專利名稱：一種用anapc13基因檢測秦川牛體型大小的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種用基因預(yù)示和檢測秦川牛體尺大小的檢測方法，該方法能夠 檢測出秦川牛體長，體高，腰高，腰角寬，胸圍和坐骨端寬。
背景技術(shù)：
秦川牛歷史悠久，公元前八世紀(jì)，關(guān)中就有“擇良牛獻(xiàn)主”的記載。勞動人民歷來用大牛作種，要求種牛要一長(軀干長)，二方(口方、尻方)，三寬(額寬、胸寬、后軀寬)，四緊(四蹄叉緊)，五短(頸短、四肢短)，非紫紅不作種用。早在1950年，中國科學(xué)院院士，東北農(nóng)學(xué)院教授許振英指出“陜西關(guān)中平原的秦川牛，全身赤褐，身長體壯，發(fā)育勻稱，無論役用肉用，可算全國最優(yōu)秀的牛種”。1950年后，經(jīng)過多年選育，特別是秦川肉牛產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目的實(shí)施，大力推動了秦川肉牛事業(yè)的發(fā)展。截止到2011年底，秦川牛及其改良牛在關(guān)中地區(qū)飼養(yǎng)量約150萬頭。秦川牛還存在著生長較慢，增重不高，尻部尖斜，大腿肌肉不夠充實(shí)，母牛乳房發(fā)育較差，產(chǎn)奶量不高等缺陷。秦川牛的發(fā)展方向應(yīng)堅(jiān)持本品種選育，糾正尻部尖斜，大腿肌肉不豐滿等外形缺點(diǎn)，提高產(chǎn)肉性能，向肉役兼用方向發(fā)展。本品種選育，并不是單純的保持原種的一切特征特性，不管它有沒有缺點(diǎn)，而是在保留其固有優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，糾正其缺點(diǎn)，使之更上一層樓，成為經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的品種。秦川牛經(jīng)過五十多年的培育，通過人工授精技術(shù)廣泛應(yīng)用，中心產(chǎn)區(qū)秦川牛的體質(zhì)外貌得到極大的改善，在中心產(chǎn)區(qū)，體高、體長、尻寬、腰寬都有不同程度的提高，特別在改良后軀上有了很大的提高，公牛后軀由尖斜轉(zhuǎn)為方型。體尺大小是評價(jià)黃牛品種優(yōu)劣和生產(chǎn)性能高低的重要指標(biāo)，而且研究牛體尺大小已經(jīng)成為一個突出的問題。在長期的選育過程中，隨著秦川牛從役用到現(xiàn)在的肉役兼用，一部分體形較小的個體已經(jīng)遭到淘汰，但選育較大體形個體仍是秦川牛肉用選育的重要目標(biāo)。對基因的多態(tài)性進(jìn)行分析，目的在于探索該基因?qū)θ馀Ｉa(chǎn)性狀的影響，為我國地方良種黃牛的肉用改良提供一定的理論依據(jù)。一直以來，科學(xué)家們都在致力于研究影響人類身高的遺傳因素，期待有一天能夠?yàn)槿祟惖纳L發(fā)育提供一定的理論依據(jù)。Weedon等人在2007年就開始研究基因組與候選基因關(guān)聯(lián)分析，但是成果不顯著。但是隨著最近基因組范圍關(guān)聯(lián)分析研究的發(fā)展(GWA)，首先在人上發(fā)現(xiàn)了很多影響身高的遺傳變異。盡管作用的機(jī)理不是很清楚，可以肯定的是，這些基因的變異引起了骨骼發(fā)育的信號通路的改變。近些年來，細(xì)胞周期和與有絲分裂相關(guān)基因的功能研究越來越多，ANAPC13，也叫做APC13，或是Swml，編碼促進(jìn)細(xì)胞分裂后期的復(fù)合體的組分之一，這是一種很大的泛素蛋白連接酶，它通過調(diào)控細(xì)胞周期的調(diào)控因子(例如B型細(xì)胞周期素)的退化來控制細(xì)胞周期的連續(xù)性。有研究表明該基因的變異顯著影響人類的身高，目前關(guān)于該基因變異的研究較少，在牛上沒有相關(guān)報(bào)道。綜上所述，國內(nèi)外大量的研究報(bào)道都證實(shí)了基因可以用來預(yù)示和檢測人的身高等外形特征，鑒于此，申請人在ANAPC13基因作為預(yù)示和檢測中國黃牛該方法能夠檢測出黃牛體長、體高、腰高、尻長、腰角寬、胸深、胸圍和坐骨端寬等指標(biāo)的候選基因方面進(jìn)行了研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種采用PCR-SSCP技術(shù)結(jié)合DNA測序的方法來檢測牛ANAPC13基因的序列，通過兩個變異位點(diǎn)基因型的分析、比較，從而預(yù)測和確定該黃牛的體型大小。