專(zhuān)利名稱(chēng)：β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶工程菌的構(gòu)建及其酶的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及ー種β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶工程菌的構(gòu)建、利用該工程菌制備的嗜熱木聚糖酶及該酶在エ業(yè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的ー類(lèi)酶的總稱(chēng)。它是ー種多聚五碳糖，是植物半纖維素的重要組分，它占植物碳水化合物總量的三分之一，在自然界中是繼纖維素之后含量第二豐富的可再生生物資源。木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的ー類(lèi)酶的總稱(chēng)。它可以將木聚糖降解為寡聚木糖、木糖和少量單糖。它在飼料、造紙、食品、制藥以及能源エ業(yè)中均有著廣泛的應(yīng)用。β -1,4-內(nèi)切木聚糖酶能夠?qū)）`降解木聚糖為低聚木糖和木糖，主要從主鏈內(nèi) 部作用于木糖苷鍵。其作用方式是在不同位點(diǎn)上作用于木聚糖和長(zhǎng)鏈木寡糖，從β-1，4-D-木聚糖主鏈的內(nèi)部切割木糖苷鍵，從而使木聚糖降解為木寡糖。其水解產(chǎn)物主要為木ニ糖與木ニ糖以上的低聚木糖，也有少量的木糖、阿拉伯糖和甘露糖微生物中木聚糖酶。根據(jù)木聚糖酶催化區(qū)域的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分析，可將其分為不同的家族，其中糖苷水解酶以第10家族和第11家族居多。由于來(lái)源菌株不同而導(dǎo)致其理化性質(zhì)和分子量不盡相同，其分子量分布在7. 7-150kDa，最適pH值分布在2_11。在過(guò)去20年中，有大量的木聚糖酶被分離純化出來(lái)，它們的基因已經(jīng)被克隆，并在大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母等系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)。當(dāng)前，木聚糖酶的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，它在造紙、食品、飼料、紡織、釀酒、醫(yī)藥、環(huán)境和能源等エ業(yè)都有應(yīng)用。但能夠應(yīng)用于エ業(yè)生產(chǎn)的天然木聚糖酶卻很少，エ業(yè)用酶要求有較高的酶活性，良好的PH穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性。到目前為止，國(guó)內(nèi)有關(guān)木聚糖酶產(chǎn)生菌的報(bào)道較多，其中以真菌的研究居多，而細(xì)菌類(lèi)研究偏少。Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725是實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi)的一株木聚糖酶產(chǎn)生菌株，可以在70-75°C的條件下生長(zhǎng)，我們由此推斷它所產(chǎn)生的木聚糖酶具有良好的熱穩(wěn)定性，具備應(yīng)用于エ業(yè)生產(chǎn)的潛力。我們應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將嗜熱菌中的相關(guān)基因轉(zhuǎn)接到更易培養(yǎng)的大腸桿菌中以高效表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー是提供一種能應(yīng)用于エ業(yè)的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶；本發(fā)明的目的之ニ是提供編碼上述嗜熱木聚糖酶的基因；本發(fā)明的目的之三是提供包含上述嗜熱木聚糖酶基因的重組菌株；本發(fā)明的目的之四是提供一種制備上述嗜熱木聚糖酶的基因工程菌的構(gòu)建方法;本發(fā)明的目的之五是提供上述嗜熱木聚糖酶的應(yīng)用。本發(fā)明中的內(nèi)切木聚糖酶工程菌已于2011年12月15日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCCJii :中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。保藏編號(hào)為CGMCC No. 5596。其分類(lèi)命名為大腸埃希氏菌，拉丁名Escherichia coli。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案ー種β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶エ程菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示，命名為木聚糖酶基因Cb XynlOC0所述木聚糖酶基因Cb XynlOC來(lái)源于熱解纖維素菌(CaldicellulosiruptorbesciiDSM 6725)。