專利名稱：一種分析維生素c生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域，涉及一種分析維生素C生產(chǎn)菌株混菌傳代培養(yǎng)過程磷脂組變化的方法。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟發(fā)展和生活水平不斷提高，人類對健康越來越重視，各種維生素類保健品的需求量逐年增加。在各種維生素中，維生素C是一種高效抗氧化劑，參與人體新陳代謝中重要的生物合成過程，是維持機體營養(yǎng)、生長所必需的維生素。它還在藥品、食品和化妝品添加等方面有極為廣泛的應(yīng)用。目前，我國通過使用巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖桿菌 (Gluconobacter oxydans)混合發(fā)酵生產(chǎn)維生素C。其中，前者為伴生菌，后者為產(chǎn)酸菌。兩菌在混合發(fā)酵的過程中，通過相互作用促進產(chǎn)酸菌的生長和產(chǎn)酸。在不加入伴生菌時，產(chǎn)酸菌生長緩慢，產(chǎn)酸效率極低，不適合工業(yè)生產(chǎn)；而混合培養(yǎng)時，產(chǎn)酸菌也會影響伴生菌的生長和形態(tài)。改造兩菌相互作用模式，進一步提高發(fā)酵產(chǎn)物2-酮基-L-古龍酸(維生素C的前體)的產(chǎn)量，可以減少能源消耗和環(huán)境污染，極大的降低生產(chǎn)成本。在兩菌混合培養(yǎng)中，它們之間的交流最先經(jīng)由感受外界信號的細胞膜，再進一步傳遞到胞內(nèi)，并產(chǎn)生一系列的信號事件。研究兩菌傳代培養(yǎng)，不斷強化相互作用的過程中， 細胞膜磷脂組的變化，可從這一角度找到兩菌相互作用促進產(chǎn)酸的原因，并為進一步的菌種篩選和改造，以及生產(chǎn)工藝優(yōu)化等提供支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法，包括如下步驟(I)固體培養(yǎng)取10_500yL保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌 (Gluconobacter oxydans)和10-500 μ L保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中的巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上，28_35°C,培養(yǎng)24h_48h ;⑵種子培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在 28-350C，200-280rpm搖床振蕩培養(yǎng)，24h_48h，得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為 2 X 107-2 X 1010cfu/mL,使氧化葡糖桿菌的密度為 2 X 108-2 X 10ncfu/mL,在 28_35°C， 200-280rpm搖床振蕩培養(yǎng)，以24h_48h為傳代周期，以體積比為1% -10%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代100-150天，在0-100或0-150天選3_5個取樣時間取3_5個樣；(3)分純將步驟(2)獲得的3-5個傳代培養(yǎng)混菌菌株劃線分純，再分別接種于固體培養(yǎng)基上，28-35°C培養(yǎng)24h-48h ;再分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在28_35°C，200_280rpm搖床振蕩培養(yǎng) 24h-48h，得到進化了的巨大芽孢桿菌種子液和進化了的氧化葡糖桿菌種子液；(4)發(fā)酵將所述進化了的巨大芽孢桿菌、進化了的氧化葡糖桿菌以及混合的進化了的巨大芽孢桿菌和進化了的氧化葡糖桿菌分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使進化了的巨大芽孢桿菌的密度為2X 107-2X 101QCfu/mL，使進化了的氧化葡糖桿菌的密度為2 X 108_2 X 10ncfu/mL， 在 28-35°C，200-280rpm 搖床振蕩培養(yǎng) IOh-15h ；(5)細胞磷脂組的提取①取在步驟⑷搖床振蕩培養(yǎng)10h-15h的三種細胞懸液100-200mL，1000-3000rpm 離心3-10min，去除上清液，保留細胞，用pH = 7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液洗細胞1_3次，相同條件離心，去除上清，得到細胞；②將步驟①所得細胞制成干粉，稱取200-300mg細胞干粉，置于離心管A中，加入 O. 5-0. 8mL超純水，充分混勻；③向離心管A中再加入2-4mL提取液，充分混勻；1000-3000rpm離心3-lOmin，使
