專利名稱：T-ggps基因在提高植物番茄紅素含量中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種基因T-GGPS的應(yīng)用，尤其涉及T-GGPS基因在提高植物番茄紅素含量中的應(yīng)用，同時還涉及T-GGPS基因在培育富含番茄紅素植株方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
番茄紅素(Lycopene)是人體血漿中最重要的類胡蘿卜素之一，是一種有效的抗氧化劑(Paolo Di Mascio et al, 1989),其與人類健康密切相關(guān),但人體自身不能合成番爺紅素，只能通過膳食補充，而水果、蔬菜是重要的來源。因此提高番茄紅素含量也是番茄品質(zhì)育種的重要目標。
目前植物體內(nèi)類胡蘿卜素代謝途徑已經(jīng)基本清楚，牦牛兒基焦磷酸合成酶(GGPSgeranylgeranyl diphosphate synthase)是3_憐酸甘油醒/丙酮酸途徑與類胡蘿卜素合成途徑分支點上的一個非常重要的酶。GGPS酶的催化產(chǎn)物GGPP是主要的類異戊二烯化合物，是植物中生長發(fā)育必須的化合物如類胡蘿卜素、赤霉素、葉綠素及苯醌等的前體物質(zhì)，它的供給對于類胡蘿卜素的合成相當(dāng)重要(Kai Ament等,2006)。Yong-sheng Liu等(2003)最早將GGPS基因初步定位于潘那利番茄(Solanum pennelliiLA716)的第4染色體末端。Kai Ament等(2006)從番茄Moneymaker中克隆了 GGPS基因(DQ267903)，并進行了原核表顏色互補功能驗證。國艷梅等(2006)對源于多毛番茄的控制果實顏色等性狀進行了 QTL定位，將多毛番茄GGPS基因與控制番茄紅素含量QTL位點(qlyc)定位在同一區(qū)間。鐘秋月等(2009)分別從多毛番茄和普通番茄中克隆了 GGPS，此基因不存在內(nèi)含子而且基因編碼區(qū)長度一致。所推導(dǎo)氨基酸序列存在13個差異位點，結(jié)構(gòu)分析顯示氨基酸變異導(dǎo)致了兩個基因的二級結(jié)構(gòu)與磷酸化位點的不同，這些差異素可能導(dǎo)致酶活性的差異， 進而導(dǎo)致下游產(chǎn)物番茄紅素的積累量的差異。類胡蘿卜代謝途徑中許多基因已得到了克隆，在大腸桿菌中構(gòu)建番茄紅素代謝途徑進行原核表達可以對這些基因進行功能驗證(Misawa et al. , 1995)。RoseM等(1988)最早建立攜帶歐文氏菌控制番茄紅素合成基因的質(zhì)粒pACCRT-EIB，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌后生產(chǎn)出番茄紅素。zhu等(1997)從擬南芥中克隆了基因GGPS5，通過在大腸桿菌中進行功能實驗驗證了其功能。Kai Ament等(2006)從番茄中克隆了 GGPS基因，并進行了原核表達顏色互補功能驗證。但不同來源的GGPS基因所轉(zhuǎn)錄的酶活性具有明顯的差異，因此獲得一種有助于提高番茄紅素的基因?qū)檫M一步開發(fā)利用番茄野生資源、品種改良提供新的思路，開拓新的研究領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種T-GGPS基因在提高植物番茄紅素含量中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的還在于提供一種制備富含番茄紅素轉(zhuǎn)基因番茄的方法。所述的基因為T-GGPS，其核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示，來自多毛番茄的近等基因系(編號TA517)，該近等基因系番茄紅素含量為93. 3mg kg'本發(fā)明提供了 T-GGPS基因在提高植物番茄紅素含量中的應(yīng)用。所述植物為番茄、西瓜、南瓜、桃、木瓜、柑橘。本發(fā)明提供了一種培育富含番茄紅素的轉(zhuǎn)基因植株的方法，是將T-GGPS基因插入表達載體，得到重組表達載體，將該重組表達載體轉(zhuǎn)化到目的植物的細胞中，在抗生素的選擇壓力下篩選陽性植株，進行培養(yǎng)。優(yōu)選地，所述抗生素為卡那霉素。上述培育方法還包括對篩選得到的陽性菌株進行PCR檢測，所用引物為 ⑶S-FATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGT ；⑶S-RTCATTGTTTGCCTCCCTGCTGCGGTTTTTC。上述培育方法還包括對陽性植株進行轉(zhuǎn)錄水平的RT-PCR檢測，所用引物為⑶SRT-FCAACCCGTGAAATCAAAAAACTCG ；⑶SRT-RCAGGTGTTCGGCGTGGTGTAG。所述的重組表達載體為PBE121-T-GGPS。所述的轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。所述目的植物為番茄。其培養(yǎng)條件為光照強度40 ii mol .IrT2-S4,溫度(25± I) °C,光周期為16h光照，8h黑暗。本發(fā)明提供了上述方法在制備富含番茄紅素植物中的應(yīng)用。本發(fā)明過表達T-GGPS基因，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番茄葉盤，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄中番茄紅素明顯增加，因此能夠作為外源基因參與培育具有富含番茄紅素的轉(zhuǎn)基因植物，具有潛在的應(yīng)用價值，適于推廣應(yīng)用。本發(fā)明為通過基因工程手段增強植物的番茄紅素含量提供了新的思路。


