專利名稱：利用熱激和四環(huán)素調(diào)控的ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)、重組表達(dá)載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及利用熱激和四環(huán)素調(diào)控的ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)和應(yīng)用，還涉及含有ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)的重組表達(dá)載體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在獲得轉(zhuǎn)基因中，往往需要轉(zhuǎn)入目的基因，同時為了能將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分開，還需要引入選擇標(biāo)記基因，選擇標(biāo)記基因一般為抗性基因。一方面，引入的抗性基因會因為基因漂移而帶來基因污染，例如形成超級雜草；另一方面，人們擔(dān)心轉(zhuǎn)基因食品中的抗性基因會影響人類的健康，因此刪除轉(zhuǎn)基因植物中的靶基因，特別是抗性基因成為轉(zhuǎn)基因植物研究的熱點。目前主要采用基因刪除系統(tǒng)刪除轉(zhuǎn)基因植物中的靶基因，主要有Cre/loxP、FLP/ FRT、R/RS等位點特異重組系統(tǒng)和轉(zhuǎn)座子刪除系統(tǒng)，使用這些刪除系統(tǒng)刪除抗性基因存在周期長，工作量大，可控性差等問題。大腸桿菌TnlO轉(zhuǎn)座子中的四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)能夠通過四環(huán)素調(diào)控基因的表達(dá)，目前已有將四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)用于調(diào)控真核基因的表達(dá)，因此可以應(yīng)用于調(diào)控基因刪除系統(tǒng)，但是該系統(tǒng)用于調(diào)控真核表達(dá)存在表達(dá)嚴(yán)密性和適應(yīng)性問題。植物熱激啟動子HSP為誘導(dǎo)型啟動子，在熱激條件下能被激活。擬南芥的熱激啟動子HSP18. 2 能夠通過控制溫度控制下游基因的表達(dá)，但是多數(shù)熱激啟動子存在泄漏問題，同時對應(yīng)用環(huán)境要求高，因此用于控制基因刪除系統(tǒng)并不理想。理想的刪除系統(tǒng)不僅需要具有刪除周期短，工作量小，操作簡單等特點，還需要具有可控性好，精確度高等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一在于提供熱激和四環(huán)素雙重調(diào)控系統(tǒng)，通過溫度和四環(huán)素來調(diào)控 ntCre重組酶基因表達(dá)，表達(dá)的ntCre重組酶能夠特異識別LoxP位點，從而刪除LoxP位點之間核酸序列，具有刪除周期短、能夠大大減少了工作量、可控性好等優(yōu)點。為了實現(xiàn)上述目的，技術(shù)方案為利用熱激和四環(huán)素雙重調(diào)控的ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)，所述ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)包括ntCre重組酶特異識別的2個LoxP位點和位于2個LoxP位點之間的靶基因部分，所述2個LoxP位點分別為位于靶基因3’端的第一 LoxP位點和位于靶基因5’端的第二 LoxP 位點；還包括HSF70m啟動子調(diào)控的Iihsf基因表達(dá)盒和0m35S啟動子調(diào)控的ntCre重組酶基因表達(dá)盒部分，所述0m35S啟動子由Iihsf基因調(diào)控，所述HSF70m啟動子核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述Misf基因核酸序列如SEQ ID N0. 24所示，所述0m35S啟動子核酸序列如SEQ ID N0. 8所示，所述LoxP位點核酸序列如SEQ ID N0. 25所示，所述ntCre重組酶基因核酸序列如SEQID N0. 26所示。進一步，所述ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)是所述第一 LoxP位點，靶基因，0m35S啟動子調(diào)控的ntCre重組酶基因表達(dá)盒，HSF70m啟動子調(diào)控的Iihsf基因表達(dá)盒和第二 LoxP位點順序串聯(lián)。進一步，所述靶基因為抗性標(biāo)記基因。本發(fā)明目的之二在于提供含ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)的重組表達(dá)載體，技術(shù)方案為含有所述ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)的重組表達(dá)載體。本發(fā)明目的之三在于提供重組表達(dá)載體的制備方法，技術(shù)方案為重組表達(dá)載體的制備方法，具體步驟如下將含有HSF70m啟動子調(diào)控的Iihsf基因表達(dá)盒和0m35S啟動子調(diào)控的ntCre重組酶基因表達(dá)盒部分連入pVCT2231載體的酶切位點處；所述pVCT2231載體由pCAMBIA1320載體、pVCT1191載體和pBIN19載體制備，具體步驟為從PVCT1191載體中克隆npt nm基因，并在npt nm基因3 ’端加上LoxP位點，獲得 npt II m-LoxP組件，然后將npt II m_LoxP組件替換pCAMBIA1302載體上的潮霉素抗性基因hptll，并將含LoxP位點的序列反向插入pCAMBIA1302載體，替換pCAMBIA1302載體的 35S啟動子和mGFP5基因編碼區(qū)；同時從pBIN19載體中克隆Pnos啟動子，替換pCAMBIA1302 載體上調(diào)控hptll基因的2X35S啟動子，即得pVCT2231載體；所述pVCT1191載體由pCR2. 