還有4條清晰的帶，對(duì)這4條帶純化后連接到pGEM -T Easy載體，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)2種新的可變剪切形式，命名為A2M-AS1和A2M-AS2，剪切模式見(jiàn)圖3。3、A2M基因的功能性SNP位點(diǎn)鑒別
根據(jù)引起基因可變到切機(jī)制的相關(guān)背景資料，參考NCBI中牛A2M基因序列(序列號(hào)NC_007303. 4)，以奶牛DNA為模板，設(shè)計(jì)F1/R1和F2/R2引物擴(kuò)增發(fā)生可變剪切位置附近的DNA序列。引物序列Fl為SEQ ID NO. 5 ；R1為SEQ ID NO. 6。引物序列F2為=SEQID NO. 7 ；R2 為SEQ ID NO. 8。25 μ I PCR體系如上述2中所述，然后對(duì)產(chǎn)物直接測(cè)序，使用DNAStar軟件包中的SeqMan軟件分析測(cè)序結(jié)果。申請(qǐng)人在Α2Μ基因的29和37外顯子上發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)SNPs位點(diǎn)c. 3535Α > T 和 C. 4520Τ > C (NCBI 參考序列ΝΜ_001109795. I)。其中，c. 3535A > T 是位于擴(kuò)增片段SEQ ID NO. 12第642bp處的單核苷酸位點(diǎn)。c. 4520T>C位于擴(kuò)增片段SEQ IDNO. 14第526bp處的單核苷酸位點(diǎn)。選擇A2M基因序列上鑒別到的2個(gè)SNPs位點(diǎn)在338頭中國(guó)荷斯坦奶牛個(gè)體中采用直接測(cè)序的方法進(jìn)行SNP基因分型。采用SAS8. I軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析(表I)。通過(guò)關(guān)聯(lián) 性分析結(jié)果，申請(qǐng)人分別發(fā)現(xiàn)這2個(gè)位點(diǎn)的AA和TT基因型型具有比較高的SCS，具體分析見(jiàn)表I。根據(jù)這2個(gè)基因型和SCS的表型有關(guān)，篩選出乳腺炎抗性/易感功能性分子標(biāo)記，通過(guò)對(duì)奶牛個(gè)體基因型的判定，通過(guò)標(biāo)記輔助選擇的方法，可選育乳腺炎抗性個(gè)體，培育出抗乳腺炎的奶牛新品系。表I A2M基因型和體細(xì)胞數(shù)表型關(guān)聯(lián)性分析
位置基因型個(gè)體數(shù)，、
(SCS)
c.3535A>T AA2013.96 ±0.23
AT1034.53 ±0.52
TT345.12 ±0.60
c.4520T>C TT1634.33 土 0.35
TC1244.81 士 0.46
CC515.28 ±0.574、SNPs和可變剪切關(guān)系的分析為了分析測(cè)序發(fā)現(xiàn)的SNPs和可變剪切的關(guān)系，利用ESEfinder 3. O對(duì)這2個(gè)SNP進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)SNP正好是位于剪切增強(qiáng)子內(nèi)(ESE)。其中，c. 3535A > T突變?cè)黾恿?SC35 and SRp40兩種剪切蛋白的結(jié)合(圖4)。有報(bào)道，剪切蛋白SC35可以引起異常的可變剪切(Gabut M, MineM, Marsac C, Brivet M, Tazi J, Soret J. 2005. The SR proteinSC35 is responsible for aberrant splicing of the Elalpha pyruvate dehydrogenasemRNA in a case of mental retardation with lactic acidosis. Mol Cell Biol. 25,3286-94.)。c. 4520T > C突變?cè)黾恿?SRp40剪切蛋白的結(jié)合(圖5)。同時(shí)對(duì)奶牛DNA進(jìn)行測(cè)序，并且提取它們相應(yīng)的總RNA。利用RT-PCR和克隆測(cè)序技術(shù)分析c. 3535和c. 4520位點(diǎn)的基因型和異?？勺兗羟畜w的關(guān)系，詳見(jiàn)表2和表3。表2 c. 3535位點(diǎn)基因型和產(chǎn)生可變剪切A2M-AS1的關(guān)系c.3535A>T 樣品數(shù)A2M-AS1 數(shù) A2M-AS1 頻率
AA20OO
AT12758.3%
