專利名稱：檢測OTOF基因c.3399C>A突變的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，具體涉及用于檢測OTOF基因突變的試劑盒；本發(fā)明還涉及新的OTOF突變基因及其在診斷和/或治療感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙(Auditory Neuropathy SpectrumDisorders, ANSD)是由第VDI頡神經(jīng)的聽支受損而引起的一種特殊的感音神經(jīng)性聾。表現(xiàn)為聲音可以通過外耳、中耳正常的進(jìn)入到內(nèi)耳，但聲音信號不能同步地從內(nèi)耳傳輸?shù)酱竽X的聽功能異常性疾病。臨床聽力檢查表現(xiàn)為誘發(fā)性耳聲發(fā)射正常、聽性腦干反應(yīng)嚴(yán)重異常的一組聽功能障礙癥候群。聽神經(jīng)病譜系障礙多自幼年或青春期起病，在高危嬰幼兒中發(fā)病 率約為O. 23%，在各種原因所致的ABR異常的聾病患兒中的發(fā)病率高達(dá)11%，無性別差異。目前研究表明，聽神經(jīng)病譜系障礙的發(fā)病主要和遺傳、免疫、感染、中毒、代謝等相關(guān)因素相關(guān)。按照是否合并其他系統(tǒng)疾病可將遺傳性聽神經(jīng)病譜系障礙分為兩類一類是合并有其它顱神經(jīng)和/或周圍神經(jīng)病損的綜合征型疾病，如Charot Marie Tooth綜合征CMT1型(脫髓鞘型)及CMT2型(軸突型)、費(fèi)里德賴希共濟(jì)失調(diào)綜合征等；另一種是僅有聽力下降表現(xiàn)的非綜合征型聽神經(jīng)病譜系障礙。非綜合征型聽神經(jīng)病譜系障礙由于表型單一，基因型與表型之間有較好的對應(yīng)關(guān)系，逐漸成為近年來的研究熱點(diǎn)。Starr等根據(jù)發(fā)病部位的不同將其分為TYPE I型(病變部位在聽神經(jīng))和TYPE II型(病變部位在內(nèi)毛細(xì)胞及突觸)。按照遺傳模式的不同可將遺傳性聽神經(jīng)病譜系障礙分為常染色體顯性遺傳(AUNAl)、常染色體隱性遺傳(NSRAN)和X連鎖隱性遺傳(AUNXl)以及線粒體DNA突變等。2003年，Varga等運(yùn)用連鎖分析的方法，將四個(gè)家系定位在包含OTOF基因所在的2p23區(qū)域內(nèi)，確定OTOF為第一個(gè)發(fā)現(xiàn)且較為常見的與非綜合征型聽神經(jīng)病譜系障礙相關(guān)的基因。OTOF基因DNA序列全長101496bp，包含48個(gè)外顯子，定位于2p23。OTOF基因的編碼區(qū)，含終止密碼子如SEQ ID NO. I所示。OTOF長亞型變異體的mRNA長度為7172bp，所編碼的蛋白質(zhì)otoferlin (如SEQ ID NO. 2所示)包含1997個(gè)氨基酸，可能參與突觸囊泡的融合。Otoferlin具有6個(gè)I丐離子結(jié)合區(qū)域(C2domain),其中后4個(gè)含有完整的5個(gè)天冬氨酸殘基，可以與鈣離子結(jié)合，且存在I個(gè)羧基端跨膜區(qū)域(TM)，這些結(jié)構(gòu)在脊椎動物都是高度保守的。2006年，Petit教授研究小組觀察到小鼠otof基因編碼的蛋白質(zhì)otoferlin在耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞與傳入神經(jīng)元所形成的帶型突觸處呈高表達(dá)。敲除otof基因的純合小鼠表現(xiàn)為極重度耳聾，其內(nèi)毛細(xì)胞帶型突觸形態(tài)保持正常，鈣離子流通也正常，但是突觸囊泡的胞吐作用卻完全廢止，因此得出結(jié)論otof基因編碼的蛋白質(zhì)otoferlin作為一種鈣離子感應(yīng)器，在內(nèi)毛細(xì)胞帶型突觸處觸發(fā)膜融合，從而在內(nèi)毛細(xì)胞突觸囊泡的胞吐過程中發(fā)揮著重要作用。因此由該基因突變導(dǎo)致的感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者病變部位多在耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞或突觸，人工耳蝸手術(shù)治療效果較好。而國內(nèi)外對于聽神經(jīng)病譜系障礙患者OTOF基因的篩查發(fā)現(xiàn)，攜帶有該基因突變的聽神經(jīng)病譜系障礙患者臨床多以TypeII型表現(xiàn)為主，適合于人工耳蝸植入手術(shù)治療并可取得良好的效果。而TYPE I型聽神經(jīng)病譜系障礙患者病變部位在聽神經(jīng)，位置深在，目前尚無有效的治療方法。因此，利用對聽神經(jīng)病譜系障礙患者的OTOF基因的檢測進(jìn)行輔助分型，對于臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供用于檢測OTOF基因c. 3399C>A突變的試劑盒，其技術(shù)方案為一種用于檢測與感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙相關(guān)的位于OTOF基因的c. 33990A突變的試劑盒，所述試劑盒包括；從待測樣品中提取DNA的試劑； 用于擴(kuò)增樣本DNA的PCR反應(yīng)試劑；對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序的試劑；其中，所述擴(kuò)增樣本DNA的PCR反應(yīng)試劑包括PCR引物，所述PCR弓丨物擴(kuò)增的目標(biāo)片段包含OTOF基因第3399位堿基。