上述β -1，4-內(nèi)切木聚糖酶工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟A、基因組DNA的提取 取5ml 小試管培養(yǎng)的 Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725，用細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒提取細(xì)菌的基因組，得到基因組DNA溶液；B、引物設(shè)計(jì)及用PCR法提取木聚糖酶目的基因引物設(shè)計(jì)如下上游引物5'GGGTCGCGGATCCATAGAAACTACTAAAAC 3'，劃線部分為 BamH I 的酶切位點(diǎn)；下游引物5'GGTGGTGCTCGAGTTATTCTTCTGGCACAACTG 3'，劃線部分為 Xho I 的酶切位點(diǎn)；以步驟A所得基因組DNA溶液為模板，在上述上游引物和下游引物的參與下進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用擴(kuò)增產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，得到純化的PCR產(chǎn)物，然后用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切，37°C下保溫2小時(shí)，然后用O. 8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，再用DNA凝膠檢測(cè)試劑盒回收酶切后的目的基因片段，得到CbXynlOC，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示；C、構(gòu)建重組表達(dá)載體以pET28a為載體，對(duì)載體用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切，37°C下保溫2小時(shí)，再用磷酸酶(FastAP)處理去磷酸化，反應(yīng)20分鐘，用O. 8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，用膠回收試劑盒回收線性載體片段；然后將目的基因片段與線性載體片段利用T4DNA連接酶連接，得到重組表達(dá)載體；D、將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中將步驟C所得重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)Codon Plus中，用含50 μ g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，得到含有目的基因的大腸桿菌工程菌。所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系按以下方法配制DNA聚合酶(Primer star) I μ I, DNA聚合酶緩沖液(Primer star buffer) 20 μ 1，作為模板的基因組DNA溶液2 μ 1，2. 5mM脫氧核苷酸混合物(dNTP)8y 1，上下游引物各加40pmol，加超純水至總體積ΙΟΟμ I ;所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性3min ;然后95°C變性30s，57°C退火10s，72°C延伸120s，再72°C延伸15min，共30個(gè)循環(huán)。步驟C所述的用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切的酶切體系包括ロ已丁28&空載體45レ1，上下游引物各2 4 l，F(xiàn)D-buffer 7 μ 1，加ddH2014 μ I至總體積70 μ I。所述的脫氧核苷酸混合物是脫氧腺嘌呤苷酸、脫氧鳥(niǎo)嘌呤苷酸、脫氧胞嘧啶核苷酸和脫氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，每種核苷酸的濃度均為25nmol/L。
所述的嗜熱木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，該嗜熱內(nèi)切木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為68°C,最適pH為6. 7。上述的嗜熱木聚糖酶的制備方法是，將含有目的基因的大腸桿菌工程菌進(jìn)行放大培養(yǎng)，然后通過(guò)超聲破碎、對(duì)雜蛋白熱失活，并通過(guò)進(jìn)一歩的分離純化，即得到嗜熱木聚糖酶。上述的嗜熱木聚糖酶用于造紙、食品、飼料、紡織和能源的生產(chǎn)領(lǐng)域中。熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)是一株極度嗜熱的細(xì)菌，可以降解纖維素，半纖維素，其最適生長(zhǎng)溫度為75°C。菌種購(gòu)買(mǎi)于德國(guó)微生物菌種保藏中DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultureru ，通過(guò)NCBI 對(duì)熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的全基因組進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)其全基因組的701714-703783區(qū)域的核苷酸可以編碼ー種木聚糖酶，該段基因序列我們命名為木聚糖酶基因 Cb XynlOC。但是 Caldicellulosiruptor besciiDSM 6725 是一種厭氧菌，需要 在嚴(yán)格厭氧條件下培養(yǎng)，且培養(yǎng)方法復(fù)雜，如果直接用該菌株來(lái)生產(chǎn)此木聚糖酶不僅生產(chǎn)成本高而且周期長(zhǎng)，滿(mǎn)足不了エ業(yè)應(yīng)用，因此，我們嘗試將該基因?qū)胍着囵B(yǎng)、可快速繁殖的大腸桿菌內(nèi)，可解決該問(wèn)題，滿(mǎn)足エ業(yè)需求。


