專利名稱：革蘭氏陽性細菌核酸提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種革蘭氏陽性細菌核酸提取方法。
背景技術(shù)：
細菌是引發(fā)大多數(shù)感染性疾病的病原體，引起臨床細菌感染的致病菌均分為革蘭氏陽性菌和陰性菌二大類。目前為止，在人類感染的細菌譜中雖然革蘭氏陰性菌仍占有主要地位，但是革蘭氏陽性菌的感染率卻有著逐年增加的趨勢，現(xiàn)已可占到全部細菌感染的30-40%，其中95%為凝固酶陰性葡糖球菌、金黃色葡萄球菌和腸球菌。無論是用于致病微生物檢測的分子診斷技術(shù)，還是用于細菌分子生物學(xué)研究的轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)，其第一步就是模板核酸的制備，即樣品中核酸(包括RNA和DNA)的提取，這直接影響著這些檢測技術(shù)的結(jié)果。
眾所周知，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞壁等結(jié)構(gòu)有著很大的差別，革蘭氏陽性菌由于細胞壁比較難以破裂，因此在其核酸提取(尤其是RNA)方面，效果一直不很理想。目前革蘭氏陽性菌的核酸提取主要采用裂解細胞后提取核酸的方法，其中常用的破壁方法主要包括超聲研磨，加入表面活性劑或變性劑，以及一些提取試劑盒等。目前被廣泛采用的市場銷售的細菌RNA提取試劑盒產(chǎn)品是Invitrogen公司的RiboPure -Bacteria試劑盒和QIAGEN公司的PureLink RNA Mini試劑盒等。這些試劑盒的價格昂貴,操作步驟繁瑣，并且提取效果也并不理想。因此，如何從各種革蘭氏陽性菌中高效、快捷的提取核酸，已成為了目前分子診斷技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組研究等技術(shù)推廣和應(yīng)用的一個瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種破除革蘭氏陽性細菌的細胞壁的試劑。本發(fā)明提供的試劑，由提取液A和提取液B組成；所述提取液A按照如下方法制備將Tris、EDTA, SDS、Tween 80、Triton X-100、Brij 58、3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、十二烷基肌氨酸鈉、￠-巰基乙醇和水混合，得到提取液A，所述Tri s在所述提取液A中的濃度為5-20mM ;所述EDTA在所述提取液A中的濃度為5_20mM ;所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Bri j58、所述3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸鈉在所述提取液A中的濃度均為0. 05%-0. 2% (體積百分含量);所述P -巰基乙醇在所述提取液A中的濃度為0. 1-0. 5% (體積百分含量)；所述提取液B按照如下方法制備將水飽和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B，所述水飽和酚、所述乙醇和所述吡咯烷酮的體積比為(99-98) : I : I。所述提取液A和所述提取液B均為獨立包裝；所述提取液A的pH值為7. 2-7. 8，所述提取液A的pH值具體為7. 5 ；所述提取液B的pH值為5-8，所述提取液B的pH值具體為7. 5。 所述提取液A中，所述Tri s在所述提取液A中的濃度為IOmM ；
所述EDTA在所述提取液A中的濃度為IOmM ；所述SDS、所述 Tween 80、所述 Triton X-100、所述 Brij 58、所述 3_[ (3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸鈉在所述提取液A中的濃度均為0. 1% ；所述P -巰基乙醇在所述提取液A中的濃度為0.1%;所述提取液B中，所述水飽和酚、所述乙醇、所述吡咯烷酮的體積比為98 : I : I。本發(fā)明的第二個目的是提供一種破除革蘭氏陽性細菌的細胞壁的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟先將所述的試劑中的所述提取液A與革蘭氏陽性細菌混勻，再加入所述的試劑中的所述提取液B，混合，反應(yīng)，得到反應(yīng)液；離心收集上層水相，即得到去除細胞壁革蘭氏陽 性細菌裂解液。