專利名稱：一種高產(chǎn)丙位癸內酯的解脂耶氏酵母基因工程菌及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)Y -癸內酯的Yarrowia Iipolytica基因工程菌，同時涉及基因工程菌的構建方法及在エ業(yè)發(fā)酵中的應用。
背景技術：
Y-癸內酯(γ-decalactone，⑶L)，廣泛存在于水果、肉制品和日常食品中，其具有濃郁的果香香氣，稀釋后有桃子香氣，是構成水果香味的關鍵成分。現(xiàn)已在120多種食物的香氣成分中發(fā)現(xiàn)了 Y-癸內酷。在成熟果實中，Y-癸內酯的含量可以達到15yg/kg，其中89%是(R)-異構體。在1969年，Y-癸內酯被美國食品藥品管理局認為是安全的食品和藥品添加剤。Y-癸內酯以其誘人的香氣和低香氣閾值(在水中僅為0.08mg/kg)的特性 廣泛用于各類花香、果香、東方香型、檀香型日化香精中，也可用于食品、煙草、飼料、食用香精中。在Y-癸內酯的生物制備中可利用微生物尤其是酵母菌作為菌種，以蓖麻油中主要成分蓖麻油酸(12-羥基-9-十八碳烯酸)作為底物，先經(jīng)過氧化使碳鏈縮短，再經(jīng)內酯化即可生成Y-癸內酷。Tahara首次報道使用能夠產(chǎn)生香味物質的酵母菌Sporobolomyces odorus生產(chǎn)得到Y-癸內酷。酵母菌一般選用假絲酵母(Candida sp.)、耶羅威亞酵母(Yarrowia Iipolytica)、鎖擲抱酵母(Sporidiobolus sp·)、畢赤酵母(Pichia sp.)等,其中以Yarrowia Iipolytica降解蓖麻油產(chǎn)Y -癸內酯的能力最為顯著。β -氧化是指脂酰-CoA進入線粒體基質后，在脂肪酸β -氧化酶系催化下進行的氧化分解作用。酰基-輔酶A氧化酶(Acyl-CoA oxidase)、3_酮酰-輔酶A硫解酶(3-ketoacyl-CoA thiolase)及雙功能酶(Bifunctional enzyme)是 β-氧化反應過程中三個非常重要的酶，其中?；?CoA氧化酶(Acyl-CoA oxidase)是β-氧化反應過程中的第一歩催化酶，被普遍認為為限速酶，其活力高低與Y-癸內酯的產(chǎn)量有直接關系。在Yarrowia Iipolytica中酸基-CoA氧化酶有5個同エ酶Aoxl_Aox5,分別由P0X1-P0X5基因編碼。研究發(fā)現(xiàn)，POXl基因在敲除后幾乎沒有看到酰基-CoA氧化酶的活性有所改變，Aoxl對催化蓖麻油酸生產(chǎn)Y-癸內酯沒有顯著的促進或抑制作用；長鏈特異性?；?CoA氧化酶Aox2能夠特異性地催化蓖麻油酸生產(chǎn)Y-癸內酷，其多表達可促進Y-癸內酯產(chǎn)量的増加；短鏈特異性酰基-CoA氧化酶Aox3的存在會使Y-癸內酯進一歩降解，產(chǎn)生更短碳鏈的脂類；P0X4基因在敲除后沒有發(fā)現(xiàn)對Y-癸內酯產(chǎn)量有大的影響，但是在同時敲除P0X3、P0X4基因后，Y-癸內酯產(chǎn)量卻比單獨敲除P0X3基因時提高更大，故推測P0X4基因可能作用是有助于P0X3基因對短鏈Y-癸內酯的降解起到調節(jié)作用；P0X5基因的破壞使得蓖麻油酸(C18)第一歩降解受到了影響，但影響不顯著，從而推斷Aox5對生成其他Cltl產(chǎn)物(如3-羥基癸內酷、2-癸烯)和Y-癸內酯的降解有極其微弱的促進作用。同時Aox3的活性還可能受到其他3個同エ酶Aoxl、Aox4、Aox5的影響。同源重組的發(fā)生依賴于載體與目的基因片段之間存在一定的DNA同源片段，同源片段越長則越有利于同源重組事件的發(fā)生。