溶液分層，取下層有機溶劑層，置于離心管B中；④重復步驟③2-4次，至細胞完全沉降；⑤向離心管B中，加入O. 8-1. 2mol/L KCl水溶液O. 5-1. 5mL，充分混勻， 2000-4000rpm離心3-10min,除去含水溶性雜質(zhì)的上清；⑥再向離心管B加入l-3mL超純水，充分混勻，2000-4000rpm離心3-lOmin，去上清；⑦蒸餾或氮氣吹干步驟⑥所得混合物中的有機溶劑，得到總磷脂提取混合物；⑧將所述總磷脂提取混合物溶于O. 2-2mL儲存液中制成樣品，冷凍_40°C以下保存；⑨檢測前，向所述樣品內(nèi)加入磷脂標準品，使磷脂標準品終濃度為O. 5-1. 5 μ g/ mL ；所述提取液是含有二丁基羥基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的體積比為1-2 1，所述二丁基羥基甲苯的質(zhì)量分數(shù)為O. 005-0. 01% ;所述儲存液為含有二丁基羥基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的體積比為1-4 1，所述二丁基羥基甲苯的質(zhì)量分數(shù)為O. 005-0. 01% ;(6) LC-MS 檢測采用LC-MS對步驟(5)獲得的加入了磷脂標準品的樣品進行檢測，得到維生素C 生產(chǎn)菌株傳代過程的磷脂組的分子結(jié)構(gòu)和含量數(shù)據(jù)；(7)多元統(tǒng)計分析將步驟(6)獲得的維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程的磷脂組的分子含量數(shù)據(jù)，進行多元統(tǒng)計分析，得到區(qū)分不同傳代時間維生素C生產(chǎn)菌株的差異磷脂分子標志物；(8)過程分析
將步驟(7)獲得的差異磷脂分子標志物的含量按照不同傳代時間制成圖表，觀察并分析這些磷脂分子變化的規(guī)律，進而發(fā)現(xiàn)在混菌傳代培養(yǎng)過程中起關(guān)鍵作用的磷脂分子及相關(guān)代謝途徑，從而為以提高2-酮基-L-古龍酸為目的的菌種改造和培養(yǎng)條件優(yōu)化提供方向。所述細胞制成干粉的方法優(yōu)選為使用液氮在研缽內(nèi)研磨細胞。所述步驟(5)⑦中所述蒸餾優(yōu)選為30_40°C減壓蒸餾。所述磷脂標準品為磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰乙醇胺和磷脂酸至少兩種。所述磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺，溶血性磷脂酰乙醇胺或磷脂酸的脂肪酸疏水尾長度為每條10-20個碳原子。所述LC-MS檢測條件優(yōu)選為色譜柱HypersilGOLD Silica,其規(guī)格為 150mmX 2. lmm, 5 μ m ;進樣量IOyL;柱溫25°C；流動相A(% ):氯仿(89. 5)，甲醇(10)，氫氧化銨(O. 5)；流動相B (% ):氯仿(55)，甲醇(39)，氫氧化銨(O. 5)，水(5. 5)；梯度程序0-7min，20-30% B ;7_15min 30-40 % B ；15-20min 40-50 % B ； 20-25min 50% B ；25-35min, 50-20% B ；35-45min, 20% B ；離子化方式ESI (負離子方式);掃描方式MSScan ；掃描范圍m/z400-900 ；掃描速度1000scan/s;毛細管電壓3KV;錐孔電壓30V;萃取電壓3V;離子源溫度100°C;脫溶劑氣溫度350°C ；錐孔氣流量50L/Hr脫溶劑氣流量400L/Hr ；進/出口能量50;碰撞能量2 ；HM1/LM1/HM2/LM2 15. O ；IonEnergy I I. O ；Ion Energy 2:2.0。所述多元統(tǒng)計分析方法為Pareto預處理后進行主成分分析。本發(fā)明提供了一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的手段，這種手段涉及細胞總磷脂的提取和分析，多元統(tǒng)計方法分析所獲得的磷脂組學數(shù)據(jù)，通過對不同傳代數(shù)的維生素C生產(chǎn)菌株在單獨和混合培養(yǎng)條件下的磷脂分子分別進行定性和定量分析， 找到與增強維生素C生產(chǎn)菌株兩菌相互作用相關(guān)的磷脂分子和代謝途徑的分析提供了方法，對以提高2-酮基-L-古龍酸為目的的菌種改造和培養(yǎng)條件優(yōu)化具有重要的意義。


2-2)； 5-2)；
圖I為不同傳代時間的巨大芽孢桿菌的磷脂含量變化；
圖2為不同傳代時間的巨大芽孢桿菌的主成分分析得分圖(圖2-1)和荷載圖(圖
圖3為不同傳代時間的巨大芽孢桿菌的磷脂分子標志物含量變化；
圖4為不同傳代時間的氧化葡糖桿菌的磷脂含量變化；
圖5為不同傳代時間的氧化葡糖桿菌的主成分分析得分圖(圖5-1)和荷載圖(圖
圖6為不同傳代時間的氧化葡糖桿菌的磷脂分子標志物含量變化；
圖7為不同傳代時間的混菌的磷脂含量變化；
圖8為不同傳代時間的混菌的主成分分析得分圖(圖8-1)和荷載圖(圖8-2)； 圖9為不同傳代時間的混菌的磷脂分子標志物含量變化。