1-T0P0載體改造而來，具體為，刪除pCR2. 1-T0P0載體上氨芐抗性基因并自環(huán)化連接構(gòu)建的載體，即PVCT1191載體。進一步，所述pVCT2231載體制備具體步驟為(1)將所得npt II m-LoxP基因連入pMD18_T載體中，得pVCT1202載體，并用Mil 和B10I雙酶切所得的pVCT1202載體，瓊脂糖凝膠電泳并回收nptllm-LoxP組件，將回收的 npt II m-LoxP組件連入pCAMBIA1302載體的2個XhoI酶切位點之間，得pVCT2071載體；(2)克隆的所述Pnos啟動子，用Ml I和EcoR I酶切，瓊脂糖凝膠電泳并回收，將所得的Pnos啟動子連入所得pVCT2071載體的Bio I和EcoR I酶切位點之間，得pVCT2072 載體；(3)用NotI酶切所得pVCT1202載體，用Klenow Fragment酶補為平末端，再用)CbaI酶切，回收含LoxP位點的pVCT1202載體片段，同時用PmaCI和)(baI酶切所得 PVCT2072載體，回收含npt II m基因的pVCT2072載體片段，將回收的pVCT1202載體片段與pVCT2072載體片段連接，得pVCT2231載體。進一步，所述npt II m-LoxP組件的制備，具體步驟為(1)以所得pVCT1191載體為模板，上游引物如SEQ ID N0. 19所示核酸序列，下游引物如SEQ ID N0. 20所示核酸序列，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘， 95 0C變性10秒，52 0C退火20秒，72 °C延伸1分鐘20秒，3個循環(huán)，再經(jīng)95 °C變性10秒，60 V 退火20秒，72°C延伸1分鐘20秒，27個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，得nptnm基因；(2)以所得nptnm基因為模板，上游引物如SEQ ID N0. 19所示核酸序列，下游引物如SEQ ID N0. 21所示核酸序列，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘，95°C 變性10秒，46°C退火20秒，72°C延伸1分鐘20秒，3個循環(huán)，再經(jīng)95°C變性10秒，60°C退火20秒，72°C延伸1分鐘20秒，27個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，得npt I Im-LoxP組件。進一步，所述Pnos啟動子制備方法，具體步驟為以PBIN19載體為模板，上游引物為如SEQ ID N0. 22核酸序列，下游引物如SEQ ID N0. 23核酸序列，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性20秒，57°C退火20秒，72°C延伸1分鐘30秒，35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，得Pnos啟動子。本發(fā)明目的之四在于提供ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用，技術(shù)方案為所述ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用。本發(fā)明目的之五在于提供重組表達(dá)載體在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用，技術(shù)方案為所述重組表達(dá)載體在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用。本發(fā)明有益效果在于本發(fā)明公開了利用熱激和四環(huán)素雙重調(diào)控的ntCre/LoxP 刪除系統(tǒng)，能夠在溫度和四環(huán)素調(diào)控下精確刪除LoxP位點之間的核酸序列，刪除周期短， 能夠在10周內(nèi)徹底刪除LoxP位點之間的核酸序列；便于控制，可以直接在不含四環(huán)素的培養(yǎng)基上調(diào)節(jié)溫度就能成功的刪除；并且同時利用熱激啟動子和四環(huán)素操縱子雙重調(diào)控， 克服了熱激啟動子表達(dá)泄露的缺點和溫度意外升高導(dǎo)致的實驗失敗，使用改造后的四環(huán)素操縱子克服了四環(huán)素操縱子在真核生物中表達(dá)嚴(yán)密性和適應(yīng)性的缺陷；本發(fā)明還公開了 ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)的重組載體及其制備方法，制備方法簡單，制得的重組載體使用方便， 可以使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)，轉(zhuǎn)化不同的植物，為植物轉(zhuǎn)基因提供了刪除靶基因的有利工具，特別是刪除抗性基因。