專利名稱：預防山羊葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于動物基因工程技術領域，具體涉及ー種預防山羊葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗的制備方法及應用。ニ背景技術：
乳房炎是奶牛和奶山羊養(yǎng)殖中危害最嚴重的疫病，通常導致產奶量下降和乳制品質量下降。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌是造成乳房感染，引起臨床和隱性乳房炎的主要致病菌，抗生素治療乳房炎副作用很多；
傳統(tǒng)的乳房炎疫苗多為弱毒活菌苗或滅活菌苗，在生產實踐中，對乳房炎的防治有一定作用，然而隨著大規(guī)模集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，人工致弱菌株存在著同源重組、自身毒カ返強等潛在可能，而滅活疫苗也存在使用劑量大、免疫期短等不足，為提高傳統(tǒng)疫苗的安全性與 免疫保護力，高效、廉價的新型疫苗研制極其重要。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供預防山羊葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗的制備方法及應用，亞單位疫苗與致病菌的自然感染過程相似，可促進粘膜免疫，誘導免疫記憶和引起廣泛的免疫應答，產生很好的交叉保護反應，是ー種更加安全穩(wěn)定、制備簡單、應用方便、價格低廉的新型疫苗。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為
一種預防山羊葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟I)金黃色葡萄球菌保護性抗原的表達與純化；2)重組蛋白與轉移因子佐劑的混合。上述步驟包括將ClfA、Hla及Sbi三種蛋白的功能區(qū)通過原核表達并純化，制成多價亞單位疫苗，且ClfA的A區(qū)、Sbi的I - IV區(qū)為配體結合區(qū)。步驟I)中包括①設計引物必制備模板；(D PCR擴增與回收目的基因；(D目的基因的原核表達與純化。上述步驟包括
①設計引物
根據(jù)Genebank上已經(jīng)提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分別設計引物H1/H2、C1/C2和S1/S2，并加入相應的酶切位點
序列ClfA Genbank No. AB245457. I Hla Genbank No. AY449760. I Sbi Genbank No. AB050860. I
Hl: 5’ -CG^MIZ^3CAGATTCTGA-3’EcoRl
H2: 5' -GCCTtK^TTAATTTGTCAT -3’Xhol
Cl: 5，-CGfiMZZtPTAGCTGCAGAT-S'EcoRl
C2: 5’-CCG^^CTCATCAGGTTGTTCAGG-3，Xhol
SI: 5，-CG^MZZ^SATCAACAAAAAGCTT-3，EcoRl
S2: 5’-CGCTCGAGTAATGCGTCTAATTGTTT-3’XhoI②制備模板
提取DNA模板所用的金黃色葡萄球菌分離自患臨床乳房炎的奶山羊乳樣，均勻涂抹乳樣于血瓊脂平板，37°C溫箱中過夜培養(yǎng)，挑取溶血性菌于顯微鏡下觀察細菌形態(tài)，確定為金黃色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床中培養(yǎng)過夜，取I mL菌液，用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取金黃色葡萄球菌基因組DNA，_20°C保存?zhèn)溆?。③PCR擴增與回收目的基因
(1)擴增目的基因hla
反應體系(50 iiL):超純水 32 u L, 10 X Taq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4 u L,MgCl2 4 uL, H1/H2各I U L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加樣后充分混勻；
PCR程序預變性94°C 5 min ;進入循環(huán)變性94°C 30 s，退火56°C 30 s，延伸72°CI. 5 min，共30個循環(huán)；最終延伸72°C 10 min ；
(2)擴增目的基因ClfA的A區(qū)