圖I為PCR擴增獲得GGPS基因，其中T TA517的擴增結(jié)果，即T-GGPS基因；E E6203 的擴增結(jié)果，即 E-GGPS 基因，M DNA marker DL IOObp;圖2為PBI121-GGPS載體構(gòu)建示意圖；圖3為轉(zhuǎn)基因植株的再生及開花結(jié)果圖，其中A:抗性苗；B:陽性植株生根；C :煉苗；圖4為TO代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測，其中M:DNA marker DLlOOObp; CK :野生植株；1-9:轉(zhuǎn)基因植株；圖5為Tl代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測，其中M:DNA marker DL2000bp; CK-:野生植株；CK+:質(zhì)粒 PBI121-CaMV35S ;1_11:轉(zhuǎn)基因植株；圖6為TO代轉(zhuǎn)基因植株southern檢測，其中CK+ :質(zhì)粒PBI121_CaMV35S; 1-8:轉(zhuǎn)
基因植株；圖I為轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR檢測，其中M:DNA marker DL 400bp ;其中ck為野生植株；1-11:轉(zhuǎn)基因植株；圖8為GGPS基因在轉(zhuǎn)基因番茄和野生番茄的不同部位、不同時期的表達量分析，其中圖8上圖L :葉片；F :開放的花；EF :膨大期；MG :綠熟期；TF :轉(zhuǎn)色器；RF :完熟期；圖8下圖1,3, 5，7,9, 11:轉(zhuǎn)基因植株；2，4，6，8，10，12:未轉(zhuǎn)化植株。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。若未特別指明，實施例中所用的化學(xué)試劑、原料、器材為可以通過購買獲得的市售產(chǎn)品，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例II、實驗材料
實施例中用于轉(zhuǎn)基因受體材料的番爺(Solanaceae lycopersicum)Moneymaker來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花丼研究所；普通番爺(S. esculentum)(編號E6203)和源于多毛番茄(S.hirsutum)的近等基因系(編號TA517)用來分離GGPS基因，將2份基因分別命名為E-GGPS和T-GGPS。兩個番茄品種番茄紅素含量差異顯著，分別在56. 5和93. 3mg kg—1左右，以合作研究的方式從美國康奈爾大學(xué)獲得。農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株 EHA105,表達載體 PBI121_CaMV35S,來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉所生物技術(shù)室。2、方法2. IGGPS基因的分離、表達載體的構(gòu)建果實總RNA的提取采用Invitrogen公司的TRIzol試劑盒完成；cDNA第一鏈的合成米用 Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒完成。據(jù)NCBI公布的GGPS基因cDNA (DQ267903)序列設(shè)計特異引物，引入XbaI、SmaI兩個酶切位點(引物橫線部分)并在兩端分別加上3個保護性堿基，克隆其cDNA序列。設(shè)計特異引物:GGPS-L和GGPS-R (見表I)。反應(yīng)采用25 u L擴增體系:IOOng模板DNA, 0. 5uM引物，2.5 ii L 2 XBuffer, 2. 5mM MgCl2, 0. 25mM dNTPs, I. OU Taq 聚合酶。PCR 擴增條件:94°C 預(yù)變性 3min，94°C lmin,62°C lmin,72°C I. 5min，35 個循環(huán)；72 °C IOmin0 0. 8%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測，Omega膠回收試劑盒純化回收目的基因片段，測序，來自多毛番茄模板的T-GGPS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示；來自普通番茄模板的E-GGPS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示。