傳統(tǒng)的同源重組載體的構建以DNA連接酶和限制性內切酶為基礎，通過一系列的酶切連接反應將各片段連接在同一個載體上。但這種方法在連接過程中引入了不必要的酶切位點堿基序列，而且對于長片段的連接有時難以找到合適的酶切位點。為了克服傳統(tǒng)的酶切連接方法的缺陷，出現(xiàn)了以聚合酶鏈式反應為基礎的片段拼接技術，即融合PCR技術(Splice overlap extension PCR)。融合PCR技術在不需要內切酶消化和連接酶處理的條件下，采用具有互補末端的引物將不同來源的擴增片段連接起來，為同源重組片段的構建提供了快速簡捷的途徑?，F(xiàn)有的融合PCR技術一般包括兩步PCR反應(1)應用特異性的引物，對各片段進行單獨的擴增，特異性引物的5'末端帶有一段相鄰片段的互補序列；(2)在同一反應體系中加入各片段的混合物，以ー對外側引物進行融合片段的全長擴増。融合PCR技術在應用過程中還存在缺陷，如融合產(chǎn)物長度一般不超過4. Okb、待融合片段的個數(shù)一般不超過3個、產(chǎn)物的特異性差等問題。隨著分子生物學的發(fā)展，基因敲除技術得到了快速發(fā)展，基于基因敲除技術構建重組菌株的方法也日漸成熟，且其安全性也更加可靠。這為高產(chǎn)Y-癸內酯YarrowiaIipolytica基因工程菌株的構建提供了可能性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之ー是提供ー種Yarrowia Iipolytica基因工程菌Tp_12。該菌種由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 5787，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。菌種保藏日期為2012年02月24日，分類命名為解脂耶氏酵母(拉丁名Yarrowia lipolytica)。該菌株利用蓖麻油酸產(chǎn)Y-癸內酯的轉化率高，成本低，遺傳穩(wěn)定，且由于沒有外源基因插入，生物安全性很高，可用于Y-癸內酯的エ業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的目的之ニ是提供Yarrowia lipolytica基因工程菌制備方法的核心技術——融合PCR。該方法不用考慮限制性內切酶酶切位點對實驗的影響，而只用多輪PCR即可將不同的基因融合在一起，從而可以很快捷地構建好用于同源重組的敲除組件，且重復性好。本發(fā)明技術要點之三是利用酵母自身的銅抗性基因CRFl作為篩選標記，由于在構建過程中沒有外源基因的插入所以轉化子具有更高的生物安全性。Yairowialipolytica能夠耐受較大濃度的銅離子,其銅離子抗性是S. cerevisiae的數(shù)倍,并且CRFl基因可編碼銅-捕獲轉錄因子，可捕獲環(huán)境中的如銅離子等有毒金屬離子，使得細胞可在含有大量金屬離子的培養(yǎng)基中生長。不同Yarrowia lipolytica對銅離子的耐受度與其基因組內CRFl基因的拷貝數(shù)呈正比。由于CRFl基因的插入，轉化子CRFl基因的拷貝數(shù)比野生型菌株更高，因而其對銅離子的抗性會明顯提高。當將轉化菌株和野生菌株分別接種至含不同銅離子濃度梯度的平板上時，銅離子濃度增高到一定水平，野生型菌株完全不能生長，而相比之下，能在此濃度或更高濃度銅離子培養(yǎng)基中正常生長的轉化菌株就有可能是轉化子。在本發(fā)明的一個實例中，很好的說明了這一點，從而篩選出成功敲除P0X3基因的轉化子。