反應體系(50ii L):超純水 32 u L, 10 X Taq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4 u L,MgCl2 4 uL, C1/C2各I U L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加樣后充分混勻；
PCR程序預變性94°C 5 min ;進入循環(huán)變性94°C 30 s，退火55°C 30 s，延伸72°C
I.5 min，共30個循環(huán)；最終延伸72°C 10 min ；
(3)擴增目的基因Sbi的I,IIJILIVg
反應體系(50ii L):超純水 32 u L, IOXTaq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4u L, MgC124uL, S1/S2各I ii L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加樣后充分混勻；
PCR程序預變性94 °C 5min ;進入循環(huán)變性94°C 30s，退火52°C 30s，延伸72°Clmin，共30個循環(huán)；最終延伸72°C IOmin ；
(4)回收PCR擴增產物
目的基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、溴化こ錠顯色并切膠后，用膠回收試劑盒回收PCR擴增產物用，_20°C保存?zhèn)溆茫?br> ④目的基因的原核表達與純化
(1)表達載體的構建
分別用限制性內切酶EcoRI和Xho I對目的基因的擴增產物和表達載體pET32a進行雙酶切；
酶切體系(40 L):PCR 產物或 pET32a 載體 32 L，10XH Buffer 4 L, EcoRI / XhoI各 2 L ；
混勻后置于37°C水浴反應2 3h，目的基因和表達載體pET32a的酶切產物經(jīng)核酸電泳鑒定純化后回收，然后將二者混合于16で過夜連接，得到重組質粒pET-Hla、pET-CA、pET-Sbi，產物4°C保存；
連接反應體系T4 Ligase Buffer 1 L，目的片段酶切產物6. 5 L，pET32a載體酶切產物 I. 5 L, T4 DNA Ligasel L ；
將連接產物轉化入感受態(tài)細胞BL21 (DE3)，在Amp+平板上37°C培養(yǎng)12 h后挑取陽性質粒做菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定和測序鑒定；
(2)重組質粒的誘導表達
將上步篩選出的陽性重組菌按1:100接種到含氨芐的LB培養(yǎng)基中，轉速為220r/min、37°C震蕩培養(yǎng)至0D600=0.8 1.0時，加入IPTG誘導目的蛋白，誘導條件分別如下 pET-Hla IPTG 終濃度為 0. 5mmol/L, 37°C, 6h ； pET-CA IPTG 終濃度為 0. 5mmol/L，37°C，2h ； pET-Sbi IPTG 終濃度為 0. 5mmol/L, 37°C, 4h ；
表達產物用SDS-PAGE電泳檢測；
(3)目的蛋白的純化
收集誘導后的菌體，用PBS(pH7. 4)洗滌2次后重懸，冰上超聲裂解細菌，至樣品不再黏稠，裂解物12000r/min，4°C離心5min，收集上清，用鎳柱純化法純化上清，得到目的蛋白，純化產物用SDS-PAGE電泳檢測。步驟2)的混合過程為將純化得到的Hla蛋白在60°C水浴條件下處理30min，然后將Hla、CA、Sbi三種蛋白用pH7. 4的PBS稀釋混合均勻，使各蛋白終濃度相同，再與轉移 因子佐劑等體積混勻。上述亞單位疫苗在預防山羊葡萄球菌乳房炎中的應用。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下乳房炎亞單位疫苗即利用致病菌主要的保護性免疫原制成不含有核酸、能誘發(fā)機體產生抗體的疫苗，將其直接注入機體而激活免疫系統(tǒng)，以達到預防和治療疾病的目的。亞單位疫苗與致病菌的自然感染過程相似，可促進粘膜免疫，誘導免疫記憶和引起廣泛的免疫應答，產生很好的交叉保護反應，是一種更加安全穩(wěn)定、制備簡單、應用方便、價格低廉，且省時省力具有顯著療效的新型疫苗。四