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)描述，其中圖1 pVCT2027載體構(gòu)過程圖；圖2熱激啟動子HSF70m在功能驗證圖(分別為在4°C、20°C、25°C、30°C、35°C、 40°C、40°C處理12小時，再用⑶S染液染色)；圖3 HSF70m調(diào)控的Iihsf基因表達(dá)盒構(gòu)建過程圖；圖4熱激和四環(huán)素雙重調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建過程圖；圖5熱激和四環(huán)素雙重控制系統(tǒng)功能驗證圖(A-G，在MS培養(yǎng)基上，分別在5°C、 20°C、25°C、28°C、30°C、35°C、4(rC條件下處理12小時，H為在含有1. Omg/L四環(huán)素的MS培養(yǎng)基上，35°C條件下處理12小時)；圖6熱激和四環(huán)素雙重控制系統(tǒng)調(diào)控效率驗證圖(A-E依次為在35°C條件下處理 1小時、2小時、3小時、4小時、5小時，再用GUS染液染色)圖7 pVCT2117載體構(gòu)建過程圖；圖8 pVCT2219載體構(gòu)建過程圖；圖9 pVCT2072載體構(gòu)建過程圖；圖10 pVCT2262載體構(gòu)建過程圖；圖11煙草中ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)驗證圖(圖A為只含150mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，圖B為在含有l(wèi)mg/L四環(huán)素和150mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，在35°C條件下處理10周，圖C和D為轉(zhuǎn)基因煙草刪除后35°C條件下恢復(fù)10周)。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1、熱激啟動子HSP70m的構(gòu)建根據(jù)報道的擬南芥(Arabidopsis thaliana)熱激蛋白基因AtHSP70b (GenBank登錄號AC010924)，對AtHsp70b基因的啟動子序列進行分析，分析發(fā)現(xiàn)AtHsp70b存在2個結(jié)構(gòu)上的問題(l)AtHsp70b中有一個生長素反應(yīng)元件(AuxRE)，序列為TGTCTC，還有一個脫落酸(ABA)反應(yīng)元件(ABRE)的核心序列ACGT，因此在AtHsp70b:⑶S導(dǎo)入煙草后，在常溫下有表達(dá)泄漏；O)AtHsp70b中有一個熱激元件(HSF)，但熱激元件的結(jié)構(gòu)不完善。因此對 AtHSP70b基因進行改進，構(gòu)建含有兩個標(biāo)準(zhǔn)熱激元件(HSE)，兩個HSE之間含有59bp的序列，同時去除了 AtHSP70b上的AuxRE元件和ABRE元件，并將AtHSP70b中結(jié)構(gòu)不完善的熱激元件改造成nnGAAnnTTCnnGAAnn結(jié)構(gòu)的HSE，并與35S啟動子的核心序列，構(gòu)建為AtHSP70b 改造的熱激啟動子，命名為HSP70m啟動子，序列為5，-ggactgcaggtcgacgatttatatcccggt cggt gaatcttccagaactttc ttgtactttcgcgattactccacctttgcacaatcccctgggttgtgccacgaccttt t ttctcgaaatttctcgaaitRcatRacccttcctctatataaRRaaRttcatttcatttRRaRaRaacacRRRRRactcta 臓-3，(SEQ ID NO. 1)，劃單線處分別為I^st I和Xba I位點，劃雙線處為標(biāo)準(zhǔn)熱激元件， 加粗tatata為35S啟動子的TATA盒。用EcoRI和HindIII雙酶切pUC18載體和pBI121載體，回收pUC18載體2635bp 片段，得pUC18載體酶切片段，回收PBI121載體的含β -葡萄糖苷酸酶基因GUS的表達(dá)盒， 得ρΒΙ121載體酶切片段，將pUC18載體酶切片段與Gus的表達(dá)盒用Τ4 DNA連接酶連接，反應(yīng)條件為16°C過夜，得pVCT2006載體。用)(ba I和I^st I酶切pVCT2006載體，瓊脂糖凝膠電泳，回收4810bp的pVCT2006載體骨架，同時人工合成如SEQ ID NO. 1所示序列的HSP70m 啟動子雙鏈DNA，并用)(ba I和I3St I酶切HSP70m啟動子，回收180bp的HSP70m啟動子，將 PVCT2006載體骨架與HSP70m啟動子用"Γ4 DNA連接酶于16°C連接過夜，得pVCT2027載體， 如圖1所示。PVCT2027載體測序結(jié)果表明在pVCT2027載體中⑶S基因的表達(dá)由HSP70m啟動表達(dá)，Tnos終止子終止表達(dá)，并將⑶S表達(dá)盒命名為HSP70m:⑶S。根據(jù)報道的pBmi9載體序列(GenBank accession U09365)，設(shè)計含Pnos啟動子和nptll編碼區(qū)(簡稱Pnos: :nptll基因)的特異引物，上游引物序列為5，-G^aattcaggg agtcacgttatgac-3，(SEQ ID NO. 2)，下劃線為EcoR I酶切位點，下游弓I物序列為5’ -cgctcg agtcccgctcagaagaac-3' (SEQ ID NO. 3)，劃線處為 Xho I 酶切位點，使用 Prin^tar HS DNA 聚合酶，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件95°C變性2分鐘，1個循環(huán)；95°C變性10秒，退火 20秒，72°C延伸1分10秒，30個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收，回收片段經(jīng)EcoR I和Xho I酶切后，回收1107bp的Pnos::nptII基因；同時用EcoR I和Xho I酶消化pCAMBIA1302載體，回收842^3ρ的pCAMBIA1302載體骨架；連接Pnos: :nptll基因和PCAMBIA1302載體骨架，得pVCT2020載體。用EcoR I和Hind III酶切所得pVCT2020 載體多克隆酶切位點處，回收9481bp的pVCT2020載體骨架，同時用EcoR I和Hind III酶切載體PVCT2027，回收2363bp的⑶S表達(dá)盒，將回收的⑶S表達(dá)盒與pVCT2020載體骨架用T4 DNA連接酶于16°C連接過夜，即將⑶S表達(dá)盒插入pVCT2020載體的多克隆位點處，得 PVCT2028 載體。將pVCT2(^8載體采用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，得含pVCT2(^8
