專利名稱：一種同時富集五種食源性病原菌的培養(yǎng)基及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食源性病原菌的前增菌培養(yǎng)基，具體涉及一種同時對沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和志賀氏菌復(fù)合增菌的培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
食源性疾病是全球最普遍的公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生大會2006年通過了關(guān)于食品安全的決議，該決議認(rèn)為食源性疾病嚴(yán)重影響了世界人民的健康和幸福，并對個人、家庭、社區(qū)、工商企業(yè)和國家都造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[I]。其中，食品中污染的病原細(xì)菌是引起食源性疾病的主要因素之一，食物中毒暴發(fā)時，識別食源性病原菌至關(guān)重要[2]。腸炎沙門氏菌，大腸桿菌0157，金黃色葡萄球菌，單核增生李斯特桿菌，志賀氏菌等已成為涉及到食源性疾病中最常見的細(xì)菌因子[3]。這些病原菌總是與受歡迎的食物如 家禽產(chǎn)品、即食肉、乳品、和果蔬息息相關(guān)，有較高的發(fā)病率和死亡率，近年來爆發(fā)的幾起食物中毒事件都涉及到它們[4]。在歐洲開展的調(diào)查鑒定出肉類是污染沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特桿菌、大腸桿菌0157的主要媒介[5]。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生腸毒素也是公眾關(guān)注的一個主要健康問題，金黃色葡萄球菌能在高鹽環(huán)境中生長，高蛋白質(zhì)食品中污染金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件時有發(fā)生[6]。志賀氏菌是人類細(xì)菌性痢疾的病原菌，主要通過動物性食品傳播[7]。以上五種致病菌是目前我國保證多類食品安全的必檢項目[8]。檢測食源性病原菌的傳統(tǒng)方法是培養(yǎng)法，但操作繁瑣，費時耗力，難以滿足當(dāng)今經(jīng)濟全球化食品快速流通的檢測需要。另外，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人們食品安全意識的增強，食品中需要檢測的食源性病原菌種類也逐漸增多。因此，關(guān)于多種病原菌的同時、快速檢測技術(shù)的研究已日漸深入[9-12]。先進的多重檢測技術(shù)減少了處理大量樣品所需的空間、時間和勞力，從而節(jié)約了檢測單個病原菌的成本；而且，多重檢測技術(shù)也是合理的，因為許多食品，如牛奶和乳品[13]、肉和家禽[14]以及水果和蔬菜[15]，往往是多種病原菌的攜帶者；另外，多重檢測技術(shù)可以減輕食品工業(yè)和管理部門承擔(dān)的檢測高風(fēng)險食品(易受病原菌污染的食品)的負(fù)擔(dān)。然而，在運用這些技術(shù)時必須考慮到影響檢測的兩個重要因素第一，食品是經(jīng)過加工、深加工、冷凍、包裝、儲藏等過程得到的，食品中的致病菌隨著環(huán)境的改變，會受到損傷，活力下降。該情況下，應(yīng)用PCR、基因芯片等分子生物學(xué)方法檢測時準(zhǔn)確率下降，為了防止帶有致病菌食品的漏檢，食品在檢測前需要進行增菌。第二，許多現(xiàn)代檢測方法的檢測限都在IO2 104CfU/ml范圍。低靈敏度意味著，當(dāng)食品受污染程度低時，在運用免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)檢測目標(biāo)菌之前必需進行增菌[16]。可見，共增菌培養(yǎng)處理對于現(xiàn)代檢測技術(shù)是必不可少的，該步驟的運用不僅能夠增加樣品中目標(biāo)病原菌的濃度，還能修復(fù)受到生理壓迫或損傷的細(xì)胞。通常，一種病原菌需要用一種或多種特殊的培養(yǎng)基來進行富集。如果同時檢測多種病原菌就需要應(yīng)用多種培養(yǎng)基分別進行富集，使檢測過程復(fù)雜繁瑣。采用共增菌培養(yǎng)基進行同時富集則可簡化操作。