本發(fā)明的目的是按照以下步驟實(shí)現(xiàn)的一種用ANAPC13基因檢測秦川牛體型大小的方法，其特征在于，包括下列步驟步驟一，采用傳統(tǒng)的酚-氯仿提取法提取秦川牛全血基因組DNA，TE緩沖液溶解， 稀釋至 IOOng/ V- Lo步驟二，根據(jù)牛ANAPC13基因序列設(shè)計(jì)一對引物ANAPC13F和ANAPC13R，其中ANAPC 13F:5， -CCTCGCCAAATGGACTCAC-3，；ANAPC 13R:5’ -GAATGCCTTTTCCCCGCTA-3J ；步驟三，利用該對弓I物ANAPC13F和ANAPC13R對牛的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增片段位于ANAPC13F和ANAPC13R表示的引物擴(kuò)增的第一外顯子區(qū)，長度為388bp，經(jīng)分析為該基因的非編碼區(qū)；步驟四，擴(kuò)增片段變性后，在10%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，銀染和顯色。步驟五，對SSCP不同帶型進(jìn)行分類，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個變異位點(diǎn)，分別位于第一外顯子17bp處的A — G突變和42bp處的C — T突變；變異的兩個位點(diǎn)確定為連鎖關(guān)系，分為三種基因型，命名為AACC、AGCT和GGTT，將其與秦川牛體尺性狀關(guān)聯(lián)分析；步驟六，分析結(jié)果顯示，AGCT型個體在體長，體高，腰高，腰角寬，胸圍和坐骨端寬均極顯著大于AACC型個體，但是三種基因型在胸深方面差異不顯著。本發(fā)明用ANAPC13基因檢測秦川牛體型大小的方法，所帶來的技術(shù)效果是I、通過檢測堿基的突變而分類的基因型。2、其中用于分析基因多態(tài)性的部位是外顯子。3、其中用于分析基因多態(tài)性的序列片段是由ANAPC13F和ANAPC13R表示的引物擴(kuò)增的第一外顯子區(qū)。4、變異的兩個位點(diǎn)確定為連鎖關(guān)系，可分為三種基因型。5,AGCT型個體在體長，體高，腰高，腰角寬，胸圍和坐骨端寬均極顯著大于AACC型個體(P〈0. 01)，說明雜合基因型為優(yōu)勢基因型。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)I)操作簡單、費(fèi)用低、精確度高，可進(jìn)行快速檢測。2)使用本發(fā)明的ANAPC13基因型對秦川牛體型大小進(jìn)行檢測時，可決定秦川牛的體長，體高，腰高，腰角寬，胸圍和坐骨端寬。3)對于培育肉用黃牛來說無疑是一個極大的優(yōu)勢，而且可以帶來顯著的經(jīng)濟(jì)效益，將為中國養(yǎng)牛業(yè)帶來廣闊的發(fā)展前景和利潤空間。


圖I是秦川牛ANAPC13基因第一外顯子PCR-SSCP ；圖2是秦川牛ANAPC13基因變異測序圖譜。以下結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)和發(fā)明人給出的具體實(shí)施例對本發(fā)明作更詳細(xì)的描述。
具體實(shí)施例方式一、實(shí)驗(yàn)材料
I.實(shí)驗(yàn)動物和性狀測定選取404同等飼養(yǎng)條件下的18 24月齡健康秦川牛母牛，每頭頸靜脈采血10mL，A⑶抗凝(V (血液):V (A⑶)=6:1)，輕微震蕩混勻后_80°C保存?zhèn)溆?，同時實(shí)地測量供試牛體高、體長、胸深、胸圍、腰高、尻長、腰角寬、坐骨端寬等體尺指標(biāo)。供試牛群分別來自西北農(nóng)林科技大學(xué)肉牛研究中心、陜西省秦川牛良種繁育中心、陜西省秦川牛保種場和陜西中寶牧業(yè)有限公司四個場區(qū)。實(shí)驗(yàn)牛所測定得性狀包括體長，從肩胛前緣(肱骨突)到同側(cè)坐骨結(jié)節(jié)后緣間的距離；體高，又稱鬌甲高，是自鬌甲最高點(diǎn)到地面的垂直高度；腰高，又稱十字部高，為兩腰角連線中點(diǎn)至地面的垂直高度；尻長，又稱臀長，為腰角前緣至坐骨結(jié)節(jié)后緣間的距離；腰角寬，兩腰角外緣間的距離；胸深，肩胛后緣胸部上、下之間的距離；胸圍，在肩胛骨后緣處作一垂線，用卷尺饒一周測量的距離；坐骨端寬，也稱臀端寬或尻寬，為兩坐骨結(jié)節(jié)外緣間的寬度。