專利名稱：一種脊尾白蝦微衛(wèi)星標記的3重pcr檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及脊尾白蝦微衛(wèi)星標記的PCR檢測方法，具體涉及一種脊尾白蝦微衛(wèi)星標記的3重PCR檢測方法。
背景技術：
微衛(wèi)星(microsatellites)或稱簡單序列重復(simplesequence repeats, SSR)是指由I 6個核苷酸組成的簡單串聯(lián)重復DNA序列。迄今研究過的所有生物種類中都
發(fā)現(xiàn)了它的存在，并且分布密度很大。由于微衛(wèi)星廣泛分布于基因組中，具有密度大、多態(tài)性豐富、高度雜合且穩(wěn)定性好、遵循孟德爾分離定律共顯性遺傳、易于PCR擴增等特點，已成為近年來最引人注目的新型DNA標記，并廣泛應用于生物資源的家系譜系認證、基因連鎖分析、遺傳圖譜構建、種質鑒定、種群遺傳多樣性等許多研究領域。多重PCR(MultiplexPCR)是在同一個反應中同時擴增兩個或多個位點的聚合鏈式反應。它具有提高效率，避免樣品浪費，快速周轉時間，并可大大節(jié)約實驗成本的優(yōu)點。微衛(wèi)星多重PCR技術在水產動物中已有廣泛應用，主要進行親子鑒定和遺傳多樣性分析，Patricia Novel 等已在狼S盧(Dicentrarchus labrax)、L.ei_ceteau-IC0hler等在褐蹲(Salmo trutta)、Javier Porta 等在塞內加爾鰨(Solea senegalensis)、Yan Wang等在牡蟲厲(Crassostrea virginica Gmelin)、GAO Huan 等在中國對蟲下(Fenneropenaeuschinensis)、Yutao Li等在斑節(jié)對奸(Penaeus monodon)和任憲云等在三撫梭子蟹(Portunus trituberculatus)中有相關報道。隨著脊尾白蝦人工養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，其基礎研究工作近年來逐漸開展起來，截止到目前為止，脊尾白蝦還未見有微衛(wèi)星多重PCR體系建立等方面的技術。

發(fā)明內容
針對現(xiàn)有技術中脊尾白蝦基礎研究工作缺失，給家系建立過程中遺傳參數(shù)的評估帶來困難等缺點，本發(fā)明提供了一種脊尾白蝦微衛(wèi)星標記的3重PCR檢測方法，本發(fā)明在大量微衛(wèi)星分子標記的基礎上構建了 3重PCR檢測體系，大大縮短實驗時間，提高了實驗效率，所得結果可同時反映出脊尾白蝦在多個微衛(wèi)星位點的遺傳變異。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術方案予以實現(xiàn)一種脊尾白蝦微衛(wèi)星標記的3重PCR檢測方法，它包括(I)設計并合成3重PCR引物；⑵提取基因組DNA ; (3) 3重PCR反應；(4)檢測PCR產物；其特征在于所述3重PCR反應包括3重PCR反應體系和3重PCR反應程序，所述3重PCR反應體系的引物為EC7、EC54和EC709的組合，所述各引物序列如下EC007 F:AATATGCAGTGGCAAGCT ；R: TTCCCATCATCTTCCTCC ；EC054 F:CTTTGCCCCTACTAACTGTTGC ；R:ACGACTGACCTGAGAAATCCCT ；
EC709 F:GGCTGTCCCTTGGAACTA ；R:ACGAAATCCGAATAACCC 進一步的，所述3 重 PCR 反應體系為10XBuffer 2. O μ L ；25mmol/LMgCl2L 2μ L ；10mmol/L dNTP I. 5μ L ;所述 5mmol/L 引物 EC007:F: I. 5 μ L+R: I. 5 μ L、EC054:F:05y L+R:0. 5μ L、EC709 F: I. 5 μ L+R: I. 5 μ L ；50ng/y L 脊尾白蝦基因組 DNA2· 0 μ L ;5U/ μ LTaq 聚合酶 O. 2 μ L ；ddH20 補充至 20 μ L。再進一步的，所述PCR反應程序為95°C預變性5min ;95°C變性45s，56°C退火45s，72°C延伸45s，共進行25次循環(huán)；最后72°C延伸5min ;4°C保存并結束反應。
其中，本發(fā)明采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測PCR產物。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是I、微衛(wèi)星標記由于其多態(tài)性豐富、易于檢測、呈孟德爾共顯性遺傳等優(yōu)點，是進行系譜分析和群體遺傳多樣性研究的一種比較理想的工具，但常規(guī)PCR擴增在一個脊尾白蝦檢測中只能獲得f 2個點位基因。本發(fā)明所述檢測方法是在多個多態(tài)性微衛(wèi)星標記的基礎上進行標記間組合、搭配以及實驗方法優(yōu)化，獲得更簡便、快捷的PCR檢測方法，大大縮短了實驗時間，它與常規(guī)的PCR方法相比效率提高了 3倍左右，且所得結果可同時反映出脊尾白蝦在多個微衛(wèi)星位點的遺傳變異。2、本發(fā)明可以在脊尾白蝦群體遺傳多樣性分析、親子鑒定、家系管理和良種選育進行推廣應用。結合附圖閱讀本發(fā)明的具體實施方式