7載體的EHA105，將含pVCT2(^8載體的EHA105葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，在含2. 5mg/L 6-BA和 150mg/L卡那霉素在MS培養(yǎng)基上進行抗性篩選，得抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因煙草。用打孔機將轉(zhuǎn)基因煙草葉片打取直徑約Icm大小的圓片，分別置于MS固體培養(yǎng)基上，將放有煙草葉片的培養(yǎng)基平均分成6個小組，分別在4°C、20°C、25°C、30°C、35°C、4(TC的條件下處理12小時。處理后的葉片用GUS染液進行染色檢測GUS酶活性，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明在30°C 組和35°C組在處理后能被GUS染液染成藍(lán)色，而其他組不能被GUS染液染成藍(lán)色，表明熱激啟動子HSF70m在30 35 °C啟動能力強烈，熱激啟動子HSF70m在低于25 °C時不能誘導(dǎo) ⑶S基因表達(dá)，在溫度高于40°C時也不能誘導(dǎo)⑶S基因表達(dá)。實施例2、構(gòu)建HSF70m啟動子調(diào)控Iihsf基因的表達(dá)盒根據(jù)報道的四環(huán)素阻遏蛋白基因(TetR)序列(GenBank accessionNo. J01830)， 設(shè)計引物，上游引物為 5，-cctaggaattaatgatgtctagattag-3，(SEQ ID NO. 4)，劃線處為內(nèi)切酶 Avr II 識別位點，下游引物為:5，-ggatccactttcacatttaagttg-3，(SEQ ID NO. 5), 劃線處為內(nèi)切酶BamH I識別位點，以大腸桿菌XLl-blue為模板，用高保真進行PCR擴增， PCR反應(yīng)條件為98°C預(yù)變性1分鐘；98°C變性10秒，50°C退火15秒，72°C延伸1分鐘，3個循環(huán)；98°C變性10秒，55°C退火15秒，72°C延伸1分鐘，27個循環(huán)，72°C延伸10分鐘。PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收的TetR基因片段，回收片段加A后與pMD18_T載體 (Sangon，上海)連接，連接反應(yīng)用T4 DNA連接酶于16°C連接過夜，得pVCT1147載體，如圖3 所示。由于在設(shè)計引物時不含TetR基因3’端的taa終止密碼子，因此PCR擴增所得TetR 基因3’端不含taa終止密碼子，即不含終止密碼子的TetR基因。根據(jù)報道的擬南芥Columbia生態(tài)型的熱激轉(zhuǎn)錄因子基因，即HSFl基因(GenBank accession No. NC_003075),設(shè)計弓 |物，上游弓 |物為 5‘ -agatctcagcaattatctcagggtcaagg-3 ，(SEQ IDN0. 6)，劃線處為內(nèi)切酶Bgl II識別位點，下游引物為S'-gagctctagtgttctgtttc tgatgtgag-3' (SEQID NO. 7)，劃線處為內(nèi)切酶Sac I識別位點，以擬南芥Columbia基因組 DNA為模板，用高保真進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為98°C預(yù)變性Imin ；98°C變性10s，50°C 退火15s，72°C延伸1. 5min, 3個循環(huán)；98°C變性10s, 55°C退火15s，72°C延伸lmin, 27個循環(huán)，72°C延伸IOmin PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收l(^8bp的HSFl基因片段，回收片段加A后與pMDIS-T載體連接，連接反應(yīng)用T4 DNA連接酶于16°C連接過夜，得pVCT1148載體，如圖3所示。由于在設(shè)計HSFl基因擴增引物時不包含5，端DNA結(jié)合域(DNA Binding domain)，因此擴增所得HSFl基因不含有5，端DNA結(jié)合域。用BamH I和Mc I酶切所得pVCT1147載體，瓊脂糖凝膠電泳，回收3302bp的 PVCT1147載體骨架；同時用Bgl II和Mc I酶切pVCT1148載體，瓊脂糖凝膠電泳，回收 1026bp的HSFl基因片段；將回收的PVCT1147載體骨架和HSFl基因片段連接，連接反應(yīng)用 T4 DNA連接酶于16°C連接過夜，得pVCT1150載體，如圖3所示。連接過程中TetR基因片段連入HSFl基因5，端構(gòu)成嵌合基因，即形成由TetR負(fù)調(diào)控HSFl基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，并命名為Rhsf，核酸序列如SEQ ID N0. 24所示。用)(ba I和Me I酶切所得pVCT2027載體，瓊脂糖凝膠電泳，切去⑶S基因編碼區(qū)，回收含HSF70m啟動子的pVCT2027載體骨架；同時用Avr II和&ic I酶切所得pVCT1150 載體，瓊脂糖凝膠電泳，回收1647bp的Iihsf片段；將回收的pVCT2027載體與Iihsf基因用T4 DNA連接酶于16°C連接過夜，即用Iihsf基因替換pVCT2027載體上的Gus基因，得pVCT2033載體，如圖3所示。所得pVCT2033載體中Iihsf基因由HSF70m啟動子調(diào)控表達(dá)，終止子為 iTnos,將此結(jié)構(gòu)為HSF70m: :Rhsf: :Tnos，命名為HSF70m調(diào)控的Rhsf基因表達(dá)盒。