所述革蘭氏陽性細菌的菌體濕重、所述提取液A和所述提取液B的配比為I U g-5g 400 u I 400iU，所述革蘭氏陽性細菌的菌體濕重、所述提取液A和所述提取液B的配比具體為5mg 400 u I 400 u I0所述反應(yīng)時間為12-18min ;所述反應(yīng)時間具體為15min ；所述反應(yīng)溫度為60_70°C ;所述反應(yīng)溫度具體為65°C。所述離心的溫度為0_4°C ;所述離心的溫度具體為4°C ；所述離心的時間為5-10分鐘；所述離心的時間具體為5、8或10分鐘；所述離心的轉(zhuǎn)速為10000-15000rpm,所述離心的轉(zhuǎn)速具體為12000rpm,離心半徑為 10cm。在所述反應(yīng)后和所述離心前，還包括如下步驟將所述反應(yīng)液靜置的步驟；所述靜置溫度為0-4°C，所述靜置時間為2-5分鐘；所述靜置溫度具體為(TC，所述靜置時間具體為5分鐘。所述混合的方式采用震蕩混勻，所述混合的時間為10-15分鐘；所述混合的時間具體為15分鐘。在所述離心收集上層水相的步驟后，還包括將所述上層水相與氯仿混勻，得到混合液，離心收集上清液，得到去除細胞壁革蘭氏陽性細菌裂解液。所述上層水相與所述氯仿的體積比為I : (0.8-1. 5)，所述上層水相與所述氯仿的體積比具體為1:1。所述離心的溫度為0_4°C ;所述離心的溫度具體為4°C ；所述離心的時間為5-10分鐘；所述離心的時間具體為5、8或10分鐘；所述離心的轉(zhuǎn)速為10000-15000rpm，所述離心的轉(zhuǎn)速具體為12000rpm，離心半徑為 10cm。本發(fā)明的第三個目的是提供一種革蘭氏陽性細菌RNA的提取試劑。本發(fā)明提供的試劑，由所述試劑、結(jié)合液和洗滌液組成；所述結(jié)合液為濃度為4. 6M的異硫氰酸胍水溶液；所述洗滌液為70% (體積百分含量)乙醇水溶液。所述結(jié)合液和所述洗滌液的溶劑均為DEPC水。所述試劑、所述結(jié)合液和洗滌液均為獨立包裝。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種革蘭氏陽性細菌RNA的提取方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟I)將所述的方法得到的去除細胞壁革蘭氏陽性細菌裂解液、所述試劑中的所述結(jié)合液和無水乙醇混勻，得到混合液；2)將步驟I)得到的混合液過柱純化，用所述試劑中的洗滌液洗脫、收集洗脫液，即得到RNA。步驟I)中，所述去除細胞壁革蘭氏陽性細菌裂解液、所述結(jié)合液和所述無水乙醇的體積比為I :3:3;步驟2)中，所述過柱純化包括如下步驟
A、將所述步驟I)得到的混合液轉(zhuǎn)移到結(jié)合柱中，離心；B、向步驟A得到的結(jié)合柱中加入所述試劑中的所述洗滌液，離心；C、向步驟B得到的結(jié)合柱再次加入所述洗滌液，離心；D、向步驟D得到的結(jié)合柱中加入DEPC水，離心、收集洗脫液，得到RNA。步驟2)A、B、C中，所述離心的離心力均為7500_8000g，離心時間均為25-30秒，離心溫度均為23-25°C ；步驟2) D中，所述靜置時間為2-5分鐘，所述靜置溫度為23_25°C ；步驟2) E中，所述離心力為7500_8000g，所述離心時間為1-1. 5分鐘。步驟2)A、B、C中，所述離心的離心力均為8000g，離心時間均為30秒，離心溫度均為 25 0C ；步驟2) D中，所述靜置時間為2、3或5分鐘,所述靜置溫度為25°C ；步驟2) E中，所述離心力為8000g，所述離心時間為I分鐘。本發(fā)明第四個目的是提供一種革蘭氏陽性細菌基因組DNA的提取方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟I)將所述的方法得到的去除細胞壁革蘭氏陽性細菌裂解液加入RNase A消化，得到消化后溶液；2)、將步驟I)得到的消化后溶液沉淀DNA，得到基因組DNA。步驟I)中，所述消化溫度為37°C，所述消化時間為30分鐘。本發(fā)明的第五個目的是提供一種革蘭氏陽性細菌基因組DNA和RNA的提取方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟I)將所述的方法得到的去除細胞成分的核酸提取液、濃度為3M、pH值為5. 2的NaAC水溶液、無水乙醇混勻，得到混合液，2)將步驟I)得到的混合液離心收集沉淀、75%的乙醇洗滌，得到基因組DNA和總RNA混合物。步驟I)中，所述去除細胞壁革蘭氏陽性細菌裂解液、所述濃度為3M、pH值為5. 2的NaAC水溶液、所述無水乙醇的體積比為I : 0. I : 2. 5。步驟2)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為12000rpm，離心半徑為10cm，所述離心的溫度為4°C，所述離心的時間為15分鐘。步驟I)中，所述濃度為3M、pH值為5. 2的NaAC水溶液的溶劑為DEPC水。在步驟I)后和步驟2)前還包括如下步驟將所述混合液靜置的步驟；