具體地，上述PCR引物為選自0T0F-F-1 (SEQ ID NO. 3) :5’ -CAGATCATGGCAAACAACTCAT-3’，0T0F-R-1 (SEQ ID NO. 4) :5’ -GGGATGACAAGCCACTTCC-3’ ；0T0F-F-2 (SEQ ID NO. 5) :5’ -TTTCCCTGTCTCCCCAGAT-3’，0T0F-R-2 (SEQ ID NO. 6) :5’ -CCTCCTGGGTCCTCAGACT-3’ ；0T0F-F-3 (SEQ ID NO. 7) :5’ -CTCTCCTACCCATCCTGACCA-3’，0T0F-R-3 (SEQ ID NO. 8) :5’ -GGGACATGGGAGTGCGACTT-3’ ；0T0F-F-4 (SEQ ID NO. 9) :5，-CTGGGGGCGTGGTCCTTAG-3，，0T0F-R-4 (SEQ ID NO. 10) :5，-CAGGAGCCTGGGTCTGCTG-3，；中的一對。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述試劑盒用于檢測位于OTOF基因的c. 33990A突變的方法，包括以下步驟I)采集待測個(gè)體的血液、體液或組織樣本，提取DNA ；2)以該DNA為模板，以PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；其中，所述PCR引物擴(kuò)增的目標(biāo)片段包含OTOF基因第3399位堿基；3)將得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，并將測序結(jié)果與OTOF正?；虻男蛄羞M(jìn)行比較，確定是否存在OTOF基因的c. 33990A突變位點(diǎn)。進(jìn)一步地,上述方法還包括下述步驟4)按照正常閱讀框架進(jìn)行翻譯以確定c. 33990A突變使氨基酸序列第1133位的酪氨酸發(fā)生無義突變(P. Y1133X)。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供上述試劑盒在用于檢測感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙中的用途，將為在感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者中開展易感基因篩查提供方便確實(shí)的方法；同時(shí)可以指導(dǎo)臨床治療，并為將來利用這一突變作為靶點(diǎn)開展耳聾的基因治療提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
使用本發(fā)明的試劑盒的檢測方法為通過檢測來自于患者的待測樣本中是否存在OTOF基因c. 33990A突變，而判斷該患者感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙發(fā)生原因及類型。其中，OTOF基因的c. 33990A堿基突變使氨基酸序列第1133位的酪氨酸發(fā)生無義突變(P. Y1133X)，使氨基酸的編碼提前終止，形成Otoferlin的截短肽鏈，喪失其功能，不成熟的表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)啟動體內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制，使變異的mRNA降解。OTOF基因突變相關(guān)的感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙以常染色體隱性遺傳的方式傳遞。發(fā)明人應(yīng)用候選基因篩查的方法對17例非綜合征型聽神經(jīng)病譜系障礙患者和100例聽力正常且無家族史的對照進(jìn)行篩查，在一例聽神經(jīng)病譜系障礙患者發(fā)現(xiàn)OTOF基因的c. 33990A突變，OTOF基因突變與聽神經(jīng)病譜系障礙表型共分離。目前國際上報(bào)道與感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙相關(guān)的突變有80余種，尚無c. 33990A突變的報(bào)道。圖I給出OTOF編碼區(qū)氨基酸與核酸堿基的對照圖，并示出突 變位點(diǎn)(方框標(biāo)記處)，該突變使位于OTOF基因編碼區(qū)的第3399位的C堿基突變?yōu)锳堿基，使得第1133位編碼的酪氨酸發(fā)生無義突變，在第1133位的氨基酸密碼子變?yōu)榻K止密碼子，突變發(fā)生后基因表達(dá)產(chǎn)物由正常的1997個(gè)氨基酸變成了 1132個(gè)氨基酸肽鏈。截?cái)嗟陌被犭逆渾芋w內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制，使變異的mRNA降解。檢測該突變可用本領(lǐng)域的任何檢測點(diǎn)突變的方法來進(jìn)行，例如PCR (聚合酶鏈反應(yīng))一測序法、采用標(biāo)記的OTOF基因DNA探針雜交法或用限制性片段長度多態(tài)性方法或序列特異性引物的方法等等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用PCR擴(kuò)增-直接測序法來檢測樣本，具體包括下述步驟I)采集待測個(gè)體的樣本，例如血液、體液或組織，提取基因組DNA ；2)以該DNA為模板，以針對OTOF基因或OTOF編碼區(qū)第3399位堿基附近設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3)將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序分析，將所得到的序列與OTOF正常基因的序列進(jìn)行比較，確定是否存在OTOF突變位點(diǎn)。4)根據(jù)以上結(jié)果判斷待測個(gè)體是否為OTOF基因突變c. 33990A導(dǎo)致的聽神經(jīng)病
