專利名稱：一種高活性固定化酶塊的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶的固定方法。具體是將酶分子固定在碳納米管上，再將碳納米管固定在泡沫狀碳塊的孔道內(nèi)，形成高酶負載量的復合酶塊。
背景技術(shù)：
酶固定化是酶工程研究和應用最為重要的領(lǐng)域之一(Liang J. F. etal. Pharm.Sci.2000,89,979-990 ;Asanomi Y.etal. Molecules 2011,16,6041-6059;Zhang B.etal. AppI. Microbiol. Biotechnol. 2012,93,61-70)。它已經(jīng)廣泛地運用到化學化工、生物技術(shù)、現(xiàn)代醫(yī)藥、環(huán)境保護等行業(yè)。然而，酶蛋白是非常脆弱的，它們?nèi)菀鬃冃允Щ睢㈦y以回收重復使用。因此，在エ業(yè) 應用上酶通常被固定在載體上，以便進行回收并改善在各種反應環(huán)境下的化學穩(wěn)定性。那些固定在載體上的酶還可以實現(xiàn)連續(xù)化反應。上述優(yōu)勢能夠有效降低生成単位產(chǎn)物酶的成本，特別是對于那些昂貴的酶達到了節(jié)約的目的。有兩類載體粒子和多孔材料。粒徑小的粒子有著更大的表面積，酶的負載能力也隨之提高。但是，它們更加難以分離、回收和重新利用。多孔材料易于回收，孔徑越小酶負載量越高，但底物和產(chǎn)物在材料中的擴散同時也遇到更大的阻礙。因此，有效解決這ー問題需要設(shè)計出一種兼?zhèn)涓弑砻娣e和大孔徑的塊狀載體。碳納米管是ー種擁有大表面積的納米級柱狀材料，它已經(jīng)在傳感器(Shi J. etal.Nanotechnology 2011,22,355502 ；Sanchez S. et al.Analyst 2007,132,142-147 ；Joshi P. P. et al. Anal. Chem. 2005，77，3183-3188)和燃料電池(Miyake T. et al. J. Am.Chem. Soc. 2011，133 :5129-5134 ;Zebda A. et al. Nat. Commun. 2011,2,370)上得到了廣泛的應用。然而，游離碳納米管雖然可利用過濾等手段進行分離，但固定在碳納米管上的酶的可回收性還沒有被エ業(yè)應用廣泛接受。本發(fā)明提供了ー種新型載體的制備方法，該載體是將泡沫狀碳塊與碳納米管的特性結(jié)合起來用于酶的固定化，它在形態(tài)上兼?zhèn)淞颂技{米管的特點(如高酶負載量)和泡沫狀碳塊性質(zhì)(如低擴散阻力)。不僅如此，這種復合酶塊可直接從溶液中取出，不需要任何分離エ序。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー是提供一種兼?zhèn)涓弑缺砻婧偷蛿U散阻カ的載體。它可以與酶分子牢固結(jié)合，由此獲得較高的酶催化活性和穩(wěn)定性。本發(fā)明的目的之ニ是制備ー種具有高催化活性的固定化酶塊。這種復合酶塊使用簡便，使用后不需要分離和再生エ序就能夠重新利用。為了達到上述目的，本發(fā)明首先將碳納米管固定在泡沫狀碳塊的孔道內(nèi)，再將酶進ー步固定在碳納米管的表面上，這樣就獲得了ー種兼有微米結(jié)構(gòu)和納米結(jié)構(gòu)的材料。其中，泡沫狀碳塊的微米孔道可以減低傳質(zhì)阻力，使底物容易擴散到酶活性部位同時使產(chǎn)物易于釋放。碳納米管的表面可負載大量的酶分子，而酶塊作為ー個整體又能夠方便地從酶催化反應溶液中取出，重新使用。這種復合酶塊需要三個步驟進行制備。具體エ藝如下在加壓的條件下，將酚醛樹脂溶液用烏洛托品進行交聯(lián)，并逐漸釋放壓カ使聚合物粘流液發(fā)泡。隨著聚合物濃度的増加和逐漸固化，氣泡被固定在聚合物中形成氣孔。繼續(xù)升高溫度，使聚合物熟化和硬化。聚合物在更高的溫度下絕氧碳化，成為多孔的泡沫狀碳塊。將碳納米管用硝酸和硫酸進行氧化，得到在外壁上帶有羧基的碳納米管。用氧化碳納米管的分散液孵育泡沫狀碳塊，碳納米管就會牢固地固定在泡沫狀碳塊的內(nèi)部孔道 中，并形成一定的共價連接。將緩沖液中酶分子(如胰蛋白酶)進ー步對新制得的碳納米管-泡沫狀碳塊載體進行孵育，酶被固定在碳納米管外壁上，形成了酶塊。所制成的酶塊具有高酶負載量和低底物擴散阻力，因此賦予了較高的催化活性。以考馬斯亮藍法檢驗酶的負載效果，結(jié)果顯示支載著碳納米管的泡沫狀碳塊的負載量是泡沫狀碳塊的228. 3 %，是玻碳片的2838. 5 %。用N- α -苯甲酰-DL-精氨酸-ρ-硝基苯胺的水解反應來估算固定化胰蛋白酶的催化活性。以分光光度計在410nm處監(jiān)測ρ-硝基苯胺的陰離子的形成。結(jié)果表明，固定在碳納米管-泡沫狀碳塊上的胰蛋白酶的活性是泡沫狀碳塊的252. 2%，是具有光滑表面的玻碳片的3552. 6 %。與其他固定酶一祥，固定在碳納米管-泡沫狀碳塊上的胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性高于相應的溶液酶。在80°C下，溶液酶幾乎喪失了活性(僅殘留全活性的1.5% )，而固定酶在此溫度下的活性殘留為71%。此外，該酶塊不需要任何分離過程就可重新使用，這樣就簡化了化工操作的程序。由于大部分酶分子埋藏在多孔載體的內(nèi)部，因此刮擦也不能使它們脫落。本發(fā)明的優(yōu)點在于I.本發(fā)明所述的方法可制造出一種酶負載量大，可接近性好的載體。2.該固定化酶具有催化活性高和熱穩(wěn)定性好的特點。催化反應后可直接從溶液中取出重新使用，不需要分離過程。3.本發(fā)明所述的方法可用于生物傳感器和生物燃料電池的電極。