圖I是純化得到的木聚糖酶Cb XynlOC的電泳圖；圖2是木聚糖酶Cb XynlOC的pH-活力曲線；圖3是木聚糖酶Cb XynlOC的溫度-活力曲線；圖4是木聚糖酶Cb XynlOC的熱穩(wěn)定性-活力曲線；圖5是木聚糖酶Cb XynlOC的底物特異性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :嗜熱酶工程菌的構(gòu)建及酶的表達(dá)一、目的基因提取，引物設(shè)計(jì)及用PCR法提取木聚糖酶目的基因取5ml 小試管培養(yǎng)的 Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725，用細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒提取細(xì)菌的基因組，所得染色體DNA溶液放4°C冰箱備用。嗜熱細(xì)菌Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 基因組中的 701714-703783區(qū)域的核苷酸可以編碼一種木聚糖酶。選擇如表SEQ ID No. I所示的XynlOC作為研究對(duì)象。根據(jù)基因的序列及載體的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)而設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)引物，委托上海生エ生物工程公司合成。該引物用以擴(kuò)增上述得到的基因組。上游引物5'GGGTCGCGGATCCATAGAAACTACTAAAAC 3'，劃線部分為 BamH I 的酶切位點(diǎn)；下游引物5'GGTGGTGCTCGAGTTATTCTTCTGGCACAACTG 3'，劃線部分為 Xho I 的酶切位點(diǎn)；兩個(gè)引物所設(shè)置的酶切位點(diǎn)與表達(dá)載體pET28a的BamH I和Xho I相匹配。PCR反應(yīng)體系在ΙΟΟμ I反應(yīng)體系中含有1μ I Primer star DNA聚合酶，Primerstar buffer20 μ I,模板 DNA 2 μ I, 2. 5mM dNTP 混合物(姆種核苷酸濃度 25nmol/L)8y 1，上下游引物各加40pmol，加ddH20至總體積ΙΟΟμ L· PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性IOmin ;循環(huán)程序?yàn)?5°C變性30s，57°C退火10s，72°C延伸120s ;最后再72°C延伸15min，共30個(gè)循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，分子量大小為2070bp，與預(yù)測(cè)的結(jié)果ー致。使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。將純化的PCR產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切。37°C下保溫2小吋。酶切完畢后用O. 8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，再用DNA凝膠檢測(cè)試劑盒回收酶切后的DNA片段。用同樣的限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Xho I來(lái)酶切pET28a載體，反應(yīng)體系為70 μ 1，體系包括pET28a 空載體 45 μ I，Nco I 和 Xho I 各 2 μ I，F(xiàn)D-buffer 7 μ I，加 ddH2014 μ I至總體積70 μ I。37°C下保溫2小時(shí)，用磷酸酶(FastAP)處理去磷酸化，反應(yīng)20分鐘，用O. 8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，應(yīng)用膠回收試劑盒回收。ニ、重組載體的制備及在宿主細(xì)菌中的表達(dá) 將處理過(guò)的目的基因片段與線性載體片段利用T4DNA連接酶(NEB公司)連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)Codon Plus中，用含50 μ g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選。隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與報(bào)道的一致，證明目的基因已經(jīng)與載體連接并轉(zhuǎn)化到宿主中。測(cè)序正確后,提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Escherichia coli BL21 (DE3) CodonPlus中進(jìn)行表達(dá)pET28a-cbxynlOC-his。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌接種到5ml含有50ug/ml卡那霉素的培養(yǎng)液中37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；次日接種到IOOml新鮮的含卡那霉素的2YT培養(yǎng)基中，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h。將初步放大的種子液以1%的比例接入IL的2YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37°C，120rpm/min),其中加入了 100mg/ml的卡那霉素，當(dāng)OD600達(dá)到O. 8左右時(shí)加入200mg/ml的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，降低培養(yǎng)溫度至25°C，對(duì)菌體進(jìn)行誘導(dǎo)使其產(chǎn)生大量目的蛋白，同時(shí)避免產(chǎn)生酶的包涵體，培養(yǎng)16小時(shí)后收獲菌體。IOOOOrpm, IOmin離心收集菌體；加入50mM, pH8. O的Tris-HCl緩沖液重懸菌體；超聲破碎(IsX Is, 30min);破碎液在55°C下熱失活30min ；4°C, 13000rpm離心30min,取上