本發(fā)明技術要點之四是利用石油醚對發(fā)酵液進行Y-癸內酯萃取而不是文獻中所報道的こ醚。因為用こ醚萃取Y-癸內酯時發(fā)酵液中殘留的蓖麻油也會進入到有機相、こ醚中，在之后的操作中也不易將こ醚去除掉，而蓖麻油不易揮發(fā)，在進行氣相檢測時可能殘留在氣相柱中堵塞柱子并影響檢測結果，所以我們選用石油醚作為萃取劑。Y-癸內酯易溶于石油醚而蓖麻油不溶于石油醚這樣就可以有效的避免上述問題，同時用石油醚萃取Y-癸內酯時，在振蕩過程中不易乳化，有機相與水相分層迅速。本發(fā)明技術要點之五是對野生型菌株及轉化子生長活力進行測定，發(fā)現(xiàn)轉化子Tp-12以蓖麻油為主要碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中其生長活力明顯低于野生型菌株。而在以葡萄糖為主要碳源的YEro培養(yǎng)基中其生長活力變化不大。由此我們可以推斷出Ρ0Χ3基因對消化脂類物質有重要作用，而對葡萄糖的分解影響不大。菌株的生長能力對Y-癸內酯的產(chǎn)量有一定影響。同時，通過比較轉化子Tp-12生長曲線與Y-癸內酯生成曲線，我們發(fā)現(xiàn)當菌株生長達到穩(wěn)定期后Y-癸內酯才開始迅速積累，在生產(chǎn)過程中我們可以通過優(yōu)化底物添加時間進一步提高Y-癸內酯的產(chǎn)量。本發(fā)明技術要點之六是通過氣相檢測可得到結果，野生型菌株Y-癸內酯的產(chǎn)量在70h時達到最大值O. 9g/L，但隨著發(fā)酵時間的增加Y -癸內酯會被進ー步的降解為更短碳鏈的脂類，Y-癸內酯產(chǎn)量呈逐漸下降趨勢，到120h Y-癸內酯幾乎全部降解。敲除P0X3 基因并多表達P0X2基因的重組菌株Tp-12在IOOh時Y -癸內酯的產(chǎn)量達到最大值2. 9g/L，且產(chǎn)量穩(wěn)定，發(fā)酵后期降解很小，可用于利用蓖麻油產(chǎn)Y-癸內酯的エ業(yè)化連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。Y-癸內酯產(chǎn)量的增長是由于完全阻斷了 Cltl水平下的β-氧化使Y-癸內酯不會被降解，同時加強C18水平的β-氧化以提高轉化蓖麻油酸為Y-癸內酯的效率。本發(fā)明技術要點之七是米用麥麩作為發(fā)酵培養(yǎng)基的生長碳源。麥麩作為一種廉價的原料應用于Y-癸內酯的生物技術制備，不但能大大降低生產(chǎn)成本，更為重要的是，麥麩作為生長碳源的同時，能極大的提高Y-癸內酯的產(chǎn)率。初歩研究表明，麥麩的添加量作為影響Y-癸內酯產(chǎn)量的顯著因素之一，可能是由于麥麩中含有豐富的阿魏酸、煙酸、肌醇等成分，它們有可能是促進蓖麻油生物轉化成Y-癸內酯的重要影響因素。以麥麩為生長碳源，發(fā)酵周期約為72h，較普通發(fā)酵培養(yǎng)基周期大大縮短。當麥麩添加量為I. 5% -2. 5%吋，經(jīng)初步經(jīng)優(yōu)化后，Y-癸內酯的產(chǎn)量接近4g/L，遠遠超過以葡萄糖為碳源時的Y-癸內酯產(chǎn)量。以麥麩為碳源，還能極大的降低發(fā)酵過程中的乳化程度，從而能有效提高Y-癸內酯的分離提取效率。實施例I. PCPP敲除組件的構建I.野生型Yarrowia lipolytica基因組總DNA的提取。2.利用SOE PCR技術進行PCPP敲除組件的構建。由NCBI 的 Entrez 檢索系統(tǒng),查知 Yarrowia lipolytica酵母菌的P0X3 基因，CRFl銅抗性基因及P0X2基因的全基因序列，并根據(jù)其CDS區(qū)的位置及啟動子和終止子序列，用Primer premier 5. O軟件設計其上游引物和下游引物。P0X3基因上段同源序列引物上游引物POX3-Up-I acaacaccttcacagagccacc下游引物P0X3-up -2 gaagacgagttgagacgaagactttcgcacccagtagtcgtCRFl基因引物上游引物 CRF1-1 acgactactgggtgcgaaagtcttcgtctcaactcgtcttc下游引物 CRF1-2 agagccgagggagaataaacggcgaaattggcggttggtat