實施例3、熱激和四環(huán)素雙重調(diào)控系統(tǒng)的建立用Ml I和)(ba I酶切所得pVCT2027載體，瓊脂糖凝膠電泳，棄HSF70m啟動子，回收4820bp的pVCT2027載體骨架；同時根據(jù)四環(huán)素操縱子(TetO)中四環(huán)素阻遏蛋白(TetR)結(jié)合區(qū)(簡稱為Tet02-Tet01)，將Tet02_Tet01替換HSF70m啟動子的2個HSE標(biāo)準(zhǔn)熱激元件，然后與35S微啟動子連接構(gòu)成0m35S啟動子，序列為 5，-agKtcgacgattcccggtCggt actctatcattgatagagttaactccctatcagtgatagagai ttgtacctttgcgcgat
tactccacctttgcacaatcccctgggttgtgccacgacctttt:i￡l￡lal￡aflgaia￡a^iM￡l￡￡￡lal￡ail￡aia￡Ma
tgcatgacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagagaacacgggggactctagagg-3， (SEQ ID NO. 8)劃單線處分別為Ml I和)(ba I位點，劃雙線處為四環(huán)素操縱子序列，tatata為TATA 盒。人工合成(SEQ ID NO. 8)所示0m35S啟動子雙鏈核苷酸，并用Ml I和)(ba I進行雙酶切，回收0m35S啟動子，將回收的0m35S啟動子與所得的pVCT2027載體骨架用T4 DNA連接酶在16 °C連接過夜，即用0m35S啟動子替換pVCT2027載體上的HSF70m啟動子，得pVCT2034 載體,如圖4所示。pVCT2034載體中0m35S啟動子由于含有jTetC^-iTetOl,因此Rhsf表達(dá)的蛋白質(zhì)能夠與0m35S啟動子結(jié)合，在不含有四環(huán)素條件下，能夠啟動0m35S啟動子調(diào)控的基因表達(dá)。用EcoR I和Hind III酶切所得pVCT2034載體，瓊脂糖凝膠電泳，回收M08bp的 0m35S啟動子調(diào)控的⑶S基因表達(dá)盒；將回收的⑶S基因表達(dá)盒與實施例1中回收的帶EcoR I和Hind III酶切位點的PVCT2020載體骨架連接，連接條件為用T4 DNA連接酶在16°C連接過夜，即用⑶S基因表達(dá)盒插入pVCT2034載體的多克隆酶切位點處，得PVCT2035載體， 如圖4所示。用Ml I和PmaC I酶切所得pVCT2035載體，瓊脂糖凝膠電泳，棄35S啟動子和 mGFP5基因編碼區(qū)，回收10358bp的含0m35S啟動子調(diào)控的⑶S基因表達(dá)盒的pVCT2035載體骨架；同時用Ml I和Me I的同裂酶Ecll36 II酶切PVCT2033載體，瓊脂糖凝膠電泳， 回收M08bp的HSP70m啟動子和Iihsf基因片段，命名為HSP70m: :Rhsf ；將回收的pVCT2035 載體骨架與HSP70m: Ahsf片段連接，連接反應(yīng)在T4 DNA連接酶作用下16°C連接過夜，即將 HSP70m啟動子和Rhsf基因替換pVCT2035載體上的35S啟動子和mGFP5基因，得pVCT2041 載體，如圖4所示。所得pVCT2041載體中⑶S基因由0m35S啟動子調(diào)控表達(dá)，還含有HSP70m 啟動子調(diào)控的Misf基因表達(dá)盒。至此，熱激和四環(huán)素雙重控制系統(tǒng)構(gòu)建成功。將pVCT2041載體采用凍融法轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化根癌桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，得含 PVCT2041載體的EHA105。將煙草將含pVCT2041載體的EHA105菌液侵染葉盤法轉(zhuǎn)化煙草， 在含1. Omg/L四環(huán)素、150mg/L卡那霉素、2mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基上進行抗性篩選，得抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因煙草。用打孔機將轉(zhuǎn)基因煙草葉片打取直徑約Icm的圓片， 分別置于MS培養(yǎng)基上，將放有煙草葉片的培養(yǎng)基平均分成7個組，分別在5°C、20°C、25°C、 觀°C、30°C、35°C、40V條件下處理12小時。并以放置在含1. Omg/L四環(huán)素的MS培養(yǎng)基35°C 處理12小時為對照，將處理后的葉片用GUS染液進行染色檢測GUS酶活性，結(jié)果顯示5°C、 20°C和25°C處理后不能檢測到⑶S活性，而在^°C、30°C、35°C和40°C處理能檢測到了⑶S 酶活性，對照組也不能檢測到GUS酶活性，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明在溫度為條件下，在不含四環(huán)素的培養(yǎng)中GUS基因被成功誘導(dǎo)表達(dá)，在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能被誘導(dǎo)表達(dá)。取轉(zhuǎn)基因煙草葉片，用在35°C條件下處理12小時，再用打孔機將轉(zhuǎn)基因煙草葉片打取直徑約Icm的圓片，置于不含1. Omg/L四環(huán)素MS培養(yǎng)基上，在35°C條件下分別處理1 小時、2小時、3小時、4小時、5小時，處理后的葉片用GUS染液進行染色檢測GUS酶活性，處理1小時、2小時、3小時均能檢測到GUS酶活性，處理4小時、5小時不能檢測到GUS酶活性，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，在HSF70m熱激啟動在溫度下在4小時內(nèi)能夠誘導(dǎo) ⑶S基因的表達(dá)，其原因是四環(huán)素阻遏蛋白轉(zhuǎn)錄因子融合基因Misf表達(dá)，融合基因Misf中的TetR基因與0m35S啟動子結(jié)合，誘導(dǎo)⑶S基因的表達(dá)，因此能夠檢測到⑶S酶活性。