所述靜置的時間為30分鐘，所述靜置的溫度為-20°C。所述革蘭氏陽性細菌為恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)或金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)。所述的試劑或所述的方法或所述的試劑或所述的方法在鑒定革蘭氏陽性細菌和/或檢測革蘭氏陽性細菌的基因轉(zhuǎn)錄中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護 的范圍。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供了一種高效提取革蘭氏陽性細菌核酸的方法，能夠同時提取革蘭氏陽性細菌的RNA和基因組DNA，或者選擇性提取RNA或基因組DNA，其主要特定是操作簡單，成本非常低，提取效果好，尤其在提取RNA中效果非常好，已經(jīng)優(yōu)于目前被廣泛使用的市售試劑盒。


圖I為恥垢分枝桿菌提取的核酸的甲醛變性膠電泳2為恥垢分枝桿菌提取基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖3為金黃色葡萄球菌提取的核酸的甲醛變性膠電泳圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例所用的試劑如提取液A 按照如下方法制備將 Tris、EDTA, SDS、Tween 80、Triton X-100, Brij58、3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、十二烷基肌氨酸鈉、￠-巰基乙醇和水混合，得到提取液A，所述Tris在所述提取液A中的濃度為IOmM ;所述EDTA在所述提取液A中的濃度為IOmM ;所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3- [ (3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸鈉在所述提取液A中的濃度均為0. 1% (體積百分含量);所述P -巰基乙醇在所述提取液A中的濃度為0. 1% (體積百分含量);提取液B按照如下方法制備將水飽和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B，所述水飽和酚、所述乙醇和所述吡咯烷酮的體積比為98 : I : I。提取液A的pH值具體為7. 5 ;提取液B的pH值具體為7. 5。實施例I、分枝桿菌的核酸提取分枝桿菌是一類典型的革蘭氏陽性菌，其中包含多種高危害的致病菌，例如結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌等，該類細菌的核酸提取在病原體分子診斷中具有重要意義。選取危險度較低的恥垢分枝桿菌作為模型，驗證本發(fā)明所述的核酸提取方法在革蘭氏陽性菌一恥垢分枝桿菌中的核酸提取效果。菌株恥垢分枝桿菌(拉丁名Mycobacterium smegmatis、菌株購自美國ATCC,菌株號 19420，)試劑提取液A，提取液B，氯仿，無水乙醇，75%乙醇，RNase A (7000units/ml)，結(jié)合柱(購自MN公司，產(chǎn)品目錄號740903)，結(jié)合液(濃度為4. 6M的異硫氰酸胍水溶液)，洗滌液(70% (體積百分含量)乙醇水溶液)，pH5. 2的3M醋酸鈉溶液，DEPC水，滅菌水，甲醛，溴酌■藍，MOPs (出售公司 Amresco,產(chǎn)品目錄號 Amresco M215), TBE buffer (配方 0. 09mol/LTris-硼酸 0. 002mol/L EDTA)培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基I、提取核酸I)恥垢分枝桿菌的培養(yǎng)與保存在超凈工作臺內(nèi)將恥垢分枝桿菌劃線接種于LB (Luria-Bertani Agar Medium)培養(yǎng)基平板以進行復(fù)蘇，將平板在培養(yǎng)箱中倒置，37°C孵育過夜(12h)。待長出單菌落后，挑取單菌落接種于3mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C孵育過夜，將菌液按ImL/管進行分裝，_20°C凍存?zhèn)溆谩?)