后，本發(fā)明的其他特點和優(yōu)點將變得更加清
λ·Μ
/E. ο


圖I是本發(fā)明的微衛(wèi)星標記3重PCR檢測方法對脊尾白蝦8個個體的檢測圖譜，1-8 是 8 個脊尾白蝦個體，M 為 MD206-pBR322DNA/MspI DNA 分子 Marker。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細的說明。實施例I本發(fā)明提供的脊尾白蝦微衛(wèi)星標記的3重PCR構建方法如下I、以本發(fā)明提供的脊尾白蝦微衛(wèi)星富集文庫中的微衛(wèi)星核心序列為基礎，使用Primer Premier 6. O軟件在其微衛(wèi)星核心序列的兩端設計相應的PCR引物,獲得一系列具有PCR擴增產物大小不等的SSR標記。2、利用Primer Premier 6· O軟件進行引物間的評價,對顯示大部分的AG (能量變化的Gibbs)值在-4以上的引物選出備用，AG (能量變化的Gibbs)值在-4以上主要說明多重PCR體系中單對引物之間不易形成引物二聚體以及具有低發(fā)夾結構，以免影響PCR反應效率。通過對多對微衛(wèi)星標記引物間的搭配、組合，對其進行多重PCR體系的構建及測試，并對PCR實驗的反應條件和加樣參數(shù)進行優(yōu)化，從而建立了本發(fā)明所述的I組3重微衛(wèi)星PCR檢測方法。本發(fā)明的一種脊尾白蝦微衛(wèi)星標記的3重PCR檢測方法具體步驟如下
(I)、本發(fā)明所選用的3種引物序列如下
權利要求
1.一種脊尾白蝦微衛(wèi)星標記的3重PCR檢測方法，它包括(1)設計并合成3重PCR引物；(2)提取基因組DNA ; (3) 3重PCR反應；(4)檢測PCR產物；其特征在于所述3重PCR反應包括3重PCR反應體系和3重PCR反應程序，所述3重PCR反應體系的引物為EC007、EC054和EC709的組合，所述各引物序列如下EC007 F: AATATGCAGTGGCAAGCT ； R:TTCCCATCATCTTCCTCC ；EC054 F: CTTTGCCCCTACTAACTGTTGC ； R:ACGACTGACCTGAGAAATCCCT ；EC709 F: GGCTGTCCCTTGGAACTA ；R:ACGAAATCCGAATAACCC。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種脊尾白蝦微衛(wèi)星標記的3重PCR檢測方法，其特征在于所述 3 重 PCR 反應體系為10 XBuffer 2. O μ L ;25mmol/L MgCl2 I. 2 μ L ; 10mmol/L dNTPI.5μ L ;所述 5mmol/L 引物 EC007: F: I. 5 μ L + R: I. 5 μ L、EC054: F: 05 μ L + R: O. 5 μ L、EC709 F: I. 5μ L + R: I. 5 μ L ;50ng/μ L 脊尾白蝦基因組 DNA 2. O μ L ；5U/y L Taq 聚合酶 O. 2 μ L ；ddH20 補充至 20 μ L。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種脊尾白蝦微衛(wèi)星標記的3重PCR檢測方法，其特征在于所述PCR反應程序為95 °C預變性5min ;95°C變性45 s，56°C退火45 s，72°C延伸45 s，共進行25次循環(huán)；最后72°C延伸5min ;4°C保存并結束反應。
4.根據(jù)權利要求I所述的一種脊尾白蝦微衛(wèi)星標記的3重PCR檢測方法，其特征在于采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測PCR產物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種脊尾白蝦微衛(wèi)星標記的3重PCR檢測方法，它包括設計并合成3重PCR引物；提取基因組DNA；3重PCR反應；檢測PCR產物；PCR反應包括3重PCR反應體系和3重PCR反應程序。本發(fā)明建立了進行脊尾白蝦家系和親子鑒定的3重PCR反應體系，實現(xiàn)了在一個PCR反應中同時檢測3個微衛(wèi)星位點，因此與原有的PCR方法相比效率提高了3倍。本發(fā)明具有高效、經(jīng)濟、簡便易行等特點，可以在脊尾白蝦遺傳多樣性分析、親緣關系鑒定、家系管理和良種選育進行推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK102676689SQ20121019058
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月11日 優(yōu)先權日2012年6月11日
發(fā)明者劉萍, 李健, 賈舒雯 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所