譜系障礙。進(jìn)一步的，該方法可以選擇性的包括如下步驟5)按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定氨基酸是否存在自第1133位酪氨酸的無義突變，在第1133位的氨基酸密碼子變?yōu)榻K止密碼子(p. Y1133X)。在發(fā)明人進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，通過聾病門診及資源收集網(wǎng)絡(luò)收集各種感音神經(jīng)性耳聾患者，包括聽神經(jīng)病譜系障礙患者，建立資源庫。在患者自愿的前提下，簽署知情同意書后，留取5-10ml血樣，并建立門診病歷資料庫，詳細(xì)記錄患者病情、家系中的發(fā)病情況以及聯(lián)系方式。然后，應(yīng)用酚氯仿抽提的方法提取基因組DNA，定量后入庫，-20° C保存，每份DNA樣品均詳細(xì)對應(yīng)于登記的患者臨床資料。然后，應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primerf設(shè)計(jì)引物，包含OTOF整個(gè)編碼區(qū)，應(yīng)用PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物直接測序測序引物與PCR擴(kuò)增引物相同，正反向測序，應(yīng)用ABI公司3700DNA測序儀。得到的序列與Genbank中的序列(登錄號NC_000002. 11)比較確定OTOF突變位點(diǎn)。按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定OTOF的突變位點(diǎn)。
上述步驟2所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物還可以用雜交探針來檢測，所用的雜交探針可以是與正常的OTOF核苷酸序列雜交，或與突變的核苷酸序列雜交，或與它們的互補(bǔ)序列雜交的探針。這些探針可以用放射性同位素、發(fā)色物質(zhì)或熒光物質(zhì)標(biāo)記，尤其是可利用等位基因特異探針，也可用限制性酶切的方法篩查是否存在已被確定的突變。 因此，檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的試劑選自測序檢測試劑、限制性內(nèi)切酶酶切檢測試劑、限制性長度多態(tài)性檢測試劑、序列特異性引物檢測試劑和探針雜交檢測試劑。在上述方法中使用的PCR引物可以依據(jù)已知的核苷酸序列設(shè)計(jì)，通常為15 30個(gè)堿基，GC含量為45 50%左右，在適當(dāng)?shù)臏囟认屡c末端特異性結(jié)合，其可以利用專門的計(jì)算機(jī)程序設(shè)計(jì)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件primer 3. O設(shè)計(jì)了一對PCR引物，其序列為上游引物0T0F-F-1:5’-CAGATCATGGCAAACAACTCAT-3’(nt84507_nt84528)下游引物0T0F-R-1:5，-GGGATGACAAGCCACTTCC-3，(nt84767_nt84785)
OTOF正?；虻臉?biāo)準(zhǔn)序列可以參考例如Genbank NC_000002. 11。用于檢測OTOF基因c. 33990A突變的試劑盒中可以包含以下試劑用于擴(kuò)增樣本DNA中OTOF基因或OTOF基因編碼區(qū)第3399位堿基附近的PCR引物；以及以下一種或幾種試劑的組合從待測樣品中提取DNA的試劑；PCR反應(yīng)試劑；對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測序的試劑。例如，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供一個(gè)檢測OTOF基因c. 33990A突變的試劑盒，容器內(nèi)裝有用以檢測OTOF基因c. 3399C>A突變的成分，與之同時(shí)提供的可以是經(jīng)政府藥物管理機(jī)構(gòu)審核的、有關(guān)藥品或生物制品的制造、使用及銷售信息。例如，采用PCR擴(kuò)增后，直接檢測樣品中OTOF基因c. 3399C>A突變位點(diǎn)的試劑盒，可含有擴(kuò)增引物、dNTPs、用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶及其緩沖液、或測序反應(yīng)所需試劑等的一種或多種。