專利名稱：一種生產(chǎn)超氧化物歧化酶sod的除雜純化新工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種超氧化物歧化酶SOD除雜純化新工藝，本工藝方法操作簡(jiǎn)單易行，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)簡(jiǎn)稱S0D,是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛存在于微生物和動(dòng)植物中。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。由于現(xiàn)代生活壓力，環(huán)境污染，各種輻射和超量運(yùn)動(dòng)都會(huì)造成氧自由基大量的形成，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證實(shí)由自由基引發(fā)的疾病多達(dá)一百多種，嚴(yán)重地威脅著我們的健康與長(zhǎng)壽。目前，SOD已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品、化妝品等行業(yè)，市場(chǎng)前景十分廣闊。目前，從動(dòng)物血球液中提取超氧化物歧化酶的方法主要是收集新鮮血，抗凝，溶血，氯仿乙醇沉淀血紅蛋白，丙酮沉淀，再經(jīng)過(guò)離子交換層析和分子篩層析進(jìn)行純化。該方法存在下列缺陷第一，氯仿-乙醇沉淀去除血紅蛋白，可以得到粗酶液，但血紅蛋白被嚴(yán)重污染，無(wú)法綜合利用，造成資源浪費(fèi)，同時(shí)有機(jī)溶劑成本較高；第二，用丙酮沉淀可以得到SOD粗酶液，但丙酮不僅對(duì)SOD的活力破壞比較大，還會(huì)殘留在SOD終產(chǎn)品中，影響產(chǎn)品的安全性
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，而提供一種生產(chǎn)超氧化物歧化酶SOD的除雜純化新工藝，該工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、高安全性，適合于工業(yè)化生產(chǎn)的新工藝。如上構(gòu)思，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種生產(chǎn)超氧化物歧化酶SOD的除雜純化新工藝，包括以下幾個(gè)步驟(I)在新鮮的動(dòng)物血液中加入食品級(jí)檸檬酸鈉做抗凝處理，添加量為3. 5-5g/Kg動(dòng)物血，離心收集紅細(xì)胞，然后加入紅細(xì)胞體積1-3倍的去離子水,不斷攪拌,使紅細(xì)胞破碎，得溶血液；(2)向溶血液中加入單價(jià)金屬鹽，至單價(jià)金屬鹽終濃度為0.07M 4M，調(diào)節(jié)PH值到4. 0-7. 0，加熱至55-75°C，保溫反應(yīng)30_100min，離心取上清，即得超氧化物歧化酶粗提液；(3)在超氧化物歧化酶粗提液中加入可溶性銅鹽，至銅離子終濃度為3mM 16mM，加熱至55 80°C,保溫反應(yīng)15 60min后,離心去洛,上清液用中空纖維超濾裝置進(jìn)行超濾濃縮得超氧化物歧化酶濃縮液；(4)在超氧化物歧化酶濃縮液中，加入預(yù)冷乙醇進(jìn)行沉淀，離心取沉淀，沉淀用去離子水溶解后，離心去不溶物，上清液通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂層析柱和分子篩進(jìn)行純化，冷凍干燥，制得超氧化物歧化酶精品凍干粉；本發(fā)明使用的中空纖維超濾裝置選擇截留分子量為4K-15K的膜組件，保持回流壓 0.04-0. IMPa0本發(fā)明中的預(yù)冷乙醇沉淀是分兩步進(jìn)行的，首先加入濃縮液體積0. 4-1倍體積的預(yù)冷乙醇，離心取上清；在上清液中繼續(xù)加入預(yù)冷乙醇，兩次加入的乙醇總體積為原濃縮液體積的I. I 2. 0倍。本發(fā)明中使用的單價(jià)金屬鹽采用氯化鈉。本發(fā)明中使用的可溶性銅鹽采用氯化銅。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(I)生產(chǎn)中沒(méi)有使用氯仿、丙酮等有毒有害溶劑，大大降低了生產(chǎn)成本，改善了工作環(huán)境，減少了對(duì)操作人員的毒害，同時(shí)提高了產(chǎn)品的安全性；(2)反應(yīng)中得到的血紅蛋白沉淀沒(méi)有受到污染，可以進(jìn)一步利用，加工成血粉等產(chǎn)品;(3)引入超濾濃縮裝置，既能有效的對(duì)SOD進(jìn)行純化，又極大的壓縮了濃縮液的體積，使得乙醇的用量減少，操作起來(lái)方便快捷，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式一種生產(chǎn)超氧化物歧化酶SOD的除雜純化新工藝，包括以下幾個(gè)步驟(I)采集新鮮豬血175L加入7L濃度為10%的檸檬酸鈉抗凝，用管式離心機(jī)連續(xù)分離得70L血球和112L血漿。血漿經(jīng)噴霧干燥成血漿蛋白粉，血球液泵入反應(yīng)罐中，同時(shí)加入90L的去離子水?dāng)嚢?0min使血球破碎，制得溶血液160L ；(2)繼續(xù)攪拌下，向溶血液中加入氯化鈉4. 86Kg，然后用10%的鹽酸調(diào)節(jié)PH值至6. 