TT33100%表3 c. 4520位點(diǎn)基因型和產(chǎn)生可變剪切A2M-AS2的關(guān)系
c.4520T>C 樣品數(shù)A2M-AS2 數(shù) A2M-AS2 頻率
TT15OO
TC12975%
CC77100%目的二實(shí)現(xiàn)的方法具體如下本發(fā)明利用A2M基因的2個(gè)功能性SNPs位點(diǎn)的信息，采用分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)鑒別奶牛在這2個(gè)位點(diǎn)的基因型，選擇具有乳腺炎抗性的基因型個(gè)體。本發(fā)明鑒別了 2個(gè)功能性的SNPs位點(diǎn)，可導(dǎo)致奶牛產(chǎn)生2種A2M基因異?？勺兗羟校ㄟ^(guò)分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)檢測(cè)個(gè)體奶牛A2M基因的這2個(gè)位點(diǎn)的基因型，并且通過(guò)和奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定(DHI)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析后選擇有利的基因型個(gè)體留種，可以提高A2M乳腺炎抗性基因型個(gè)體在群體中的比例，降低奶牛乳腺炎病的發(fā)病率，減少經(jīng)濟(jì)損失。本發(fā)明為奶牛的乳腺炎抗性遺傳改良提供了一種新的方法。利用228頭中國(guó)荷斯坦奶牛作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，這些奶牛血樣來(lái)自青島高產(chǎn)和濟(jì)南佳寶牛場(chǎng)。228頭牛具有DHI數(shù)據(jù)。采用直接DNA測(cè)序的方法對(duì)A2M基因c. 3535位點(diǎn)在在上述的228頭奶牛進(jìn)行SNP基因分型。分型過(guò)程中，F(xiàn)1/R1引物的擴(kuò)增片段第642堿基A，為野生型，序列為SEQ IDNO. 12 ;擴(kuò)增片段第642堿基T為突變型，序列為SEQID NO. 13。同時(shí)對(duì)這個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型與DHI記錄中的SCS表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)性統(tǒng)計(jì)分析，見(jiàn)表4。同時(shí)對(duì)一定數(shù)量的牛DNA進(jìn)行測(cè)序，并且提取它們相應(yīng)的mRNA。利用RT-PCR和克隆測(cè)序技術(shù)分析c. 3535位點(diǎn)的基因型和可變剪切A2M-AS1的關(guān)系，見(jiàn)表5。表4 A2M基因型和體細(xì)胞數(shù)表型關(guān)聯(lián)性分析
位置基因型個(gè)體數(shù)體細(xì)胞數(shù)
c.3535A>T AA1294.16 ±0.53
AT734.73 ± 0.63
TT264.97 ± 0.67表5 c. 3535位點(diǎn)基因型和產(chǎn)生可變剪切A2M-AS1的關(guān)系檢測(cè)出檢測(cè)出c.3535A>T 樣品數(shù)A2M-AS1 個(gè)體A2M-AS1 個(gè)體數(shù)的比例
AA13OO
AT6350%
TT22100%分析結(jié)果表明SNP位點(diǎn)c. 3535A > T，A等位基因?yàn)榭剐曰?，T等位基因?yàn)橐赘谢?，基因型AA個(gè)體對(duì)奶牛乳腺炎具有抵抗性；此位點(diǎn)分別為AA型個(gè)體是抗乳腺炎病奶牛的選育改良所需要的優(yōu)良基因型個(gè)體。利用192頭中國(guó)荷斯坦奶牛作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，這些奶牛血樣來(lái)自青島高產(chǎn)和濟(jì)南佳寶牛場(chǎng)。這192頭牛的DHI數(shù)據(jù)記錄完全。 采用直接DNA測(cè)序的方法對(duì)A2M基因c. 4520位點(diǎn)在在上述的192頭奶牛進(jìn)行SNP基因分型。分型過(guò)程中，F(xiàn)2/R2引物的擴(kuò)增片段第526堿基T為野生型，序列為SEQ IDNO. 14 ;擴(kuò)增片段第526堿基C為突變型，序列為SEQID NO. 15。同時(shí)對(duì)這個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型后與DHI記錄中的SCS表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)性統(tǒng)計(jì)分析，見(jiàn)表5。同時(shí)對(duì)牛DNA進(jìn)行測(cè)序，并且提取它們相應(yīng)的mRNA。利用RT-PCR和克隆測(cè)序技術(shù)分析c. 4520位點(diǎn)的基因型和可變剪切A2M-AS2的關(guān)系，見(jiàn)表6。表5 A2M基因型和體細(xì)胞數(shù)表型關(guān)聯(lián)性分析