圖I.基因clfa-A反的PCR的擴增結果 圖2基因Hla的PCR的擴增結果 圖3基因sbi的PCR的擴增結果 圖4重組蛋白clfa-A反的SDS-PAGE分析 圖5重組蛋白Hla的SDS-PAGE分析 圖6重組蛋白Sbi的SDS-PAGE分析圖。五具體實施例方式 乳房炎亞單位疫苗即利用致病菌主要的保護性免疫原制成不含有核酸、能誘發(fā)機體產生抗體的疫苗，將其直接注入機體而激活免疫系統(tǒng)，以達到預防和治療疾病的目的。本疫苗研發(fā)時，選擇基因基于以下事實ClfA、Hla及Sbi是金黃色葡萄球菌產生的毒力因子，在金黃色葡萄球菌感染宿主的過程中以特定的結構域發(fā)揮毒力作用。ClfA的A區(qū)(ClfA-A)是結合宿主細胞外基質中前衛(wèi)蛋白與纖維蛋白原的功能性區(qū)域；Hla通過各個単體之間的相互作用形成攻膜復合物，在靶細胞表面打孔使其裂解，;Sbi的功能區(qū)(I、II、III、IV區(qū))可以特異性地與宿主的IgG的Fe端結合，干擾抗體介導的調理吞噬作用從而抵抗宿主吞噬細胞的殺傷作用，還可以與補體C3d、補體調節(jié)蛋白H因子結合，阻止補體形成攻膜復合物。本發(fā)明預防山羊葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗的制備方法包括1)金黃色葡萄球菌保護性抗原的表達與純化；2)重組蛋白與轉移因子佐劑的混合。步驟I)中包括以下步驟
I、設計引物
根據(jù)Genebank上已經(jīng)提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分別設計引物H1/H2、C1/C2和S1/S2，并加入相應的酶切位點
序列ClfA Genbank No. AB245457. I Hla Genbank No. AY449760. I Sbi Genbank No. AB050860. I
Hl: 5’ -CG^MIZ^3CAGATTCTGA-3’EcoRl
H2: 5' -GCCTtK^TTAATTTGTCAT -3’Xhol
Cl: 5，-CGfiMZZtPTAGCTGCAGAT-S'EcoRl
C2: 5’-CCG^^CTCATCAGGTTGTTCAGG-3，Xhol
SI: 5，-CG^MZZ^SATCAACAAAAAGCTT-3，EcoRl
S2: 5’-CG^^TAATGCGTCTAATTGTTT-3’Xhol
ClfA, Hla與Sbi在金黃色葡萄球菌感染宿主的過程中分別起黏附、破壞宿主細胞、逃避免疫系統(tǒng)的作用。2、制備模板
提取DNA模板所用的金黃色葡萄球菌分離自患臨床乳房炎的奶山羊乳樣。均勻涂抹乳樣于血瓊脂平板，37°C溫箱中過夜培養(yǎng)，挑取溶血性菌于顯微鏡下觀察細菌形態(tài)，確定為金黃色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床中培養(yǎng)過夜。取I mL菌液，用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取金黃色葡萄球菌基因組DNA，_20°C保存?zhèn)溆谩?、PCR擴增與回收目的基因 (I)擴增目的基因hla
反應體系(50 iiL):超純水 32 u L, 10 X Taq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4 u L,MgCl2 4 uL, H1/H2各I U L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加樣后充分混勻。PCR程序預變性94°C 5 min ;進入循 環(huán)變性94°C 30 s，退火56°C 30 s，延伸72°C I. 5 min，共30個循環(huán)；最終延伸72°C 10 min，參見圖2。(2)擴增目的基因ClfA的A區(qū)
反應體系(50ii L):超純水 32 u L, 10 X Taq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4 u L,MgCl2 4 uL, C1/C2各I U L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加樣后充分混勻。PCR程序預變性94°C 5 min ;進入循環(huán)變性94°C 30 s，退火55°C 30 s，延伸72°C I. 5 min，共30個循環(huán)；最終延伸72°C 10 min，參見圖I。(3)擴增目的基因 Sbi 的 I ,IIJILIVg
反應體系(50ii L):超純水 32 u L, IOXTaq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4u L, MgC124uL, S1/S2各I ii L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加樣后充分混勻。PCR程序預變性94°C 5min ;進入循環(huán)變性94°C 30s，退火52°C 30s，延伸72°Clmin，共30個循環(huán)；最終延伸72°C lOmin，參見圖3。(4 )回收PCR擴增產物
目的基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠顯色并切膠后，用膠回收試劑盒回收PCR擴增產物用，_20°C保存?zhèn)溆谩?、目的基因的原核表達與純化