具體實施例方式下面的實施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，并不對本發(fā)明作任何限制。下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例I一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法，其特征是包括如下步驟(I)固體培養(yǎng)取IOOyL保藏于體積濃度為20 %的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌 (Gluconobacter oxydans)和100 μ L保藏于體積濃度為20%的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上,30°C,培養(yǎng)36小時；(2)種子培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在 300C，240rpm搖床振蕩培養(yǎng)，36h，得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2X108cfu/mL，使氧化葡糖桿菌的密度為2 X 101(lCfu/mL，在30°C，240rpm搖床振蕩培養(yǎng)，以36h為傳代周期，以體積比為5%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代150天，分別在第O天、第50天、第100天和第150天取4個樣；(3)分純將步驟(2)獲得的4個傳代培養(yǎng)混菌菌株劃線分純，再分別接種于固體培養(yǎng)基上， 30°C培養(yǎng)36小時；再分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在30°C，240rpm搖床振蕩培養(yǎng)36h，得到進化了的巨大芽孢桿菌種子液和進化了的氧化葡糖桿菌種子液；(4)發(fā)酵將進化了的巨大芽孢桿菌、進化了的氧化葡糖桿菌以及混合的進化了的巨大芽孢桿菌和進化了的氧化葡糖桿菌分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使進化了的巨大芽孢桿菌的密度為2X 108cfu/mL，使進化了的氧化葡糖桿菌的密度為2 X 101(lCfu/mL，在30°C，240rpm搖床振蕩培養(yǎng)13h ；(5)細胞磷脂組的提?、偃≡诓襟E(4)搖床振蕩培養(yǎng)13h的三種細胞懸液150mL，2000rpm離心5min，去除上清液，保留細胞，用PH = 7. 3的磷酸鹽緩沖液洗細胞2次，相同條件離心，去除上清，得到細胞；②將步驟①所得三種細胞使用液氮在研缽內(nèi)分別研磨制成干粉，每種稱取250mg 細胞干粉，置于三支離心管A中，分別加入O. 6mL超純水，充分混勻；③向三支離心管A中分別再加入3mL提取液,充分混勻；2000rpm離心5min,使溶液分層，取下層有機溶劑層，置于三支離心管B中；④重復步驟③3次，至三種細胞完全沉降；⑤向三支離心管B中，各加入I. Omol/L KCl水溶液I. OmL,充分混勻，3000rpm離心5min，除去含水溶性雜質(zhì)的上清；⑥再向三支離心管B各加入2mL超純水,充分混勻，3000rpm離心5min,去上清；⑦30°C減壓蒸餾步驟⑥所得混合物中的有機溶劑，得到三種總磷脂提取混合物；⑧將三種總磷脂提取混合物溶于ImL儲存液中制成樣品，冷凍_40°C以下保存；⑨檢測前，向三個樣品內(nèi)分別加入磷脂標準品，磷脂標準品為雙十二烷酰磷脂酰甘油、雙十二烷酰磷脂酰乙醇胺、十二烷酰溶血性磷脂酰乙醇胺和雙十二烷酰磷脂酸，這四種憐脂標準品終濃度均為I. O μ g/mL ；所述提取液是含有二丁基羥基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的體積比為1.5 1，所述二丁基羥基甲苯的質(zhì)量分數(shù)為0.007% ;所述儲存液為含有二丁基羥基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的體積比為2 1，所述二丁基羥基甲苯的質(zhì)量分數(shù)為0.007% ;(6) LC-MS 檢測采用LC-MS對步驟(5)獲得的三個加入了磷脂標準品的樣品進行檢測，得到維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程的磷脂組的分子結(jié)構(gòu)見表I、表2和表3和含量數(shù)據(jù)見圖I、圖4和圖7 ；LC-MS檢測條件為色譜柱HypersilGOLD Silica,其規(guī)格為 150mmX 2. lmm, 5 μ m ;進樣量10yL;柱溫25°C;流動相A(% ):氯仿(89. 5)，甲醇(10)，氫氧化銨(O. 5)；流動相B (% ):氯仿(55)，甲醇(39)，氫氧化銨(O. 5)，水(5. 5)；梯度程序0-7min，20-30% B ;7_15min 30-40 % B ；15-20min 40-50 % B ； 20-25min 50% B ；25-35min, 50-20% B ；35-45min, 20% B ；離子化方式ESI (負離子方式)；掃描方式MSScan ；掃描范圍m/z400-900 ；掃描速度1000scan/s;
毛細管電壓3KV ；
錐孔電壓30V ；
萃取電壓3V ；
離子源溫度100°C ;
脫溶劑氣溫度350 0C ；
錐孔氣流量50L/Hr
脫溶劑氣流量400L/Hr ；