去除革蘭氏陽性細菌的細胞壁A、裂解 取Iml的凍存菌液，融化后裝入1.5ml的離心管中，在室溫(25 °C )條件下12000rpm離心2分鐘，用移液槍將上清液吸走。在5mg離心沉淀物(菌體濕重)中加入400ul的提取液A，用移液槍將沉淀物重懸，使微生物充分混合在提取液A中。然后再混合物中加入400ul的提取液B，在渦旋器上劇烈震蕩2分鐘，在震蕩過程中按緊離心管的蓋子，防止菌液混合物漏出。劇烈震蕩結(jié)束后，將離心管放置于65°C的震蕩儀中，溫育I個小時，在此期間每間隔30秒劇烈震蕩5秒鐘。將裝有裂解液離心管在冰上進行冰浴5分鐘((TC)，然后將離心管在4°C的條件下，12000rpm進行離心5分鐘。離心結(jié)束后，離心管中溶液自然分層，小心將上層水相用移液槍吸出轉(zhuǎn)移至新的1.5ml的離心管中，盡量避免吸入中間的蛋白層和下層有機相溶劑。B、氯仿抽提在吸出的裝有水相離心管中加入400ul的氯仿(所述上層水相與所述氯仿的體積比具體為I : I )，將其在渦旋震蕩儀上劇烈震蕩，使水相與氯仿充分混勻。將裝有混合物的離心管在在4°C的條件下，12000rpm進行離心5分鐘。離心結(jié)束后，離心管中的溶液自然分層，小心將上層水相用移液槍吸出轉(zhuǎn)移至新的1.5ml的離心管中，盡量避免吸入中間的蛋白層和下層有機相溶劑，得到去除細胞壁革蘭氏陽性細菌裂解液。3)選擇性提取基因組DNA 將氯仿抽提得到的溶液(去除細胞壁革蘭氏陽性細菌裂解液)轉(zhuǎn)移至新的I. 5ml的離心管中，加入Iul的RNase A，在37°C的條件下反應(yīng)30分鐘，過柱純化，得到基因組DNA。CTAB法提取細菌核酸操作步驟。a)將菌株接種于液體LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜。b)取I. 5ml培養(yǎng)物與I. 5ml離心管中，12000rpm離心2min,將上清棄掉。c)向沉淀物中加入567ul的TE緩沖液，反復(fù)吹打使之重新懸浮。TE緩沖液的配置見下表
組分濃度
Tris-HCKpH 8. 0)10mmol/L
EDTA (pH 8.0)lmmol/L
d)在懸浮液中再加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，充分震蕩混勻，于37°C條件下孵育Ih。e)孵育完成后，在溶液中加入IOOul 5mol/L NaCl,充分震蕩混勻。f )再加入80ul CTAB溶液，充分震蕩混勻后在65°C條件下孵育lOmin。CTAB溶液的配置見下表
權(quán)利要求
1.一種破除革蘭氏陽性細菌的細胞壁的試劑，由提取液A和提取液B組成； 所述提取液A按照如下方法制備將Tris、EDTA, SDS、Tween 80、Triton X-100, Brij58、3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、十二烷基肌氨酸鈉、￠-巰基乙醇和水混合，得到提取液A，所述Tris在所述提取液A中的濃度為5-20mM ;所述EDTA在所述提取液A中的濃度為5-20mM;所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸鈉在所述提取液A中的濃度均為0. 05%-0. 2% (體積百分含量);所述P -巰基乙醇在所述提取液A中的濃度為0. 1-0. 5% (體積百分含量)； 所述提取液B按照如下方法制備將水飽和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B，所述水飽和酚、所述乙醇和所述吡咯烷酮的體積比為(99-98) : I : I。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑，其特征在于 所述提取液A和所述提取液B均為獨立包裝； 所述提取液A的pH值為7. 2-7. 8，所述提取液A的pH值具體為7. 5 ； 所述提取液B的pH值為5-8，所述提取液B的pH值具體為7. 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑，其特征在于 所述提取液A中，所述Tris在所述提取液A中的濃度為IOmM ； 所述EDTA在所述提取液A中的濃度為IOmM ； 所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3_[ (3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸鈉在所述提取液A中的濃度均為0. 1% ；所述P -巰基乙醇在所述提取液A中的濃度為0. 1% ； 所述提取液B中，所述水飽和酚、所述乙醇、所述吡咯烷酮的體積比為98 : I : I。