2.藥品和酶蛋白酶K購自德國默克公司；Tris飽和酚，EDTA, Tris，硼酸，甲醛，丙烯酰胺(Acr), N，N，-亞甲基雙丙烯酰氨(Bis)，二甲基亞砜(DMS0)，N，N，N，N，-四甲基乙二胺(TEMED)，含染料Reaction MIXjDNA Marker，瓊脂糖等均購自大連寶生物公司；十二烷基磺酸鈉(SDS)，去離子甲酰氨購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。3.主要儀器Gradient Cycler PTC-200基因擴(kuò)增儀，冷凍高速離心機(jī)(CENTURION,英國)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)，電泳槽、穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀、脫色搖床(六一儀器，北京)，AB204-E型電子天平、MiLLi-Q超純水儀和，日本松下微波爐及Eppendorf移液器。二、實(shí)驗(yàn)方法I、緩沖液與常規(guī)試劑的配制I) 10%SDS 10g SDS溶入90mL水中，加熱至60°C助溶，加幾滴濃HCl調(diào)節(jié)pH至
7.2，定容至 IOOmL02) lmol/L Tris .HCl (pH 8. 0):12. 114g Tris 溶入 80mL 水中，用濃 HCl 調(diào) pH 至
8.0,加水定容至IOOmL,高壓滅菌。3)0. 5mol/L EDTA (pH 8. 0):18. 61 g Na2EDTA .2H20 溶入 80mL 水中，加 NaOH 2g左右調(diào)pH至8. 0,定容至IOOmL,高壓滅菌。4) 2mol/L 的 NaCl :11. 688g 溶于水,定容至 IOOmL,高壓滅菌。5)DNA 提取液(100mL):l mol/LTris .Cl (pH 8.0)1 mL，0.5mol/L EDTA (pH 8.0)20mL, 2mol/L 的 NaCl 5mL,定容至 100mL。6 )20mg/mL蛋白酶K : 20mg蛋白酶K溶入I mL滅菌超純水中，按200 y L分裝儲存于-20。。。 7) 3mol/L乙酸鈉40. 81 g三水乙酸鈉(NaAc 3H20)溶于70mL水中用冰乙酸調(diào)pH至5. 2,加水定容至IOOmL,高壓滅菌。8) 50 X TAE (貯存液)242g Tris 堿，57. ImL 冰醋酸，IOOmL 0. 5mol/LEDTA(pH=8.0)，加雙蒸水定容至1L，工作液為I X TAE。9)抗凝劑ACD :檸檬酸0.48g、檸檬酸鈉I. 32g、葡萄糖1.47g，定容IOOmL水中，高壓滅菌。每6mL的血液中加入ImL的A⑶液。10) PBS 在 800mL 蒸餾水中溶解 8g NaCl.O. 2gKCl、l. 44g Na2HP04 和 0. 24gKH2P04，用HCl調(diào)節(jié)pH值到7. 4，加水定容到IOOOmL,高壓滅菌20min，室溫保存。2、引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)牛ANAPC13基因序列(GenBank登錄號NW 003103821 )，設(shè)計(jì)一對引物ANAPC13F和ANAPC13R，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其中ANAPC13F:5， -CCTCGCCAAATGGACTCAC-3，；ANAPC 13R :5，-GAATGCCTTTTCCCCGCTA-3，。3、?；蚪MDNA的小量提取按下列操作步驟進(jìn)行I)冰凍血樣室溫融化，將約3mL全血加入7mL離心管中，加入等體積PBS緩沖液，混勻IOmin, 12000rpm離心5min,棄上清,重復(fù)2次；2)加入 2mL STE,混勻 5-lOmin，37°C水浴 Ih ；3)加入蛋白酶K (20mg/mL)至終濃度為100 ug/uL,充分混勻；4)再加入70 ii L SDS’于56°C水浴溫和振蕩，消化過夜至看不見粘稠血塊；5)加入等體積的Tris飽和酚、蓋緊管蓋、緩慢地來回顛倒混合至少lOmin，I^OOOrpnufC 離心 IOmin ；6)將上清轉(zhuǎn)移至一新的滅菌離心管中，用Tris飽和酚重復(fù)抽提一次；7)再向上清中加入等體積的酚氯仿異戊醇(25:24:1)混合液，緩慢顛倒離心管IOmin,使溶液兩相充分混勻，12000rpm、4°C離心IOmin ；8)轉(zhuǎn)移上清至另一滅菌離心管中，加入等體積氯仿異戊醇(24:1)，同上再抽提一次；9)向所收集的上清液中加入3mL的異丙醇(pH5. 