進/出口能量50 ；
碰撞能量2 ；
HM1/LM1/HM2/LM2 15.O ；
IonEnergy 1:1.0;
Ion Energy 2 2.O ；
(7)多元統(tǒng)計分析
將步驟(6)獲得的維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程的磷脂組的分子含量數(shù)據(jù)，進行多
元統(tǒng)計分析，得到區(qū)分不同傳代時間維生素C生產(chǎn)菌株的差異磷脂分子標志物；多元統(tǒng)計分析方法為Pareto預處理后進行主成分分析；見圖2、圖5和圖8;(8)過程分析將步驟(7)獲得的差異磷脂分子標志物的含量按照不同傳代時間制成圖表圖3、 圖6和圖9，觀察并分析這些磷脂分子變化的規(guī)律，進而發(fā)現(xiàn)在混菌傳代培養(yǎng)過程中起關(guān)鍵作用的磷脂分子及相關(guān)代謝途徑，從而為以提高2-酮基-L-古龍酸為目的的菌種改造和培養(yǎng)條件優(yōu)化提供方向。表I巨大芽孢桿菌磷脂分子鑒定表
權(quán)利要求
1.一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法，其特征是包括如下步驟(1)固體培養(yǎng)取10-500yL保藏于體積濃度為15-30 %的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌 (Gluconobacter oxydans)和10-500 μ L保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中的巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上，28_35°C,培養(yǎng)24h_48h ;(2)種子培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在28-35°C， 200-280rpm搖床振蕩培養(yǎng)，24h_48h，得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為 2X107-2X1010cfu/mL,使氧化葡糖桿菌的密度為 2X 108_2X 10ncfu/mL，在 28-35°C， 200-280rpm搖床振蕩培養(yǎng)，以24h_48h為傳代周期，以體積比為1% -10%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代100-150天，在0-100或0-150天選3_5個取樣時間取3_5個樣；(3)分純將步驟(2)獲得的3-5個傳代培養(yǎng)混菌菌株劃線分純，再分別接種于固體培養(yǎng)基上， 28-35 °C培養(yǎng)24h-48h ;再分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在28-35 °C，200_280rpm搖床振蕩培養(yǎng) 24h-48h，得到進化了的巨大芽孢桿菌種子液和進化了的氧化葡糖桿菌種子液；(4)發(fā)酵將所述進化了的巨大芽孢桿菌、進化了的氧化葡糖桿菌以及混合的進化了的巨大芽孢桿菌和進化了的氧化葡糖桿菌分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使進化了的巨大芽孢桿菌的密度為2 X 107-2 X 1010cfu/mL,使進化了的氧化葡糖桿菌的密度為2 X 108-2 X 10ncfu/mL,在 28-35°C，200-280rpm 搖床振蕩培養(yǎng) 10h_15h ；(5)細胞磷脂組的提取①取在步驟(4)搖床振蕩培養(yǎng)10h-15h的三種細胞懸液100-200mL，1000-3000rpm離心3-10min，去除上清液，保留細胞，用pH = 7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液洗細胞1_3次，相同條件離心，去除上清，得到細胞；②將步驟①所得細胞制成干粉，稱取200-300mg細胞干粉，置于離心管A中，加入O.5-0. 8mL超純水，充分混勻；③向離心管A中再加入2-4mL提取液,充分混勻；1000-3000rpm離心3_10min,使溶液分層，取下層有機溶劑層，置于離心管B中；④重復步驟③2-4次，至細胞完全沉降；⑤向離心管B中，加入O.8-1. 2mol/L KCl水溶液O. 5-1. 5mL，充分混勻，2000_4000rpm 離心3-10min，除去含水溶性雜質(zhì)的上清；⑥再向離心管B加入l_3mL超純水,充分混勻，2000-4000rpm離心3-10min,去上清；⑦蒸餾或氮氣吹干步驟⑥所得混合物中的有機溶劑，得到總磷脂提取混合物；⑧將所述總磷脂提取混合物溶于O.2-2mL儲存液中制成樣品，冷凍_40°C以下保存；⑨檢測前，向所述樣品內(nèi)加入磷脂標準品，使磷脂標準品終濃度為O.5-1. 5μ g/mL ；所述提取液是含有二丁基羥基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的體積比為1-2 1，所述二丁基羥基甲苯的質(zhì)量分數(shù)為O. 005-0. 