4.一種破除革蘭氏陽性細菌的細胞壁的方法，包括如下步驟 先將權(quán)利要求1-3中任一所述的試劑中的所述提取液A與革蘭氏陽性細菌混勻，再加入權(quán)利要求1-3中任一所述的試劑中的所述提取液B，混合，反應(yīng)，得到反應(yīng)液；離心收集上層水相，即得到去除細胞壁革蘭氏陽性細菌裂解液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于 所述革蘭氏陽性細菌的菌體濕重、所述提取液A和所述提取液B的配比為I U g-5g 400 u I 400iU，所述革蘭氏陽性細菌的菌體濕重、所述提取液A和所述提取液B的配比具體為5mg 400 u I 400 u I0
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于 所述反應(yīng)時間為12-18min ;所述反應(yīng)時間具體為15min ； 所述反應(yīng)溫度為60-70°C ;所述反應(yīng)溫度具體為65°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法,其特征在于 所述離心的溫度為0-4°C ;所述離心的溫度具體為4°C ； 所述離心的時間為5-10分鐘；所述離心的時間具體為5、8或10分鐘； 所述離心的轉(zhuǎn)速為10000-15000rpm,所述離心的轉(zhuǎn)速具體為12000rpm,離心半徑為IOcm0
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于在所述反應(yīng)后和所述離心前，還包括如下步驟將所述反應(yīng)液靜置的步驟；所述靜置溫度為0-4°C，所述靜置時間為2-5分鐘；所述靜置溫度具體為0°c，所述靜置時間具體為5分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述混合的方式采用震蕩混勻，所述混合的時間為10-15分鐘；所述混合的時間具體為15分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于在所述離心收集上層水相的步驟后，還包括將所述上層水相與氯仿混勻，得到混合液，離心收集上清液，得到去除細胞壁革蘭氏陽性細菌裂解液。
11.根據(jù)權(quán)利要求4-10中任一所述的方法，其特征在于 所述上層水相與所述氯仿的體積比為I : (0.8-1. 5)，所述上層水相與所述氯仿的體積比具體為I : I。
12.根據(jù)權(quán)利要求4-11中任一所述的方法，其特征在于 所述離心的溫度為0-4°C ;所述離心的溫度具體為4°C ； 所述離心的時間為5-10分鐘；所述離心的時間具體為5、8或10分鐘； 所述離心的轉(zhuǎn)速為10000-15000rpm,所述離心的轉(zhuǎn)速具體為12000rpm,離心半徑為IOcm0
13.—種革蘭氏陽性細菌RNA的提取試劑，由權(quán)利要求1-3中任一所述試劑、結(jié)合液和洗滌液組成； 所述結(jié)合液為濃度為4. 6M的異硫氰酸胍水溶液； 所述洗滌液為70% (體積百分含量)乙醇水溶液。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑，其特征在于 所述結(jié)合液和所述洗滌液的溶劑均為DEPC水。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的試劑，其特征在于所述權(quán)利要求1-4中任一所述試齊IJ、所述結(jié)合液和洗滌液均為獨立包裝。
16.一種革蘭氏陽性細菌RNA的提取方法，包括如下步驟 1)將權(quán)利要求4-12中任一所述的方法得到的去除細胞壁革蘭氏陽性細菌裂解液、權(quán)利要求13-15中任一所述試劑中的所述結(jié)合液和無水乙醇混勻，得到混合液； 2)將步驟I)得到的混合液過柱純化，用權(quán)利要求13-15中任一所述試劑中的洗滌液洗脫、收集洗脫液，即得到RNA。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述去除細胞壁革蘭氏陽性細菌裂解液、所述結(jié)合液和所述無水乙醇的體積比為1:3:3; 步驟2)中，所述過柱純化包括如下步驟 A、將所述步驟I)得到的混合液轉(zhuǎn)移到結(jié)合柱中，離心； B、向步驟A得到的結(jié)合柱中加入權(quán)利要求13-15中任一所述試劑中的所述洗滌液，離心； C、向步驟B得到的結(jié)合柱再次加入所述洗滌液，離心； D、向步驟D得到的結(jié)合柱中加入DEPC/K，離心、收集洗脫液，得到RNA。