清即為粗酶液。因?yàn)樗磉_(dá)的目標(biāo)蛋白N-端含有組氨酸標(biāo)簽，應(yīng)用鎳親和柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，用IM咪唑洗脫與柱料結(jié)合的重組酶，洗脫體積為10ml。洗脫液過(guò)夜層析后產(chǎn)生沉淀；4 °C, IOOOOrpm, IOmin離心得到上清，即為目的酶；在ρΗ7· O、溫度55°C條件下，以O(shè)at-spelt為底物測(cè)定不同處理后的酶活力以及相應(yīng)的蛋白濃度(蛋白濃度通過(guò)Bradford法測(cè)定，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品)，得到不同處理后的蛋白純化表，如表I所示。應(yīng)用SDS-PAGE(12%)電泳檢測(cè)重組蛋白的純度，可見(jiàn)70KDa附近可見(jiàn)一條電泳條帶，如圖I所示。實(shí)施例2 :重組木聚糖酶Cb XynlOC的活性分析使用DNS法分析重組木聚糖酶活性。在pH6. 7，68°C條件下，300 μ I的反應(yīng)體系包括5uL適當(dāng)稀釋的酶液，150uLl%的底物(g/100mL)，60 μ I緩沖液(20mM)和85 μ I ddH20 ；反應(yīng)5min，加入600 μ I DNS終止反應(yīng)；沸水煮5min，冷卻。540nm測(cè)定OD值，以木糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶活力。I個(gè)酶活単位(U)定義為在給定條件下每分鐘降解1%的木聚糖溶液釋放Iumol還原糖所需要的酶量。實(shí)施例3 :重組木聚糖酶Cb XynlOC的性質(zhì)測(cè)定
—、重組木聚糖酶Cb XynlOC的最適pH的測(cè)定方法如下最適pH的測(cè)定是以寬范圍pH緩沖液(成分為こ酸、N-2-羥こ基哌嗪-N' _2_こ磺酸、N-三羥甲基甲基-3-氨基丙磺酸、3-環(huán)已胺基丙磺酸、2-碼啉こ磺酸)為反應(yīng)體系，在60°C精確配制濃度為IOOmM不同pH值的緩沖液。以O(shè)at-spelt作為底物，測(cè)定酶在上述pH條件下活力的變化。結(jié)果如圖2所示，表明Cb XynlOC的最適pH為6.7，在pH6. 0-8. 5的范圍內(nèi)，酶活性可以維持最大酶活性的60%以上。ニ、重組木聚糖酶Cb XynlOC的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的測(cè)定方法最適溫度是以O(shè)at-spelt作為反應(yīng)底物，在寬范圍緩沖液(ρΗ6· 7)體系及40_85°C的溫度范圍內(nèi)測(cè)定磷酸三酯酶活力。熱穩(wěn)定性測(cè)定為木聚糖酶在不同溫度下處理不同時(shí)間，再在55°C下進(jìn)行酶活測(cè)定。酶反應(yīng)最適溫度測(cè)定結(jié)果(圖3)表明最適溫度為68°C。酶的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)表明如圖4所示，表明木聚糖酶在55°C下穩(wěn)定性非常好，在60°C下保溫50min仍然可以保持50%的酶活力。三、金屬離子對(duì)酶活力的影響在酶促反應(yīng)體系中加入不同濃度的不同的金屬離子(主要包括Mg2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+，Mn2+、Cu2+、Fe3+)，研究其對(duì)酶活性的影響，在最適條件(68°C、pH6. 7)下測(cè)定酶活性。結(jié)果表明ニ價(jià)金屬離子在ImM條件下，部分離子有較大抑制作用，IOmM條件下各離子普遍對(duì)其有較大的抑制作用。不同濃度條件下它們對(duì)酶活力的影響如表2所示。四、底物特異性分別以Birchwood, Beechhood, Oat Spelts, CMC (低粘度)為底物，在 68°C，ρΗ6· 7的條件下測(cè)定Cb XynlOC的底物特異性。用實(shí)施例2中的反應(yīng)體系，每種底物測(cè)定3組平行數(shù)據(jù)，取平均值為酶活力值，以底物對(duì)相對(duì)酶活力作圖即得Cb XynlOC底物特異性曲線，如圖5所示。木聚糖酶對(duì)不同底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表3所示。五、木聚糖酶的Kcat和Km值測(cè)定方法如下分別以不同濃度Birchwood, Beechhood, Oat Spelts作為底物,在寬范圍緩沖液(PH6. 7)緩沖體系中，68°C下測(cè)定酶活性，計(jì)算Km和Kcat值。經(jīng)測(cè)定，Birchwood的 Km 為 3. 29mg/ml, Kcat 為 222. 9s_l,最大反應(yīng)速度為 0. 00457umol/s ；Beechhood 的 Km 為 2. 34mg/ml, Kcat 為 315. 4s_l,最大反應(yīng)速度為 0. 00534umol/s ；0at Spelts 的 Km 為 3. 41mg/ml, Kcat 為 215. 9s_l,最大反應(yīng)速度為0.00516umol/s。表I.木聚糖酶Cb XynlOC的蛋白純化表
權(quán)利要求
1.一種￠-1,4-內(nèi)切木聚糖酶工程菌，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，命名為木聚糖酶基因Cb XynlOC0
2.如權(quán)利要求I所述的￠-1,4-內(nèi)切木聚糖酶工程菌，其特征在于所述木聚糖酶基因 Cb XynlOC 來(lái)源于熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)。
3.如權(quán)利要求I所述的一種￠-1,4-內(nèi)切木聚糖酶工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟 A、基因組DNA的提取 取5ml小試管培養(yǎng)的Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725,用細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒提取細(xì)菌的基因組，得到基因組DNA溶液； B、引物設(shè)計(jì)及用PCR法提取木聚糖酶目的基因 引物設(shè)計(jì)如下 上游引物5' GGGTCGCGGATCCATAGAAACTACTAAAAC 3'，劃線部分為 BamH I 的酶切位點(diǎn)； 下游引物5' GGTGGTGCTCGAGTTATTCTTCTGGCACAACTG 3'，劃線部分為 Xho I 的酶切位點(diǎn)； 以步驟A所得基因組DNA溶液為模板，在上述上游引物和下游引物的參與下進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用擴(kuò)增產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，得到純化的PCR產(chǎn)物，然后用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切，37°C下保溫2小時(shí)，然后用0. 