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，以上組分僅是示意性的，例如，所述的引物可以采用上述的一對0T0F-F-1和0T0F-R-1引物，所述用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶是能夠用于PCR擴(kuò)增的酶。所述試劑盒的使用方法主要包括如下步驟(I)提取待測血樣的DNA，利用上述的一對0T0F-F-1和0T0F-R-1引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；(2)PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后直接測序，將所得的序列與Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列比較確定突變位點(diǎn)的存在；所述步驟還可進(jìn)一步包括(3)按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定是否存在第1133位酪氨酸的無義突變，使第1133位的氨基酸密碼子變?yōu)榻K止密碼子(p. Y1133X)。該試劑盒可簡便快捷地檢測OTOF突變位點(diǎn)，從而應(yīng)用于感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙相關(guān)基因的檢測及其診斷或治療方法中。本發(fā)明也提供了 OTOF突變基因在診斷或治療人類感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙中的應(yīng)用。通過檢測來自患者的待測樣本中是否存在OTOF基因c. 33990A突變而判斷該患者的感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙發(fā)生原因及類型，進(jìn)而為臨床診斷和治療提供依據(jù)；此外，在進(jìn)一步的臨床治療方面，在檢測為發(fā)生了 OTOF基因c. 33990A突變之后，可以將正?；?qū)霐y帶突變基因的細(xì)胞并在其中表達(dá)，它可與內(nèi)源性突變基因發(fā)生重組，從而可以進(jìn)行基因治療。本發(fā)明提出了通過檢測患者中是否存在OTOF基因新的突變而診斷感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙發(fā)生的原因和類型的檢測方法，這將有利于為不同類型感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者確定個(gè)體化治療方案，避免人工耳蝸植入無效而造成的不必要的經(jīng)濟(jì)損失。下面結(jié)合附圖，通過對本發(fā)明較佳實(shí)施方式的說明，詳細(xì)描述但不限制本發(fā)明。


圖I為OTOF基因編碼區(qū)核苷酸與氨基酸的對照(NM_194248. 2，NP_919224. I):突變位于OTOF基因第3399位中一個(gè)C堿基，用方框圈起來的是突變的堿基和對應(yīng)的氨基酸， 突變后的堿基序列使氨基酸自1133位發(fā)生無義突變(下劃線部分的氨基酸)。 圖2為本發(fā)明方法中PCR反應(yīng)過程示意圖，示出了反應(yīng)溫度和時(shí)間，其中*表示每個(gè)循環(huán)降低0.5°C。圖3為本發(fā)明方法中，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳定量的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，圖中示出了定量Marker的片段位置。圖4為本發(fā)明方法中OTOF基因測序結(jié)果的局部圖，4A為雜合突變序列(患者序列)，4B為野生型序列，方框示突變位點(diǎn)位置。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用試驗(yàn)材料，如無特別說明，均為市售購買產(chǎn)品。實(shí)施例I待測血樣提取與OTOF基因編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增一、待測對象血樣DNA的制備I、研究對象對17例散發(fā)非綜合征型聽神經(jīng)病譜系障礙患者和100名無家族史的聽力正常對照按照下述方法進(jìn)行OTOF基因的篩查。17例患者中，I例患者的OTOF基因檢測發(fā)現(xiàn)患者為c. 33990A雜合突變和另外一種突變的復(fù)合雜合子。對100名聽力正常者的篩查中未發(fā)現(xiàn)c. 33990A突變者。對所有參加者詳細(xì)調(diào)查其病史以及家族史，并對其進(jìn)行體格檢查，耳科檢查包括耳鏡檢查、聽力學(xué)評估。在簽署知情同意書以后每人采集血樣5 10ml。2、基因組DNA提取采用酚氯仿抽提法。第一天I)抗凝血用PBS作I倍稀釋。2)在離心管中加入2倍體積的淋巴分離液(18° C 28° C)，上面鋪一層I倍體積已稀釋的血液，室溫，IOOOXg,離心20分鐘。3)吸棄上清液，小心吸出中間有核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)入5ml Ep管中，5000 Xg,離心10分鐘，然后用PBS洗一次。5000Xg,離心10分鐘。