(I)表達載體的構建
分別用限制性內切酶EcoRI和Xho I對目的基因的擴增產物和表達載體pET32a進行雙酶切。酶切體系(40 L):PCR 產物或 pET32a 載體 32 L，IOXH Buffer 4 L, EcoRI /XhoI 各 2 L?；靹蚝笾糜?7°C水浴反應2 3h。目的基因和表達載體pET32a的酶切產物經(jīng)核酸電泳鑒定純化后回收，然后將二者混合于16 1過夜連接，得到重組質粒pET-Hla、pET-CA、pET-Sbi，產物 4°C保存。連接反應體系T4 Ligase Buffer 1 L，目的片段酶切產物6. 5 L，pET32a載體酶切產物 I. 5 L, T4 DNA Ligasel L。將連接產物轉化入感受態(tài)細胞BL21 (DE3)，在Amp+平板上37°C培養(yǎng)12 h后挑取陽性質粒做菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定和測序鑒定。
(2)重組質粒的誘導表達
權利要求
1.一種預防山羊葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)金黃色葡萄球菌保護性抗原的表達與純化；2)重組蛋白與轉移因子佐劑的混合。
2.根據(jù)權利要求I所述的預防山羊葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗的制備方法，其特征在于將ClfA、Hla及Sbi三種蛋白的功能區(qū)通過原核表達并純化，制成多價亞單位疫苗，且ClfA的A區(qū)、Sbi的I - IV區(qū)為配體結合區(qū)。
3.根據(jù)權利要求2所述的預防山羊葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗的制備方法，其特征在于步驟I)中包括①設計引物；②制備模板；(D PCR擴增與回收目的基因；④目的基因的原核表達與純化。
4.根據(jù)權利要求3所述的預防山羊葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗的制備方法，其特征在于 ①設計引物 根據(jù)Genebank上已經(jīng)提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分別設計引物H1/H2、C1/C2和S1/S2，并加入相應的酶切位點 序列ClfA Genbank No. AB245457. I Hla Genbank No. AY449760. I Sbi Genbank No. AB050860. I Hl: 5’ -CG^MIZ^3CAGATTCTGA-3’EcoRl H2: 5' -GCCTtK^TTAATTTGTCAT -3’Xhol Cl: 5，-CGfiMZZtPTAGCTGCAGAT-S'EcoRl C2: 5’-CCG^^CTCATCAGGTTGTTCAGG-3，Xhol SI: 5，-CG^MZZ^SATCAACAAAAAGCTT-3，EcoRl S2: 5’-CGCTCGAGTAATGCGTCTAATTGTTT-3’XhoI ②制備模板 提取DNA模板所用的金黃色葡萄球菌分離自患臨床乳房炎的奶山羊乳樣，均勻涂抹乳樣于血瓊脂平板，37°C溫箱中過夜培養(yǎng)，挑取溶血性菌于顯微鏡下觀察細菌形態(tài)，確定為金黃色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床中培養(yǎng)過夜，取I mL菌液，用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取金黃色葡萄球菌基因組DNA，_20°C保存?zhèn)溆茫? ③PCR擴增與回收目的基因 (1)擴增目的基因hla 反應體系(50 iiL):超純水 32 u L, 10 X Taq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4 u L,MgCl2 4 uL, H1/H2各I U L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加樣后充分混勻； PCR程序預變性94°C 5 min ;進入循環(huán)變性94°C 30 s，退火56°C 30 s，延伸72°CI.5 min，共30個循環(huán)；最終延伸72°C 10 min ； (2)擴增目的基因ClfA的A區(qū) 反應體系(50ii L):超純水 32 u L, 10 X Taq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4 