2)蓋緊管蓋，水平搖晃數(shù)次即可看到絮狀DNA沉淀；10)將DNA沉淀挑出，置于I. 5mL滅菌離心管中，加入ImL 75%的乙醇洗滌DNA沉淀兩次，12000rpm、4°C離心 IOmin ；11)小心倒掉乙醇，將離心管倒扣于紙巾上，置于37°C溫箱干燥15min ；12)待乙醇完全揮發(fā)盡，加入100-200M1 TE溶液，4°C過夜以溶解DNA。
4、PCR 反應(yīng)95°C，預(yù)變性 5min ;95°C，變性 30sec，56. 5°C，復(fù)性 30sec，72°C延伸 30sec，共 35個循環(huán)；72°C延伸IOmin。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液(5 ii L)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產(chǎn)物。5、PCR-SSCP 分析取PCR產(chǎn)物5 ii L，與8 ii L上樣緩沖液(體積分?jǐn)?shù)98%的去離子甲酰胺，質(zhì)量濃度
0.025g/L的溴酚藍(lán)，質(zhì)量濃度0. 025g/L的二甲苯菁，IOmmoI/LEDTA (pH8. 0))混合，98°C變性lOmin，迅速取出并插入冰水混合物中冰浴5 lOmin，然后分別加樣于體積分?jǐn)?shù)為10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，銀染和顯色。SSCP分析后，純化不同帶型個體的PCR產(chǎn)物，送交南 京金斯瑞生物科技有限公司測序，對測序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行比對。6、統(tǒng)計(jì)模型建立根據(jù)群體特點(diǎn)，構(gòu)建線性模型如下Yijkl= U +Gi+SJ+Bpk+Ma1+ e iJkl,式中，Yijkl :性狀觀察值，U :群體平均值，Gi :基因型固定效應(yīng)，Sj :性別固定效應(yīng)，Bpk :種場群固定效應(yīng),Ma1 :測量年齡效應(yīng)，e iJkl :隨機(jī)誤差。使用統(tǒng)計(jì)軟件SAS中的GLM程序，使用最小二乘方法檢驗(yàn)基因型與性狀間的相關(guān)程度。以下是發(fā)明人給出的實(shí)施例。實(shí)施實(shí)例I :牛ANAPC13基因多態(tài)性與秦川牛群體體尺性狀的相關(guān)利用本發(fā)明的引物(ANAPC13F和ANAPC13R)對秦川牛群體404個個體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增片段位于ANAPC13F和ANAPC13R表示的弓I物擴(kuò)增的第一外顯子區(qū)，長度為388bp，經(jīng)分析為該基因的非編碼區(qū)；擴(kuò)增片段變性后，在10%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，銀染和顯色。結(jié)果如下SSCP結(jié)果出現(xiàn)三種帶型(圖1)，對SSCP不同帶型進(jìn)行分類，分別命名為AACC, AGCT和GGTT。然后挑選不同帶型的個體送公司測序，測序結(jié)果(圖2)與NCBI提交的序列比對發(fā)現(xiàn)兩個變異位點(diǎn)，分別位于是第一外顯子17bp處的A — G突變和42bp處的C-T突變。NCBI上查詢的牛ANAPC13基因(GenBank登錄號NW_003103821 )，其第一外顯子的序列如下，放大標(biāo)出的堿基即為發(fā)生變異的位點(diǎn)GGTTCTGGCT GCGCTG A GCC AGGGCTGGCA AAGGTTTCCCG C GCCCTAGC TTAGGTAGTGTAGGAGAGGA GCACGTTCGGGTTTCGGCCG ATCCTATCGG CCGAGGTCGT TGTCCTCACCTCATCCTCATAACTACCTCC CTTACCGCAC GTCGGGAGGGTAGAAAGGGC TTACACGGCG GTCCTGGACGTCCCCCGCTTCCGCATTTGG TATAGCCCGC CTCGGGCCGG AAGCCGAGGCTGTGGGGCGG GATCCCACGCCTGTACGGAC GGTGGTGGCCCCAGAGGGTC ATATTTAGCG GGGAAAAGGC ATTCCAGGTTTGCTCTTTTAACTACAAGCT TACGGAGCTC TAAAACAGAG后來大規(guī)模測序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，兩個位點(diǎn)在98%的個體中屬于連鎖突變。