國內(nèi)外現(xiàn)有研究中，涉及共增菌培養(yǎng)基技術(shù)的研究主要包括沙門氏菌和志賀氏菌的共增技術(shù)[17];沙門氏菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的共增技術(shù)(BSB) [18];沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特桿菌的共增技術(shù)(SSL) [19];沙門氏菌、大腸桿菌及單增李斯特桿菌的共增技術(shù)(SEL) [20];沙門氏菌、副溶血性弧菌及霍亂弧菌的共增技術(shù)(SVV) [21]；能同時富集多種病原細(xì)菌的培養(yǎng)基包括通用預(yù)增菌培養(yǎng)肉湯(UPB) [22，23]、蛋白緩沖水(BPW)、胰酶大豆肉湯(TS B)和營養(yǎng)肉湯(NB) [7，23]等。迄今為止，未見關(guān)于同時富集沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特桿菌、大腸桿菌和志賀氏菌的共增菌培養(yǎng)技術(shù)的報道。為了滿足背景微生物復(fù)雜情況時對特定目標(biāo)病原菌進行性共增菌的要求，研究開發(fā)能同時富集五種病原菌的共增菌培養(yǎng)基，對實現(xiàn)同時檢測多種病原菌具有重要的意義，是快速檢測技術(shù)的重要前期技術(shù)平臺。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供可以同時支持沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和志賀氏菌五種食源性病原菌同時生長的培養(yǎng)基，將常規(guī)檢測方法中的前增菌步驟和選擇性增菌步驟合二為一，用于同一平臺檢測多個病原菌，可以提高檢測效率，節(jié)約檢測成本。本培養(yǎng)基中含有十二水磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀的緩沖體系，針對食品樣品復(fù)雜的酸堿性環(huán)境，可防止增菌過程中PH值劇烈變化，有利于目標(biāo)病原菌的快速增殖和生長。本培養(yǎng)基抑制劑包括膽鹽、亞碲酸鉀和氯化鋰。低濃度的膽鹽不影響沙門氏菌和志賀氏菌的生長，對其它三種菌的生長存在略微的抑制作用。亞碲酸鉀對五種目標(biāo)菌的生長都起到了抑制作用，抑制效果與濃度密切關(guān)聯(lián)。氯化鋰對革蘭氏陰性菌的抑制作用強于對革蘭氏陽性菌，三種抑制劑的適量添加可有效協(xié)調(diào)陽性菌與陰性菌的共同生長狀態(tài)，同時也起到一定抑制背景微生物的生長的作用。五種菌對氯化鈉的耐受性能較好，加入較高濃度的氯化鈉，也可抑制其它部分非目標(biāo)微生物的生長。本培養(yǎng)基中的促進劑葡萄糖、甘露醇和丙酮酸鈉對五種菌的生長都起到了理想的促進作用。七葉苷對單增李斯特菌的生長表現(xiàn)出明顯的促進作用，而對另外四種菌的生長影響不大。由于單增李斯特菌在五種菌共同生長時處于競爭弱勢，因此，適量的七葉苷可以保證單增李斯特菌與其它四種菌處于協(xié)調(diào)一致的生長狀態(tài)。本發(fā)明的制備方法是
(1)將蛋白胨、氯化鈉、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、膽鹽、氯化鋰、葡萄糖、甘露醇、丙酮酸鈉和七葉苷加入到990mL蒸餾水中，加熱至溶解，冷卻至室溫后，調(diào)節(jié)pH值至7. 1-7. 3 ；
(2)混勻，121°C滅菌20min ；
(3)稱取亞碲酸鉀0.Img加入到IOmL已滅菌的蒸餾水中，得到亞碲酸鉀溶液，分裝存于4-6 °C下備用；
(4)在無菌條件下，加入(3)配制的亞碲酸鉀溶液10mL。本發(fā)明具有的優(yōu)點
(I)SSSLE能夠達到五種目標(biāo)病原菌的各自選擇性增菌培養(yǎng)基的增菌效果，可以提高檢測效率，節(jié)約成本，簡化操作程序。(2)與其它通用培養(yǎng)基相比，SSSLE能對五種目標(biāo)菌同時富集并協(xié)調(diào)生長，最終獲得相對一致的細(xì)胞生物量，具有最佳的增菌效果，能更好地滿足現(xiàn)代快速檢測技術(shù)的需求。本發(fā)明的培養(yǎng)物可以直接用于目標(biāo)菌的分離培養(yǎng)及分子生物學(xué)檢測實驗。


圖I:人工污染五種目標(biāo)菌的樣品經(jīng)復(fù)合增菌培養(yǎng)基增菌后的PCR檢測圖，單增李斯特(hlyA)、志賀氏菌(ipaH)、沙門氏菌(invA)、金黃色葡萄球菌(16S)和大腸桿菌(uidA)o
圖2 :豬肉樣品經(jīng)復(fù)合增菌培養(yǎng)基增菌后，檢測出沙門氏菌(invA)和大腸桿菌(uidA)o圖3:牛肉樣品經(jīng)復(fù)合增菌培養(yǎng)基增菌后，檢測出單增李斯特菌(hlyA)、志賀氏菌(ipaH)、金黃色葡萄球菌(16S)、大腸桿菌(uidA)。圖4 :雞肉樣品經(jīng)復(fù)合增菌培養(yǎng)基增菌后，檢測出金黃色葡萄球菌(16S)和志賀氏菌(ipaH)o