u L,MgCl2 4 uL, C1/C2各I U L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加樣后充分混勻； PCR程序預變性94°C 5 min ;進入循環(huán)變性94°C 30 s，退火55°C 30 s，延伸72°CI.5 min，共30個循環(huán)；最終延伸72°C 10 min ； (3)擴增目的基因Sbi的I、II、III、IV區(qū)反應體系(50ii L):超純水 32 u L, IOXTaq Buffer 5 u L, dNTP Mixture 4u L, MgC124uL, S1/S2各I ii L，模板2 ii L，Taq酶I ii L，加樣后充分混勻； PCR程序預變性94°C 5min ;進入循環(huán)變性94°C 30s，退火52°C 30s，延伸72°Clmin，共30個循環(huán)；最終延伸72 °C IOmin ； (4)回收PCR擴增產物 目的基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠顯色并切膠后，用膠回收試劑盒回收PCR擴增產物用，_20°C保存?zhèn)溆茫? ④目的基因的原核表達與純化 (1)表達載體的構建 分別用限制性內切酶EcoRI和Xho I對目的基因的擴增產物和表達載體pET32a進行雙酶切； 酶切體系(40 L):PCR 產物或 pET32a 載體 32 L，10XH Buffer 4 L, EcoRI / XhoI各 2 L ； 混勻后置于37°C水浴反應2 3h，目的基因和表達載體pET32a的酶切產物經(jīng)核酸電泳鑒定純化后回收，然后將二者混合于16 1過夜連接，得到重組質粒pET-Hla、pET-CA、pET-Sbi，產物4°C保存； 連接反應體系T4 Ligase Buffer 1 L，目的片段酶切產物6. 5 L，pET32a載體酶切產物 I. 5 L, T4 DNA Ligasel L ； 將連接產物轉化入感受態(tài)細胞BL21 (DE3)，在Amp+平板上37°C培養(yǎng)12 h后挑取陽性質粒做菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定和測序鑒定； (2)重組質粒的誘導表達 將上步篩選出的陽性重組菌按1:100接種到含氨芐的LB培養(yǎng)基中，轉速為220r/min、37°C震蕩培養(yǎng)至0D600=0.8 1.0時，加入IPTG誘導目的蛋白，誘導條件分別如下pET-Hla :IPTG 終濃度為 0. 5mmol/L, 37°C, 6h ；pET-CA IPTG 終濃度為 0. 5mmol/L，37°C，2h ；pET-Sbi IPTG 終濃度為 0. 5mmol/L, 37°C, 4h ； 表達產物用SDS-PAGE電泳檢測； (3)目的蛋白的純化 收集誘導后的菌體，用PBS (pH7. 4)洗滌2次后用重懸，冰上超聲裂解細菌，至樣品不再黏稠，裂解物12000r/min，4°C離心5min，收集上清，用鎳柱純化法純化上清，得到目的蛋白，純化產物用SDS-PAGE電泳檢測。
5.根據(jù)權利要求4所述的預防山羊葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗的制備方法，其特征在于步驟2)的混合過程為將純化得到的Hla蛋白在60°C水浴條件下處理30min，然后將Hla, CA、Sbi三種蛋白用pH7. 4的PBS稀釋混合均勻，使各蛋白終濃度相同，再與轉移因子佐劑等體積混勻。
6.根據(jù)權利要求I所述的亞單位疫苗在預防山羊葡萄球菌乳房炎中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物基因工程技術領域，具體涉及一種預防山羊葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗的制備方法及應用。本發(fā)明的目的在于提供預防山羊葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗的制備方法及應用，亞單位疫苗與致病菌的自然感染過程相似，可促進粘膜免疫，誘導免疫記憶和引起廣泛的免疫應答，產生很好的交叉保護反應，是一種更加安全穩(wěn)定、制備簡單、應用方便、價格低廉的新型疫苗。本發(fā)明通過以下步驟完成1)金黃色葡萄球菌保護性抗原的表達與純化；2)重組蛋白與轉移因子佐劑的混合。
文檔編號C12N15/31GK102698260SQ20121011669
公開日2012年10月3日 申請日期2012年4月20日 優(yōu)先權日2012年4月20日
發(fā)明者姚運亮, 李 杰, 田婷婷, 羅軍, 許君艷, 陳德坤 申請人:西北農林科技大學