位置基因型個(gè)體數(shù)體細(xì)胞評(píng)分
c.4520T>C TT1054.05 ± 0.37
TC674.36 士 0.49
CC205.17 ±0.61表6 c. 4520位點(diǎn)基因型和產(chǎn)生可變剪切A2M-AS2的關(guān)系
c.4520T>C位點(diǎn)奶牛頭數(shù)檢測(cè)出檢測(cè)出 基因型A2M-AS2的奶A2M-AS2奶牛 牛頭數(shù)的比例
TT9OO
TC3I33.3%
CCII100%分析結(jié)果表明SNP位點(diǎn)c. 4520T > C，T等位基因?yàn)榭剐曰颍珻等位基因?yàn)橐赘谢?，基因型TT個(gè)體對(duì)奶牛乳腺炎具有抵抗性。此位點(diǎn)分別為T(mén)T型個(gè)體是抗乳腺炎病奶牛的選育改良所需要的優(yōu)良基因型個(gè)體。
權(quán)利要求
1.一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法，其特征在于通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR和同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量iTRAQ的方法提供一個(gè)奶牛乳腺炎易感/抗性A2M候選基因；通過(guò)反轉(zhuǎn)錄RT-PCR和克隆測(cè)序分析可變剪切，同時(shí)通過(guò)基因直接測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到該基因的單核苷酸多態(tài)性SNPs，利用軟件分析可變剪切和SNPs的關(guān)系，同時(shí)對(duì)體細(xì)胞評(píng)分SCS和A2M基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，判斷SNPs位點(diǎn)為功能性位點(diǎn)，選擇有利的等位基因型個(gè)體作為奶?？谷橄傺啄芰α舴N。
2.一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法，其特征在于其步驟是 a:篩選A2M基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性候選基因，al :對(duì)A2M mRNA進(jìn)行熒光定量PCR，記錄結(jié)果，a2 :利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量iTRAQ的方法對(duì)A2M蛋白進(jìn)行相對(duì)定量，記錄結(jié)果； b :利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及克隆測(cè)序分析可變剪切； c :A2M基因的功能性SNP位點(diǎn)鑒別； d =SNPs和可變剪切關(guān)系的分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法，其特征在于a:篩選A2M基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性候選基因， al :對(duì)A2M mRNA進(jìn)行熒光定量PCR步驟是 首先分別選擇3頭正常的和3頭患乳腺炎的乳腺組織，利用SYBR PremixEx TaqTMII(大連寶生物工程公司，中國(guó))和LightCycler 480 II (Roche Diagnostics)儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)，基因的相對(duì)表達(dá)水平用持家基因i3_actin(序列號(hào)NM_173979. 3)做內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次； . 20 μ I RT-qPCR擴(kuò)增體系10. 0μ I SYBR Premix Ex TaqTM II (2 X )，O. 4 μ M 上下游引物A2M-F SEQ ID NO. 1，A2M-R SEQ ID NO. 2 ； 或β-actinF SEQ ID NO. 3，β-actin-R SEQ ID NO. 4 ； . 