具體實施例方式為更好理解本發(fā)明，以下將結(jié)合實施例對本發(fā)明做詳細(xì)說明，但是本發(fā)明要求保護的范圍并不局限于實施例表示的范圍。
實施例I:
將蛋白胨10. 0g、十二水磷酸氫二鈉9. 0g、磷酸二氫鉀1.5g、氯化鈉10. 0g、葡萄糖
3.0g、七葉苷I. 0g、膽鹽0. lg、氯化鋰I. 0g、甘露醇2. Og和丙酮酸鈉2. 5g,蒸懼水加至990mL，加熱至溶解，冷卻至室溫后，矯正pH值至7. 1-7. 3 ;混勻，121°C滅菌20min ;稱取亞碲酸鉀0. IOmg加入到IOmL已滅菌的蒸餾水中，得到亞碲酸鉀溶液；在無菌條件下，加入配制的亞碲酸鉀溶液；分裝存于4-6°C下備用。將制備的用于復(fù)合增菌的培養(yǎng)基分別接入稀釋到10_4的沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和志賀氏菌五種目標(biāo)菌的菌液0. 5mL，37°C培養(yǎng)24h。用紫外可見分光光度計測定540nm下的OD值。同時將菌液接入每種目標(biāo)病原菌各自的選擇性增菌培養(yǎng)基中做對照。表I目標(biāo)菌單獨在培養(yǎng)基中的生長情況
權(quán)利要求
1.一種用于同時富集沙門氏菌)、大腸桿菌CfocAericAia co7i)、金黃色葡萄球菌(Ste/成r/ococc^s atfre^s)、單增李斯特菌(Zisteria monocytogenes)和志賀氏菌CSXi職77a)五種食源性病原菌的培養(yǎng)基，其配方為蛋白胨5.(T20.0 g，氯化鈉5.0 15.0 g，十二水磷酸氫二鈉5. (Tl5. 0 g，磷酸二氫鉀0.5 3.0 g，膽鹽0.05 0.2 g，亞締酸鉀0. 05 0. 15 mg,氯化鋰0. 5 1. 5 g，葡萄糖l.(T5. 0 g,甘露醇1.0 6. 0 g，丙酮酸鈉I. 0 5. 0 g,七葉苷 0. 5 I. 5 g,蒸餾水 1000 mL, pH7. 1-7. 5。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)基，其特征在于蛋白胨10.0 g，氯化鈉10. 0 g，十二水磷酸氫二鈉9.0 g，磷酸二氫鉀I. 5 g，膽鹽0.1 g，亞碲酸鉀0.1 mg，氯化鋰1.0 g，葡萄糖3.0 g，甘露醇2. 0 g，丙酮酸鈉2. 5 g，七葉苷I. 0 g，蒸餾水1000 mL, pH7. 1-7. 3。
3.權(quán)利要求I所述用于沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和志賀氏菌的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于按照如下步驟 (1)按照權(quán)利要求I所述的配方，將蛋白胨、氯化鈉、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、膽鹽、氯化鋰、葡萄糖、甘露醇、丙酮酸鈉和七葉苷加入到990 mL蒸餾水中，加熱至溶解，冷卻至室溫后，調(diào)節(jié)pH值至7. 1-7. 3 ； (2)混勻，121°C滅菌20 min ； (3)按權(quán)利要求I稱取亞碲酸鉀加入到10mL已滅菌的蒸餾水中，得到亞碲酸鉀溶液，分裝存于4-6°C下備用； (4)在無菌條件下，加入步驟(3)中配制的亞碲酸鉀溶液10mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和志賀氏菌五種食源性病原菌同時復(fù)合增菌的培養(yǎng)基及制備方法。食源性病原菌是引起食物中毒的重要原因，快速準(zhǔn)確地檢測食源性致病菌對預(yù)防和控制食品安全事件的發(fā)生具有重要的現(xiàn)實意義。本培養(yǎng)基特征如下蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g，磷酸氫二鈉9.0g，磷酸二氫鉀1.5g，膽鹽0.1g，亞碲酸鉀0.1mg，氯化鋰1.0g，葡萄糖3.0g，甘露醇2.0g，丙酮酸鈉2.5g，七葉苷1.0g，蒸餾水1000mL，pH7.1-7.5。本培養(yǎng)基能夠同時富集五種目標(biāo)病原菌，可用于目標(biāo)菌的分離及鑒定，也可用于多個致病菌在同一檢測平臺的分子檢測，為食品中五種病原菌快速檢測方法提供了技術(shù)支撐，并且滿足了對五種食源性病原菌同時檢測的需要。
文檔編號C12N1/20GK102660474SQ201210136370
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月5日
發(fā)明者唐俊妮, 李海紅, 王瓊, 趙燕英, 陳娟, 顧懷穎 申請人:唐俊妮, 西南民族大學(xué)