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其特征在于 步驟2)A、B、C中，所述離心的離心力均為7500-8000g，離心時間均為25-30秒，離心溫度均為23-25°C ；步驟2) D中，所述靜置時間為2-5分鐘，所述靜置溫度為23-25°C ； 步驟2) E中，所述離心力為7500-8000g，所述離心時間為1-1. 5分鐘。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18中任一所述的方法,其特征在于 步驟2) A、B、C中，所述離心的離心力均為8000g，離心時間均為30秒，離心溫度均為25 0C ； 步驟2) D中，所述靜置時間為2、3或5分鐘，所述靜置溫度為25°C ； 步驟2) E中，所述離心力為8000g，所述離心時間為I分鐘。
20.一種革蘭氏陽性細菌基因組DNA的提取方法，包括如下步驟 1)將權(quán)利要求4-12中任一所述的方法得到的去除細胞壁革蘭氏陽性細菌裂解液加入RNase A消化，得到消化后溶液； 2)、將步驟I)得到的消化后溶液沉淀DNA，得到基因組DNA。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述消化溫度為37°C，所述消化時間為30分鐘。
22.—種革蘭氏陽性細菌基因組DNA和RNA的提取方法，包括如下步驟 1)將權(quán)利要求4-12中任一所述的方法得到的去除細胞成分的核酸提取液、濃度為3M、pH值為5. 2的NaAC水溶液、無水乙醇混勻，得到混合液， 2)將步驟I)得到的混合液離心收集沉淀、75%的乙醇洗滌，得到基因組DNA和總RNA混合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述去除細胞壁革蘭氏陽性細菌裂解液、所述濃度為3M、pH值為5. 2的NaAC水溶液、所述無水乙醇的體積比為I : 0. I : 2. 5。
步驟2)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為12000rpm,離心半徑為IOcm,所述離心的溫度為4°C,所述離心的時間為15分鐘。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述濃度為3M、pH值為5. 2的NaAC水溶液的溶劑為DEPC水。
25.根據(jù)權(quán)利要求22-24中任一所述的方法,其特征在于 在步驟I)后和步驟2)前還包括如下步驟將所述混合液靜置的步驟； 所述靜置的時間為30分鐘，所述靜置的溫度為_20°C。
26.根據(jù)權(quán)利要求22-25中任一所述的方法,其特征在于 所述革蘭氏陽性細菌為恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)或金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)。
27.權(quán)利要求1-3中任一所述的試劑或權(quán)利要求4-12中任一所述的方法或權(quán)利要求13-15任一所述的試劑或權(quán)利要求16-26任一所述的方法在鑒定革蘭氏陽性細菌和/或檢測革蘭氏陽性細菌的基因轉(zhuǎn)錄中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種革蘭氏陽性細菌核酸提取方法。本發(fā)明提供一種破除革蘭氏陽性細菌的細胞壁的試劑，由提取液A和提取液B組成；由提取液A和提取液B組成；所述提取液A按照如下方法制備將Tris、EDTA、SDS、Tween 80、Triton X-100、Brij 58、3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸鈉、β-巰基乙醇和水混合，得到提取液A；所述提取液B按照如下方法制備將水飽和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供了一種高效提取革蘭氏陽性細菌核酸的方法，操作簡單，成本非常低，提取效果好，尤其在提取RNA中效果非常好，已經(jīng)優(yōu)于目前被廣泛使用的市售試劑盒。
文檔編號C12R1/34GK102796727SQ20121016264
公開日2012年11月28日 申請日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月24日
發(fā)明者張巖, 孫義民, 楊萍, 張亮 申請人:博奧生物有限公司, 清華大學(xué)