P0X2基因引物上游引物 P0X2-1 ataccaaccgccaatttcgccgtttattctccctcggctct下游引物 P0X2-2 gattcccgtgcccgtattactctacccgcttgtctattccP0X3基因下段同源序列引物上游引物 P0X3_down-l ggaatagacaagcgggtagagtaatacgggcacgggaatc下游引物P0X3-down_2 accgaacccatactccac利用PCR的方法擴增Yarrowialipolytica P0X3基因(GenBank登陸號AJOO1301)上游同源序列，CRFl基因(GenBank登陸號Z23265)，P0X2(基因GenBank登陸號AJ001300)，P0X3基因下游同源序列。接著用SOE PCR的方法進行3輪PCR，構建敲除組件。
第一輪PCR表I. P0X3基因上游同源序列的PCR擴增反應體系
權利要求
1.一種Yarrowia Iipolytica基因工程菌株Tp_12 (CGMCC No. 5787),其特征在于敲除其染色體上的Ρ0Χ3基因的同時將Ρ0Χ2基因導入其內部以使轉化菌株在Ρ0Χ3基因表達被阻斷的同時可以多表達Ρ0Χ2基因。
2.ー種用于權利要求I所述的基因工程菌的制備方法，其特征在于運用了融合PCR(SOE PCR)的方法進行敲除組件的構建。
3.ー種用于權利要求2所述的構建敲除組件的SOE PCR方法，其特征在于融合PCR的引物設計方法。
4.ー種用于權利要求書I所述的基因工程菌株的篩選，其特征在于采用了菌株本身的銅抗性基因，保證了其生物安全性。
5.ー種用于權利要求書1、4所述的基因工程菌在生產(chǎn)Y-癸內酯中的應用。
6.ー種用于權利要求書5所述的基因工程菌在生產(chǎn)Y-癸內酯中的應用，其特征在于以麥麩為發(fā)酵培養(yǎng)基的生長碳源。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)基因工程菌及制備方法和應用，選取野生菌株染色體中POX3基因作為靶基因，在敲除POX3基因同時將POX2及CRF1基因插入到其內部，使其完全喪失短鏈特異性酰基-CoA氧化能力(POX3基因編碼)，同時多拷貝了編碼長鏈特異性?；?CoA氧化酶的POX2基因，獲得的工程菌株產(chǎn)γ-癸內酯的能力得到極大增強。標記基因CRF1也來自出發(fā)菌株，故可確保其生物安全性。轉化子Tp-12遺傳穩(wěn)定且由于其在發(fā)酵過程中γ-癸內酯產(chǎn)量降解效率不明顯，故其可用于利用蓖麻油產(chǎn)丙位癸內酯(γ-癸內酯)的工業(yè)化連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。
文檔編號C12N1/19GK102676410SQ20121006579
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月14日 優(yōu)先權日2012年3月14日
發(fā)明者丁永志, 馮春利, 宋煥祿, 杜閃, 郭艷瓊 申請人:北京工商大學