將GGPS基因與pMD18-T載體的連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞，PCR篩選陽性克隆，酶切驗證并測序驗證。根據(jù)引物上的兩個酶切位點，分別雙酶切GGPS基因與PBI121_CaMV35S質(zhì)粒DNA，T4DNA ligase 16°C連接16 18h，之后采用熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞中。經(jīng)PCR、酶切和測序驗證，選擇正確的克隆，并用電擊法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞中。兩個載體分別命名為PBI121-T-GGPS和PBI121-E-GGPS。2. 2農(nóng)桿菌對番茄葉盤的遺傳轉(zhuǎn)化與培養(yǎng)條件番爺?shù)倪z傳轉(zhuǎn)化采用葉盤法。將在播種培養(yǎng)基(MS 2. 2g P+sucrose (鹿糖)25g r1+Agar(瓊脂)6. 5g L^1pH 5. 8)培養(yǎng)8 IOd的無菌苗子葉切成均勻的兩段，葉背朝下在預(yù)培養(yǎng)基上(MS4. 4g L_1+Sucrose (鹿糖)30g L4+Agar (瓊脂)6. 5g L_1+Trans-zeatin(反式玉米素)Img L_1pH 5. 8),黑暗條件下進行預(yù)培養(yǎng)2 3d。從預(yù)先培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌平板上挑取單菌落，接種到含Kan(50mg -L^1)和Rif(50mg -L^1)的LB液體培養(yǎng)基中，在28 °C搖至OD6tltl=O. 6 0. 8 ;離心收集菌體，等體積液體MS培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。將外植體浸泡在農(nóng)桿菌懸浮液中IOmin后，用無菌濾紙吸干外植體上多余的農(nóng)桿菌菌液，28 °C共培養(yǎng)基(MS 4. 4g L^+Sucrose (蔗糖)30g L^+Agar (瓊脂)6. 5g L—i+Trans-zeatin (反式玉米素)Img L_1pH 5. 8)上黑暗條件下培養(yǎng)2 3d，以共培養(yǎng)后無明顯的農(nóng)桿菌為佳，操作過程中避免器械對外植體的傷害。共培養(yǎng)之后將外植體放到含有卡那霉素和特美汀的篩選培養(yǎng)基(MS 4. 4g !^+Sucrose (蔗糖)25g L klnositol(肌醇)IOOmg L ^Folic acid(葉酸)0. 5mg L :+Agar(瓊月旨)6. 5g L—i+Trans-zeatin (反式玉米素)2mg .L-1+IAA (口引哚-3-乙酸)0. 2mg *L_1+Vc (維生素 c) 50mg *L i+Kan (卡那霉素)50mg *L 1+Timentin (特美汀)200mg *L :pH 5. 6)上進行再生培養(yǎng)。始終保持50mg -r1的卡那霉素篩選外植體。長出愈傷組織后7 IOd換一次培養(yǎng)基，挑出不長愈傷并白化的葉盤；3 4周長出有明顯莖 的芽，及時切下再生芽轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上(MS 4. 4g *L ^Sucrose 25g *L ^Inositol IOOmg *L ^Folic acid 0. 5mg *L :+Agar6. 5g L i+6-BA 0. 2mg L ^Kan 25mg L ^Timentin IOOmg L :pH 5. 8)進行生根培養(yǎng)。7 IOd會看到有根長出，3 4周長成為轉(zhuǎn)基因植株。培養(yǎng)條件光照強度40 ii mol .nT2 溫度(25± I) °C,光周期為16h光照，8h黑暗。2. 3轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定(I) PCR篩選陽性植株番茄葉片基因組DNA的分離采用微量CTAB法(Williamson等，1994)。根據(jù)報告基因GUS設(shè)計引物，篩選陽性植株。設(shè)計引物=GUS-F和GUS-R(見表I)。對經(jīng)卡那霉素(Kan)初步篩選得到的陽性植株進行PCR檢測，預(yù)計PCR產(chǎn)物核苷酸序列大小為1800bp。反應(yīng)采用 25 ii L 擴增體系100ng 模板 DNA，0. 5iiM 引物，2. L10XBuffer，2. 5mM MgCl2,0. 25mM dNTPs, I. OU Taq 聚合酶。PCR 擴增條件95°C預(yù)變性 3min ;94°C lmin，62°C lmin，72°C I. 5min，35個循環(huán)；72V IOmin0 TBE電泳液中，I. 5%(w/v)瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物。