圖I是碳納米管修飾泡沫狀碳塊的SEM譜圖。圖中顯示出泡沫碳塊表面上的ー個孔洞的洞ロ。整個碳塊表面被碳納米管所覆蓋。
具體實施例方式實施例I :泡沫狀碳塊制備將60g酚醛樹脂粉末和5g烏洛托品溶于200mL的こ醇中。溶液在高壓釜中以O(shè). 2V /min的速率加熱到160°C，并在160°C和I. 6MPa的氮氣壓力下保溫8h進行交聯(lián)反應。然后在160°C下以O(shè). 2MPa/h的速率釋放高壓釜中氣體，使聚合物發(fā)泡。當壓カ減至常壓后，將樣品加熱到350°C，并在此溫度下保持6h以熟化。在氬氣保護下以5°C /min的加熱速率升溫到800°C進行碳化，保溫3h后得到泡沫狀碳塊。實施例2 碳納米管的功能化將200mg多壁碳納米管懸浮于150mL濃硫酸和50mL濃硝酸的混Ife溶液中，在超聲清洗機中振湯20min?；亓?h。將懸浮液用水稀釋，并用在O. 2 μ m的聚碳酸酯膜過濾，洗滌以除去酸。上述超聲/過濾步驟重復3次。實施例3 碳納米管-泡沫狀碳塊的制備將泡沫狀碳塊在真空下灌注O. 2mg碳納米管的5mL水溶液。體系超聲振蕩5次，每次20min。碳塊繼續(xù)在碳納米管溶液中孵育20h。結(jié)合了碳納米管的泡沫狀碳塊用水反復洗滌5次，真空干燥。
實施例4 胰蛋白酶在復合酶塊中的固定化通過將凍干酶溶解到磷酸鹽緩沖液(IOmmol/L，pH 7.0)中來制備2mg/mL胰蛋白酶的水溶液。在4°C下將碳納米管-泡沫狀碳塊在5ml的胰蛋白酶溶液中孵育過夜。而后，取出固定著胰蛋白酶的碳塊，用水洗滌3次，使用前在4°C下儲存。利用 Bradford 方法(Kruger NJet al. ,Methods Mol. Biol. 1994, 32,9-15)測定固定前后胰蛋白酶溶液的蛋白質(zhì)濃度，用蛋白質(zhì)濃度的之差來計算胰蛋白酶的負載量。實施例5:催化活性檢測利用N- α -苯甲酰-DL-精氨酸-ρ-硝基苯胺作為底物來測量胰蛋白酶的活性。來自牛胰臟的胰蛋白酶催化這ー底物的水解，釋放出的P-硝基苯胺在410nm處有吸收峰。通過測量反應混合物在410nm處的吸收隨時間的變化來估算酶的活性。
權(quán)利要求
1.一種制備高活性塊狀固定化酶的工藝方法，其特征在于所述的工藝方法首先是酚醛樹脂發(fā)泡和碳化為泡沫狀碳塊，然后將多壁碳納米管負載在碳塊內(nèi)部的孔道中，最后將酶固定在碳納米管表面上，形成碳納米管-泡沫狀碳塊復合酶塊。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種制備高活性塊狀固定化酶的工藝方法，其特征在于所固定的酶是胰蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種制備高活性塊狀固定化酶的工藝方法，其特征在于復合酶塊的催化活性高于固定在泡沫狀碳塊上酶的活性，也高于固定在玻碳片上酶的活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種制備高活性塊狀固定化酶的工藝方法，其特征在于在80°C下復合酶塊的催化活性高于溶液胰蛋白酶的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種制備高活性塊狀固定化酶的工藝方法，其特征在于所制備酶塊在使用后能方便取出，不需要任何分離工序；酶塊反復使用10次，酶活性的保留不低于80%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備高活性固定化酶塊的制備方法。所述的制備方法首先是制備出一種泡沫狀的碳塊，然后將多壁碳納米管負載在泡沫狀碳塊內(nèi)部的孔道中，最后將胰蛋白酶固定在碳納米管的表面上。泡沫狀碳塊孔道中的碳納米管可固定大量酶分子，而泡沫狀碳塊孔道又為酶活性部位周圍底物的擴散和產(chǎn)物的釋放提供了通道。該酶塊可在使用后取出，無需分離工序，并且在反復使用中保持著酶活性。此酶固定化方法有望在酶工程、傳感器、燃料電池等領(lǐng)域得到應用。
文檔編號C12N11/14GK102660535SQ20121014435
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月11日
發(fā)明者王緹媞, 邢達杰, 黃積濤, 黃薇 申請人:南開大學