在含有1. Omg/L四環(huán)素條件下，35°C誘導(dǎo)四環(huán)素阻遏蛋白轉(zhuǎn)錄因子融合基因Misf表達(dá)后與四環(huán)素結(jié)合并發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，而不能與0m35S啟動子結(jié)合，因此不能誘導(dǎo)⑶S基因的表達(dá)，而不能檢測到GUS酶活性。表明了熱激啟動子和四環(huán)素雙重調(diào)控系統(tǒng)的靈敏性較高，能夠?qū)⒁鸭せ畹南到y(tǒng)在4小時內(nèi)完全關(guān)閉。實施例4、熱激和四環(huán)素雙重調(diào)控的ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)的構(gòu)建根據(jù)Pl噬菌體的Cre重組酶基因(GenBank accession X03453)序列，設(shè)計引物， 上游引物為5，-accatggccaatttactgaccgtacacc-3，(SEQ ID NO. 9)，劃線處為 Nco I 位點；下游引物為 5，-gagctctaatcgccatcttccagca-3，(SEQ ID NO. 10)，劃線處為 Sac I 位點。以大腸桿菌菌株BM25. 8(Clontech，美國)基因組DNA為模板，用I^rin^tar HS DNA聚合酶(TaKaRa，日本)進行PCR擴增，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘，95°C變性10秒，50°C 退火20秒，72 0C延伸1分鐘10秒，3個循環(huán)，95 0C變性10秒，60 V退火20秒，72 °C延伸1分鐘10秒，27個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收1040bp的 Cre重組酶基因，回收Cre基因加“A”尾后，連接pMD18_T載體，得pVCT1251載體，如圖7所不。用Xba I和Nco I酶切所得pVCT1251載體，回收3727bp的pVCT1251載體骨架; 同時人工合成含有擬南芥At4g01735基因內(nèi)含子和猴SV40病毒外殼蛋白T抗原核定位信
Wi^^ll IEIii5' -ctagaaccatggtccatacttggattgattttgaagcccaagaagaagagaaagct ggc-3’ (SEQ IDN0. 11)，劃線部分為內(nèi)含子編碼序列，反義鏈為5’-catggccagctttctcttct tcttRRRcttcaaaatcaatccaaRtatRRaccatRRtt-3，(SEQ ID Ν0· 12)，劃線部分為內(nèi)含子編碼序列，將人工合成的正義鏈和反義鏈在94°C變性3分鐘，退火至60°C保溫2分鐘，構(gòu)成上游含有)(ba I粘性末端，下游含有內(nèi)切酶Nco I粘性末端，中間為擬南芥At4g01735基因內(nèi)含子和猴SV40病毒外殼蛋白T抗原核定位信號的雙鏈DNA，將獲得的雙鏈DNA與回收的 PVCT1251載體骨架用T4 DNA連接酶在16°C條件下過夜連接，得pVCT1252載體，如圖7所示。pVCT1252載體中Cre基因上游插入了擬南芥At4g01735基因內(nèi)含子和猴SV40病毒外殼蛋白T抗原核定位信號，Cre基因表達(dá)的Cre重組酶能夠成功定位于細(xì)胞核中。用Xba I和Me I酶切所得pVCT2027載體，棄⑶S基因編碼區(qū)，回收3106bp的 PVCT2027載體骨架；同時用)(ba I和Mc I酶切所得pVCT1252載體，回收含內(nèi)含子和核定位信號的Cre基因片段；將回收的PVCT2027載體骨架與Cre基因用T4 DNA連接酶在16°C 條件下過夜連接，即用含內(nèi)含子和核定位信號的Cre基因替換pVCT2027載體上的⑶S編碼區(qū)，得PVCT2136載體，如圖7所示。
用EcoRV單酶切pVCT2136載體，從pVCT2136載體的Cre基因中間切開，瓊脂糖凝膠電泳，回收PVCT2136載體骨架；同是根據(jù)PCAMBIA1301載體序列，設(shè)計⑶S基因內(nèi)含子引物，上游引物為 5，-gtaaatttctagtttttctccttc-3’ (SEQ ID NO. 13),下游引物為 5，_ct gtaactatcatcatcatcatag-3’ (SEQ ID NO. 14),以 pCAMBIA1301 載體為模板進行 PCR 擴增, PCR反應(yīng)條件為反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘，95°C變性10秒，53°C退火20秒，72°C延伸I分鐘10秒，3個循環(huán)，95°C變性10秒，60°C退火20秒，72°C延伸I分鐘10秒，27個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，回收190bp的內(nèi)含子片段；將回收的內(nèi)含子與PVCT2136載體骨架連接，連接反應(yīng)在為用T4 DNA連接酶在16°C條件下過夜連接，得pVCT2117載體，如圖7 所示。pVCT2117載體中⑶S基因內(nèi)含子插入pVCT2136載體的Cre基因內(nèi)部，形成擬南芥 At4g01735基因內(nèi)含子、猴SV40病毒外殼蛋白T抗原核定位信號和內(nèi)部含Gus內(nèi)含子的Cre 基因的結(jié)構(gòu)，命名為ntCre基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 26所示。