8 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，再用DNA凝膠檢測(cè)試劑盒回收酶切后的目的基因片段，得到CbXynlOC，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示； C、構(gòu)建重組表達(dá)載體 以pET28a為載體，對(duì)載體用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切，37°C下保溫2小時(shí)，再用磷酸酶(FastAP)處理去磷酸化，反應(yīng)20分鐘，用0. 8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，用膠回收試劑盒回收線性載體片段； 然后將目的基因片段與線性載體片段利用T4DNA連接酶連接，得到重組表達(dá)載體； D、將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中 將步驟C所得重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3) Codon Plus中，用含50y g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，得到含有目的基因的大腸桿菌工程菌。
4.如權(quán)利要求3所述的￠-1,4-內(nèi)切木聚糖酶工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系按以下方法配制DNA聚合酶(Primer star) Iu I, DNA聚合酶緩沖液(Primer star buffer) 20 u 1，作為模板的基因組DNA溶液2 yl，2. 5mM脫氧核苷酸混合物(dNTP)8 ii 1，上下游引物各加40pmol，加超純水至總體積100 U I ;所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性3min ;然后95°C變性30s，57°C退火10s，72°C延伸120s，再72°C延伸15min,共30個(gè)循環(huán)。
5.如權(quán)利要求3所述的￠-1,4-內(nèi)切木聚糖酶工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于步驟C所述的用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切的酶切體系包括pET28a空載體45 yl，上下游引物各2iil，F(xiàn)D-buffer 7yl，加ddH20 14 u I至總體積70u I0
6.如權(quán)利要求3所述的￠-1,4-內(nèi)切木聚糖酶工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述的脫氧核苷酸混合物是脫氧腺嘌呤苷酸、脫氧鳥(niǎo)嘌呤苷酸、脫氧胞嘧啶核苷酸和脫氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，每種核苷酸的濃度均為25nmol/L。
7.一種用權(quán)利要求I或3所述的P -1,4-內(nèi)切木聚糖酶工程菌制備的嗜熱木聚糖酶，其特征在于所述的嗜熱木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，該嗜熱內(nèi)切木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為68°C,最適pH為6. 7。
8.—種如權(quán)利要求7所述的嗜熱木聚糖酶的制備方法，其特征在于將含有目的基因的大腸桿菌工程菌進(jìn)行放大培養(yǎng)，然后通過(guò)超聲破碎、對(duì)雜蛋白熱失活，并通過(guò)進(jìn)一步的分離純化，即得到嗜熱木聚糖酶。
9.一種如權(quán)利要求7所述的嗜熱木聚糖酶的應(yīng)用，其特征在于所述的嗜熱木聚糖酶用于造紙、食品、飼料、紡織和能源的生產(chǎn)領(lǐng)域中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶工程菌的構(gòu)建及其酶的應(yīng)用。β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶基因來(lái)源于熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，命名為木聚糖酶基因Cb Xyn10C。本發(fā)明采用生物工程技術(shù)，通過(guò)細(xì)菌的培養(yǎng)、目的基因提取、構(gòu)建表達(dá)載體、及將載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中等步驟構(gòu)建成β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶工程菌。再將含有目的基因的大腸桿菌工程菌進(jìn)行放大培養(yǎng)，然后通過(guò)超聲破碎、對(duì)雜蛋白熱失活，并通過(guò)進(jìn)一步的分離純化，獲得嗜熱木聚糖酶。本發(fā)明中的嗜熱木聚糖酶具有很好的熱穩(wěn)定性，可用于造紙、食品、飼料、紡織和能源的生產(chǎn)領(lǐng)域中。
文檔編號(hào)C12N9/42GK102816728SQ201210174569
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月30日
發(fā)明者馮雁, 謝云龍, 田東升, 安嬌, 楊廣宇 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)