0，加熱到62°C并保溫40min，迅速水冷至室溫，管式離心機(jī)離心收集上清液得SOD粗提液120L ；(3)在SOD粗提液中加入氯化銅160. 5g，加熱至70°C，保溫反應(yīng)30min后，迅速水冷至室溫，離心去渣得SOD粗提液100L，將上清液用截留分子量為6K的中空纖維膜超濾濃縮至IL ；(4)在濃縮液在邊攪拌邊加入0. 5L的經(jīng)預(yù)冷乙醇，離心收集上清液；繼續(xù)在上清液中邊攪拌邊加入0. 7L的預(yù)冷乙醇，離心去沉淀；(6)沉淀用200mL的pH6. 8的2. 5mM的磷酸緩沖液溶解，溶解液上DEAE陰離子交換層析柱進(jìn)行純化，上樣后用PH6. 8的5mM的磷酸緩沖液洗脫，收集SOD活力峰，得200mLS0D溶液。SOD溶液上S印hadex G25柱層析脫鹽，用蒸餾水洗脫，收集SOD活力峰，得200mLS0D液，冷凍干燥得淺藍(lán)色的SOD精品凍干粉3. 86g，比活力6100U/mg，密封包裝于-20°C冷凍保存。以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡釋，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚，以下實(shí)施例涉及到的SOD活性檢測(cè)使用GB/T 5009. 171-2003第一法。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但是這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)超氧化物歧化酶SOD的除雜純化新工藝，包括以下幾個(gè)步驟 (1)在新鮮的動(dòng)物血液中加入食品級(jí)檸檬酸鈉做抗凝處理，添加量為3.5-5g/Kg動(dòng)物血，離心收集紅細(xì)胞，然后加入紅細(xì)胞體積1-3倍的去離子水，不斷攪拌，使紅細(xì)胞破碎，得溶血液； (2)向溶血液中加入單價(jià)金屬鹽，至單價(jià)金屬鹽終濃度為O.07M 4M，調(diào)節(jié)PH值到4.0-7. 0，加熱至55-75°C，保溫反應(yīng)30-100min，離心取上清，即得超氧化物歧化酶粗提液； (3)在超氧化物歧化酶粗提液中加入可溶性銅鹽，至銅離子終濃度為3mM 16mM，加熱至55 80°C，保溫反應(yīng)15 60min后，離心去渣，上清液用中空纖維超濾裝置進(jìn)行超濾濃縮得超氧化物歧化酶濃縮液； (4)在超氧化物歧化酶濃縮液中，加入預(yù)冷乙醇進(jìn)行沉淀，離心取沉淀，沉淀用去離子水溶解后，離心去不溶物，上清液通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂層析柱和分子篩進(jìn)行純化，冷凍干燥，制得超氧化物歧化酶精品凍干粉；
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種生產(chǎn)超氧化物歧化酶SOD的除雜純化新工藝，其特征在于上述中空纖維超濾裝置選擇截留分子量為4K-15K的膜組件，保持回流壓O. 04-0. IMPa0
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種生產(chǎn)超氧化物歧化酶SOD的除雜純化新工藝，其特征在于上述預(yù)冷乙醇沉淀是分兩步進(jìn)行的，首先加入濃縮液體積O. 4-1倍體積的預(yù)冷乙醇，離心取上清；在上清液中繼續(xù)加入預(yù)冷乙醇，兩次加入的乙醇總體積為原濃縮液體積的I. I 2. O 倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種生產(chǎn)超氧化物歧化酶SOD的除雜純化新工藝，其特征在于上述單價(jià)金屬鹽采用氯化鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種生產(chǎn)超氧化物歧化酶SOD的除雜純化新工藝，其特征在于上述可溶性銅鹽采用氯化銅。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)超氧化物歧化酶SOD除雜純化新工藝，主要步驟包括動(dòng)物新鮮血液經(jīng)抗凝處理后，離心分離得到血球液，經(jīng)溶血，熱變性，超濾濃縮，乙醇分級(jí)沉淀得SOD粗品。粗品再經(jīng)陰離子交換樹(shù)脂、分子篩層析純化后冷凍干燥得SOD精品。本方法沒(méi)有使用任何對(duì)人體有害的有機(jī)試劑，不僅有效地避免了SOD產(chǎn)品中有毒、有害有機(jī)試劑的殘留，提高了產(chǎn)品的安全性和使用范圍，而且降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明方法操作工序簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉，適于用工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/02GK102628036SQ20121007246
公開(kāi)日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2012年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月19日
發(fā)明者盧進(jìn)峰, 尹倫, 方俊生, 王雅靜, 臧盛, 袁訓(xùn)安 申請(qǐng)人:湖北奧彤生物制品科技有限公司