pVCT2117載體中ntCre 基因由HSP70m啟動子調(diào)控表達(dá)，將ntCre基因和HSP70m啟動子命名為HSP70m: :ntCre。在 Cre基因前加核定位信號是為了將Cre基因表達(dá)的蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核中，添加At4g01735 基因內(nèi)含子和Gus基因內(nèi)含子避免原核細(xì)胞中表達(dá)的Cre酶具有活性，在構(gòu)建載體時發(fā)生刪除。用Sal I和Xba I酶切所得pVCT2117載體，瓊脂糖凝膠電泳，回收ntCre基因片段；同時用Sal I和Xba I酶切pVCT2034載體，瓊脂糖凝膠電泳，回收含有0m35S啟動子的 PVCT2034載體骨架。將回收的ntCre與pVCT2034載體骨架用T4 DNA連接酶在16°C條件下過夜連接，即將ntCre基因替換pVCT2034載體上的⑶S基因，得pVCT2139載體，如圖8所示。pVCT2139載體中，ntCre基因由0m35S啟動子調(diào)控表達(dá)，終止子為Tnos，命名為0m35S 啟動子調(diào)控的ntCre基因表達(dá)盒。用SalI和SacI酶切所得pVCT2139載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收1501bp 的0m35S啟動子和ntCre基因片段；同時用Sal I和Sac I酶切所得pVCT2041載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收含HSP70m啟動子調(diào)控的Rhsf基因表達(dá)盒的pVCT2041載體骨架； 將回收的PVCT2041載體骨架與0m35S啟動子調(diào)控的ntCre基因表達(dá)盒連接，連接反應(yīng)用 T4 DNA連接酶16°C過夜連接，得pVCT2219載體，如圖8所示。所得pVCT2219載體中含有 0m35S啟動子調(diào)控的ntCre基因表達(dá)盒和HSP70m啟動子調(diào)控的Rhsf基因表達(dá)盒，命名為 0m35S::ntCre::Tnos/HSP70m::Rhsf::Tnos。根據(jù)報道的擬南芥生態(tài)型Columbia(Arabidopsis thaliana L. Ecotype Columbia) AtCBF3 基因(GenBank accession No. AB013815)序列，設(shè)計引物，上游引物為 5，-ccataccaacaaaaaagacagag-3，(SEQ ID NO. 15),下游弓 I物為5，-gtactaaaaatggaaata ataatctgag-3’ (SEQ ID NO. 16)，以從擬南芥生態(tài)型Columbia基因組DNA為模板，進行PCR 擴增。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘，95°C變性10秒，51°C退火20秒，72°C延伸I分鐘， 30個循環(huán)；72°C延伸10分鐘；回收755bp大小的目的片段，回收片段連接pCR2. 1-T0P0載體(Invitrogen，US)，得 pCR2. l_AtCBF3 載體。用 EcoR I 酶切所得 pCR2. l_AtCBF3 載體， 瓊脂糖凝膠電泳，棄AtCBF3基因片段，回收載體骨架；將回收片段用T4 DNA連接酶自環(huán)化連接，連接反應(yīng)在T4 DNA連接酶作用下16°C連接過夜，得pCR2. Im載體。根據(jù)所得pCR2. Im載體,設(shè)計引物,上游引物為5’ _tcatgaccaaaatccct_3’ (SEQ ID NO. 17)(位于pCR2. Im載體的原核基因終止子上游)，下游引物為5’-ttcagaagaactcgtcaagaagg-3’ (SEQ ID NO. 18)(位于 pCR2. Im 載體的 Kan 抗性基因 CDS 的下游);以 pCR2. Im 載體為模板，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性2分鐘，95°C變性10秒，50°C退火20 秒，72°C延伸3分鐘，30個循環(huán)；72°C延伸10分鐘；PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定， 回收1240bp條帶，用T4 DNA連接酶16°C自環(huán)化過夜連接，得pVCT1191載體，如圖9所示。 所得PVCT1191載體中去除了 pCR2. Im載體中的Amp編碼區(qū)，含有卡那霉素原核抗性基因 (nptll，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)、fl復(fù)制子、LacZ基因、大腸桿菌復(fù)制子ColEl和原核抗性基因終止子，nptll上游含有原核啟動子，下游與終止子連接，命名為nptllm基因，在原核細(xì)胞中具有卡那霉素抗性。根據(jù)所得pVCT1191載體設(shè)計nptllm基因引物，上游引物為5’ —atactcgagctact gggctatctgg-3’ (SEQ ID NO. 19)(位于nptllm基因的啟動子上游,劃線處為XhoI位點), 下游弓I物為5 _c&tt&t&cg&&gtt&tcctgc&ggcggccgccc&gggccctggt&gctcttg&tccggc_3^ ( SEQID NO. 20)(劃線部分與nptllm基因的原核終止子末端正鏈序列互補)，以pVCT1191載體為模板，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘，95°C變性10秒，52°C退火 20秒，72°C延伸I分鐘20秒，3個循環(huán)，再經(jīng)95°C變性10秒，60°C退火20秒，72°C延伸I 分鐘20秒，27個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收1265bp的 nptllm基因。