01% ;所述儲存液為含有二丁基羥基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的體積比為1-4 1，所述二丁基羥基甲苯的質(zhì)量分數(shù)為0.005-0.01% ;(6)LC-MS 檢測采用LC-MS對步驟(5)獲得的加入了磷脂標準品的樣品進行檢測，得到維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程的磷脂組的分子結(jié)構(gòu)和含量數(shù)據(jù)；(7)多元統(tǒng)計分析將步驟(6)獲得的維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程的磷脂組的分子含量數(shù)據(jù)，進行多元統(tǒng)計分析，得到區(qū)分不同傳代時間維生素C生產(chǎn)菌株的差異磷脂分子標志物；(8)過程分析將步驟(7)獲得的差異磷脂分子標志物的含量按照不同傳代時間制成圖表，觀察并分析這些磷脂分子變化的規(guī)律，進而發(fā)現(xiàn)在混菌傳代培養(yǎng)過程中起關(guān)鍵作用的磷脂分子及相關(guān)代謝途徑，從而為以提高2-酮基-L-古龍酸為目的的菌種改造和培養(yǎng)條件優(yōu)化提供方向。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法，其特征是所述細胞制成干粉的方法為使用液氮在研缽內(nèi)研磨細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法，其特征是所述步驟(5)⑦中所述蒸餾為30-40°C減壓蒸餾。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法，其特征是所述磷脂標準品為磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰乙醇胺和磷脂酸至少兩種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法，其特征是所述磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺，溶血性磷脂酰乙醇胺或磷脂酸的脂肪酸疏水尾長度為每條10-20個碳原子。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種分析維生素C生產(chǎn)菌株磷傳代過程脂組變化的方法，其特征是所述LC-MS檢測條件為色譜柱Hypersil GOLD Silica,其規(guī)格為 1 SOmmX 2. 1mm, 5 μ m ;進樣量10yL;柱溫25°C ；流動相A(% ):氯仿(89. 5)，甲醇(10)，氫氧化銨(O. 5)；流動相B(% ):氯仿(55)，甲醇(39)，氫氧化銨(O. 5)，水(5. 5)；梯度程序0-7min，20-30 % B ;7-15min 30-40 % B ；15-20min 40-50 % B ；20-25min 50% B ；25-35min, 50-20% B ；35-45min, 20% B ；離子化方式ESI (負離子方式)；掃描方式MS Scan ；掃描范圍m/z 400-900 ；掃描速度1000scan/s ；毛細管電壓3KV ；錐孔電壓30V ；萃取電壓3V ；離子源溫度100°C ;脫溶劑氣溫度350°C ；錐孔氣流量50L/Hr 脫溶劑氣流量400L/Hr ；進/出口能量50 ；碰撞能量2 ；HM1/LM1/HM2/LM2 15.O ；IonEnergy 1:1.0;Ion Energy 2 :2·O。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法，其特征是所述多元統(tǒng)計分析方法為Pareto預處理后進行主成分分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程磷脂組變化的方法，包括如下步驟(1)固體培養(yǎng)取氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌分別接種于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)；(2)種子培養(yǎng)(3)分純；(4)發(fā)酵；(5)細胞磷脂組的提??；(6)LC-MS檢測；(7)多元統(tǒng)計分析；(8)過程分析；本發(fā)明通過對細胞總磷脂的提取和分析，多元統(tǒng)計方法分析所獲得的磷脂組學數(shù)據(jù)，對不同傳代數(shù)的維生素C生產(chǎn)菌株在單獨和混合培養(yǎng)條件下的磷脂分子分別進行定性和定量分析，找到與增強維生素C生產(chǎn)菌株兩菌相互作用相關(guān)的磷脂分子和代謝途徑的分析提供了方法，對以提高2-酮基-L-古龍酸為目的的菌種改造和培養(yǎng)條件優(yōu)化具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/02GK102586386SQ201210044060
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者元英進, 呂亞金, 楊潔, 胡夢龍, 鄒旸 申請人:天津大學