4)將細(xì)胞懸于 2ml TE 緩沖液(IOmM Tris. HCl, ImM EDTA，ρΗ8· O)中，加 10% 的 SDS(十二烷基硫酸)至終濃度O. 5% (100 μ I )，蛋白激酶k 100 200yg/ml (10mg/ml )，50° C水浴3 5小時(shí)。5)用酚氯仿提取。用等體積的飽和酚，加入混勻，5000Xg，離心10分鐘。6)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入等體積酚氯仿混合物，混勻，5000 Xg,離心10分鐘。7)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入等體積氯仿異戊醇混合物，混勻，5000 Xg,離心10分鐘。8)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入1/10體積的乙酸鈉，混勻。9)加入2. 5倍體積的無水乙醇。
10)-20。C 沉淀 DNA 過夜。第二天11)高速離心，10000Xg，10 分鐘，4。C。12)棄上清液，加入75%乙醇2ml，高速離心10000 X g，5分鐘13)棄上清液，吹干。14)用 TE 緩沖液溶解(200 μ I TE/5ml 全血，400TE/10ml 全血)。15)分裝。1%瓊脂糖電泳和分光光度計(jì)定量。二、OTOF基因編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增I、引物序列上游引物0T0F-F-1:5’-CAGATCATGGCAAACAACTCAT-3’(nt84507_nt84528)下游引物0T0F-R-1:5’-GGGATGACAAGCCACTTCC-3’(nt84767_nt84785)注0T0F基因序列檢索號NC_000002. 112、PCR反應(yīng)體系的建立(表I)表10T0F基因的PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種用于檢測與感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙相關(guān)的位于OTOF基因的c. 33990A突變的試劑盒，所述試劑盒包括； 從待測樣品中提取DNA的試劑； 用于擴(kuò)增樣本DNA的PCR反應(yīng)試劑； 對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序的試劑； 其中，所述擴(kuò)增樣本DNA的PCR反應(yīng)試劑包括PCR引物，所述PCR弓丨物擴(kuò)增的目標(biāo)片段包含OTOF基因第3399位堿基。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其中所述PCR引物為選自下述引物中的一對 0T0F-F-1:5， -CAGATCATGGCAAACAACTCAT-3，, 0T0F-R-1:5’ -GGGATGACAAGCCACTTCC-3’ ；0T0F-F-2:5， -TTTCCCTGTCTCCCCAGAT-3，,0T0F-R-2:5’ -CCTCCTGGGTCCTCAGACT-3’ ；0T0F-F-3:5， -CTCTCCTACCCATCCTGACCA-3，,0T0F-R-3:5’ -GGGACATGGGAGTGCGACTT-3’ ；0T0F-F-4:5， -CTGGGGGCGTGGTCCTTAG-3，,0T0F-R-4:5， -CAGGAGCCTGGGTCTGCTG-3，。
3.如權(quán)利要求I或2所述試劑盒，所述試劑盒用于檢測位于OTOF基因的c.33990A突變的方法，包括以下步驟 1)采集待測個(gè)體的血液、體液或組織樣本，提取DNA； 2)以該DNA為模板，以PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物； 其中，所述PCR引物擴(kuò)增的目標(biāo)片段包含OTOF基因第3399位堿基； 3)將得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，并將測序結(jié)果與OTOF正?；虻男蛄羞M(jìn)行比較，確定是否存在OTOF基因的c. 33990A突變位點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求3所述試劑盒，所述方法還進(jìn)一步包括下述步驟 4)按照正常閱讀框架進(jìn)行翻譯以確定c.33990A突變使氨基酸序列第1133位的酪氨酸發(fā)生無義突變(P.Y1133X)。
5.如權(quán)利要求I所述的試劑盒在用于檢測感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測OTOF基因c.3399C>A突變的試劑盒，通過檢測患者中是否存在該突變基因而診斷感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙發(fā)生的原因和類型。該突變基因和檢測方法將有利于臨床上開展感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者的OTOF突變篩查工作，為感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者的診斷和治療提供依據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK102851360SQ20121017234
公開日2013年1月2日 申請日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者王秋菊 申請人:王秋菊, 中國人民解放軍總醫(yī)院