因此，申請人將三種帶型分別型命名為AACC、AGCT和GGTT，將其與秦川牛體尺性狀關(guān)聯(lián)分析。表I :ANAPC13基因多態(tài)位點(diǎn)與秦川牛肉質(zhì)和胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析
權(quán)利要求
1.一種用ANAPC13基因檢測秦川牛體型大小的方法，其特征在于，包括下列步驟 步驟一，采用酚-氯仿提取法提取秦川牛全血基因組DNA，TE緩沖液溶解，稀釋至IOOng/u L ； 步驟二，根據(jù)牛ANAPC13基因序列設(shè)計(jì)一對引物ANAPC13F和ANAPC13R，其中ANAPC 13F:5’ -CCTCGCCAAATGGACTCAC-3’ANAPC 13R:5’ -GAATGCCTTTTCCCCGCTA-3’ 步驟三，利用該對引物ANAPC13F和ANAPC13R對牛的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增片段位于ANAPC13F和ANAPC13R表示的引物擴(kuò)增的第一外顯子區(qū)，長度為388bp，經(jīng)分 析為該基因的非編碼區(qū)； 步驟四，擴(kuò)增片段變性后，在10%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，銀染和顯色； 步驟五，對SSCP不同帶型進(jìn)行分類，分為三種基因型，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個變異位點(diǎn)，分別位于第一外顯子17bp處的A — G突變和42bp處的C — T突變；變異的兩個位點(diǎn)確定為連鎖關(guān)系，命名為AACC、AGCT和GGTT，將其與秦川牛體尺性狀關(guān)聯(lián)分析； 步驟六，分析結(jié)果顯示，AGCT型個體在體長，體高，腰高，腰角寬，胸圍和坐骨端寬均極顯著大于AACC型個體，但是三種基因型在胸深方面差異不顯著。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用ANAPC13基因檢測秦川牛體型大小的方法，該方法采用PCR-SSCP技術(shù)結(jié)合DNA測序來檢測牛ANAPC13基因變異位點(diǎn)。SSCP結(jié)果出現(xiàn)三種帶型，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個變異位點(diǎn)，分別位于第一外顯子17bp處的A→G突變和42bp處的C→T突變。后來測序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，兩個位點(diǎn)在98%的個體中屬于連鎖突變。因此，我們將三種帶型分別型命名為AACC、AGCT和GGTT，并在秦川牛404個體中做了分型統(tǒng)計(jì)及其與體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析。該方法是一種在DNA水平上篩查和檢測與秦川牛生長發(fā)育性狀密切相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，以用于秦川牛的輔助選擇和分子育種，加快秦川牛良種繁育速度。通過基因型的分析比較，從而預(yù)測和確定該秦川牛的體型大小，操作簡單、費(fèi)用低、精確度高，可進(jìn)行快速檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102747150SQ20121018894
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者姜碧杰, 昝林森, 王洪程, 田萬強(qiáng) 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)