2.0μ I A2M cDNA( < IOOng) 或β -actin 質(zhì)粒 DNA, 6. 4 μ I 蒸懼水； 擴(kuò)增反應(yīng)條件94°C 5min ;然后94°C 15s，56°C 15s，這一步共40個(gè)循環(huán)；最后70°C 5s，分析熒光定量的結(jié)果，比較A2M mRNA在患乳腺炎奶牛的乳腺組織中的表達(dá)量和正常的乳腺組織中的表達(dá)量； a2 :利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量iTRAQ的方法對(duì)A2M蛋白進(jìn)行相對(duì)定量步驟是利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量iTRAQ的方法對(duì)3頭正常的和3頭患乳腺炎的乳腺組織A2M蛋白進(jìn)行相對(duì)定量，牛的蛋白參考數(shù)據(jù)庫(kù)為UniProt ID Q9H0H5, iTRAQ的結(jié)果比較患乳腺炎組織A2M蛋白表達(dá)量和正常的組織表達(dá)量； b :利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及克隆測(cè)序分析可變剪切的步驟是 以奶牛乳腺組織提取的cDNA為模板，根據(jù)A2M基因cDNA序列(NCBI參考序列NM_001109795. I)設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增A2M cDNA片段，特異引物上游引物A2MF序列為SEQID NO. 9，下游引物 A2MR 序列為SEQ IDN0. 10，.25 μ I PCR 體系反應(yīng)成分包括DNAdOOng/μ 1)1μ 1，A2MF，A2MR 引物(10ymol/L)各O. 5 μ 1，2 X Taq PCR MasterMix (北京諾維森生物公司)12. 5 μ 1，重餾水補(bǔ)至25 μ 1， PCR程序?yàn)?MV 4min，然后 94°C 30s, 64. 9°C 30s，72。。30s，共 35 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin,PCR產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了 4623bp PCR目的帶外，還有4條清晰的帶，對(duì)這4條帶純化后連接到pGEM -T Easy載體，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)2種新的可變剪切形式，標(biāo)記為 A2M-AS1 和 A2M-AS2 ； c A2M基因的功能性SNP位點(diǎn)鑒別步驟是 根據(jù)引起基因可變到切機(jī)制的相關(guān)背景資料，參考NCBI中牛A2M基因序列(序列號(hào)NC_007303. 4)，以奶牛DNA為模板，設(shè)計(jì)F1/R1和F2/R2引物擴(kuò)增發(fā)生可變剪切位置附近的DNA序列引物序列 Fl 為SEQ ID NO. 5 ；R1 為SEQ ID NO. 6 ；引物序列 F2 為SEQ ID NO. 7 ；R2 為SEQ ID NO. 8 ； . 25 μ I PCR體系，PCR反應(yīng)，然后對(duì)產(chǎn)物直接測(cè)序，使用DNAStar軟件包中的SeqMan軟件分析測(cè)序結(jié)果，在Α2Μ基因的29和37外顯子上發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)SNPs位點(diǎn)c. 3535A > T和c. 4520T > C(NCBI 參考序列ΝΜ_001109795. I);其中，c. 3535A > T 是位于擴(kuò)增片段 SEQID NO. 12第642bp處的單核苷酸位點(diǎn)；c. 4520T > C位于擴(kuò)增片段SEQ ID NO. 14第526bp處的單核苷酸位點(diǎn)， 選擇A2M基因序列上鑒別到的2個(gè)SNPs位點(diǎn)在338頭中國(guó)荷斯坦奶牛個(gè)體中采用直接測(cè)序的方法進(jìn)行SNP基因分型，采用SAS8. I軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，通過(guò)關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果，分別發(fā)現(xiàn)這2個(gè)位點(diǎn)的AA和TT基因型型具有比較高的SCS，根據(jù)這2個(gè)基因型和SCS的表型有關(guān)，篩選出乳腺炎抗性/易感功能性分子標(biāo)記，通過(guò)對(duì)奶牛個(gè)體基因型的判定，通過(guò)標(biāo)記輔助選擇的方法，可選育乳腺炎抗性個(gè)體，培育出抗乳腺炎的奶牛新品系；d =SNPs和可變剪切關(guān)系的分析 為了分析測(cè)序發(fā)現(xiàn)的SNPs和可變剪切的關(guān)系，利用ESEfinder3. O對(duì)這2個(gè)SNP進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)SNP正好是位于剪切增強(qiáng)子內(nèi)ESE，其中，c. 3535A > T突變?cè)黾恿?SC35and SRp40兩種剪切蛋白的結(jié)合，c. 4520T > C突變?cè)黾恿?SRp40剪切蛋白的結(jié)合， 同時(shí)對(duì)奶牛DNA進(jìn)行測(cè)序，并且提取它們相應(yīng)的總RNA，利用RT-PCR和克隆測(cè)序技術(shù)分析c. 3535和c. 4520位點(diǎn)的基因型和異常可變剪切體的關(guān)系。
4.一對(duì)擴(kuò)增奶牛A2M不同可變剪切體所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物，其特征在于上游引物A2MF序列為SEQ ID NO. 9，下游引物A2MR序列為SEQ IDN0. 10，其PCR擴(kuò)增的異?？勺兗羟畜wA2M-AS1的產(chǎn)物大小為1242bp，序列如SEQ ID NO. 16 ;異常可變剪切體A2M-AS2的產(chǎn)物大小為3607bp，序列如SEQ ID NO. 17。
5.一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性A2M基因可產(chǎn)生異?？勺兗羟畜wA2M-AS1的核苷酸序列及其功能性單核苷酸位點(diǎn)，其特征在于其序列如SEQID NO. 12，并且擴(kuò)增片段第642bp處的單核苷酸位點(diǎn)為A或T。
6.一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性A2M基因可產(chǎn)生異常可變剪切體A2M-AS2的核苷酸序列及其功能性單核苷酸位點(diǎn)，其特征在于其序列如SEQID NO. 14，并且擴(kuò)增片段第526bp處的單核苷酸位點(diǎn)為T(mén)或C。
7.權(quán)利要求中1、2、3、4、5中任一所述的核苷酸序列及其功能性單核苷酸位點(diǎn)在奶牛乳腺炎抗性育種中的應(yīng)用。
8.影響奶牛乳腺炎易感/抗性的A2M基因功能性分子標(biāo)記位點(diǎn)在奶牛乳腺炎抗性遺傳改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法及其應(yīng)用，屬于動(dòng)物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR和同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量iTRAQ的方法提供一個(gè)奶牛乳腺炎易感/抗性A2M候選基因；通過(guò)反轉(zhuǎn)錄RT-PCR和克隆測(cè)序分析可變剪切，同時(shí)通過(guò)基因直接測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到該基因的單核苷酸多態(tài)性SNPs，利用軟件分析可變剪切和SNPs的關(guān)系，同時(shí)對(duì)體細(xì)胞評(píng)分SCS和A2M基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，判斷SNPs位點(diǎn)為功能性位點(diǎn)，選擇有利的等位基因型個(gè)體作為奶?？谷橄傺啄芰α舴N。本發(fā)明通過(guò)遺傳育種手段，可使奶牛增強(qiáng)乳腺炎的抗性，減少藥物的使用量，改善牛奶質(zhì)量安全，減少經(jīng)濟(jì)損失。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102899395SQ201210203358
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者黃金明, 王秀革, 袁金鐸, 王長(zhǎng)法, 鞠志花, 李秋玲, 齊超, 張燕, 李榮嶺, 李建斌, 侯明海, 仲躋峰 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心