(2) Southern 印跡雜交選取經(jīng)PCR鑒定呈陽性的植株大量提取基因組DNA，檢測插入到植物基因組中T-DNA的拷貝數(shù)。建立Hind III酶切反應(yīng)體系，20 y g左右的DNA被50U HindIII完全酶切后，0. 5XTBE電泳液中，0.8%(w/v)瓊脂糖凝膠分離酶切產(chǎn)物。0. 4M NaOH將凝膠中的酶切產(chǎn)物變性后，在20XSSC中將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜(Amershan)上。瓊脂糖凝膠電泳回收GUS基因，用DIG標記后作為探針；PCR擴增GUS基因引物GUSRT_F和⑶SRT-R (見表I)，片段核苷酸序列長度為526bp。按照羅氏雜交試劑盒(DIG High PrimeDNA Labeling and Detection Starter Kit I)完成 Southern 印跡雜交試驗。(3) RT-PCR分析轉(zhuǎn)基因植株總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成方法同I. 2。以報告基因GUS作為檢測的目的片段，對經(jīng)PCR鑒定得到的陽性植株進行轉(zhuǎn)錄水平的檢測；設(shè)計引物為=GUSRT-F和GUSRT-R,預(yù)計PCR產(chǎn)物核苷酸序列大小為526bp。以P-actin基因為內(nèi)標基因，分析轉(zhuǎn)T-GGPS基因植株和未轉(zhuǎn)化植株的葉片、花以及四個不同時期(膨大期、綠熟期、轉(zhuǎn)色期和完熟期)果實的GGPS基因的cDNA在不同器官中的表達差異；設(shè)計引物為EF-l_a-L和EF-I-a-R(見表I)。表I擴增所用引物
引物 Primer序列 Primer sequence (5，—3，)
GGPS-LGCTTCTAGAGGAAAAGAAAATGAGATC
GGPS-RGAGCCCXiGGCGATTC A A A ATTG ACTTT
GUS-FATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGlJS-RTCATTGTTTGCCTCCXTGCTGCGGTTT
權(quán)利要求
1.基因T-GGPS在提高植物番茄紅素含量中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為番茄、西瓜、南瓜、桃、木瓜、柑橘。
3.一種培育富含番茄紅素的轉(zhuǎn)基因植株的方法，其特征在于，將T-GGPS基因插入表達載體，得到重組表達載體，將該重組表達載體轉(zhuǎn)化到目的植物的細胞中，在抗生素的選擇壓力下篩選陽性植株，進行培養(yǎng)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，還包括對篩選得到的陽性菌株進行PCR檢測，所用引物為 ⑶S-F ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGT ； ⑶S-R TCATTGTTTGCCTCCCTGCTGCGGTTTTTC。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，還包括對陽性植株進行轉(zhuǎn)錄水平的RT-PCR檢測，所用引物為 ⑶SRT-F CAACCCGTGAAATCAAAAAACTCG ； ⑶SRT-R CAGGTGTTCGGCGTGGTGTAG。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的重組表達載體為PBE121-T-GGPS。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述目的植物為番茄。
9.如權(quán)利要求3所述的方法，其培養(yǎng)條件為光照強度40ymol ^nT2M-1，溫度24-26°C，光周期為16h光照，8h黑暗。
10.權(quán)利要求3-9所述的方法在制備富含番茄紅素植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了T-GGPS基因在提高植物番茄紅素含量中的應(yīng)用，是通過基因工程的方法在植物中過表達基因T-GGPS實現(xiàn)番茄紅素含量的增加。本發(fā)明通過構(gòu)建重組表達載體PBE121-T-GGPS，根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番茄Moneymaker，在卡那霉素的選擇壓力下篩選陽性植株；PCR、Southern雜交和RT-PCR檢測證明T-GGPS基因已經(jīng)插入到番茄基因組中并且能夠轉(zhuǎn)錄及表達，制得的轉(zhuǎn)基因番茄的番茄紅素含量明顯增加，說明T-GGPS基因?qū)Ψ阎蟹鸭t素積累起著顯著的促進作用。
文檔編號C12Q1/68GK102703478SQ201210162930
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者國艷梅, 杜永臣, 王孝宣, 高建昌 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所