將回收的nptllm基因用下游帶LoxP位點的引物進行再擴增，上游引物為如 SEQ ID NO. 19 所TK序列，下游引物為 5,-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttatcc-3> (SEQ IDNO. 21)，P劃線部分為Lox位點，核酸序列如SEQ ID NO. 25所示;PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘，95 °C變性10秒，46°C退火20秒，72°C延伸I分鐘20秒，3個循環(huán)，再經(jīng)95°C變性10秒，60°C退火20秒，72°C延伸I分鐘20秒，27個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，PCR產(chǎn)物命名為nptIIm-LoxP組件，將回收的nptIIm-LoxP組件與pMD18_T載體連接，得pVCT1202 載體，如圖9所示。用Xho I酶切pCAMBIA1302載體(此載體由本實驗室保存，GenBank accession No.AF234298)，棄潮霉素抗性基因(hptll)，回收pCAMBIA1302載體骨架；同時用Xho I和 SalI酶切所得pVCT1202載體，回收含有nptllm-LoxP組件片段，將回收的pCAMBIA1302 載體骨架與nptllm-LoxP組件連接，連接反應(yīng)在T4 DNA連接酶作用下16°C連接過夜，SP npt I Im-LoxP組件替換pCAMBIA1302載體上的hptll基因，得pVCT2071載體。所得pVCT2071 載體中含有nptllm-LoxP組件序列，LoxP位點位于nptllm基因3’端,命名為第一 LoxP位點，同時nptllm基因由2個35S啟動子控制表達(dá)。用Xho I和EcoR I酶切所得pVCT2071載體，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，棄pCAMBIA1302 載體中的hptll基因的2個35S啟動子，回收pVCT2071載體骨架片段；同時根據(jù)pBIN19載體序列設(shè)計Pnos啟動子引物，上游引物為5’ -cggaattcagggagtcacgttatgac-3J (SEQ ID NO. 22),劃線處為 EcoR I 位點，下游引物為 -gttgtcgacgatccagatccggtgca-3> (SEQ ID NO. 23)，劃線處為Sal I位點，以pBIN19載體為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3分鐘，94 °C變性20秒，57 °C退火20秒，72 °C延伸I分鐘30秒，35個循環(huán)，最后72 °C 延伸10分鐘，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收303bp的Pnos啟動子，回收片段經(jīng)Sal I和 EcoRI雙酶切，回收299bp的Pnos啟動子酶切片段，將回收的pVCT2071載體骨架與Pnos啟動子酶切片段連接，連接反應(yīng)在T4 DNA連接酶作用下16°C連接過夜，即Pnos啟動子替換 PCAMBIA1302載體中的2個35S啟動子，得pVCT2072載體，如圖9所示。所得pVCT2072載體中nptllm基因由Pnos啟動子啟動表達(dá)。用PmaC I和XbaI酶切所得pVCT2072載體，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，棄35S啟動子和mGFP5基因，回收pVCT2072載體骨架片段；同時Not I酶切所得的pVCT1202載體，經(jīng) Klenow Fragment酶補為平末端，再用EcoRI酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收含ColEl復(fù)制子和LoxP位點的pVCT1202載體骨架，將回收的pVCT2072載體骨架與pVCT1202載體骨架連接，連接反應(yīng)在T4 DNA連接酶作用下16°C連接過夜，得pVCT2102載體，如圖10所示。 所得pVCT2102載體中在真核表達(dá)框的左邊界和右邊界之間含有2個LoxP位點，分別為第一 LoxP位點和第二 LoxP位點，位于nptllm基因3’端的為第一 LoxP位點和位于nptllm 基因5’端的為第二 LoxP位點。用EcoR I和Sal I酶切所得的pVCT2102載體，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收含有2 個LoxP位點的pVCT2102載體骨架；同時用EcoR I和Sal I酶切所得的pVCT2117載體，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收HSP70m啟動子調(diào)控的ntCre基因表達(dá)盒；將回收的pVCT2102載體骨架與ntCre基因表達(dá)盒連接，連接反應(yīng)在T4 DNA連接酶作用下16°C連接過夜，得pVCT2231 載體，如圖10所示。用Sal I酶切pVCT2231載體，然后用Klenow酶補為平末端，再用Sac I酶切， 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收含有LoxP位點的pVCT2231載體骨架；同時用BstE II酶切載體pVCT2219后用Klenow酶補為平末端，再用Sac I酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收含有 0m35S: :ntCre: :Tnos/HSP70m: :Rhsf: :Tnos 結(jié)構(gòu)的序列；將回收的 pVCT2231 載體骨架與 0m35S: :ntCre: :Tnos/HSP70m: :Rhsf: :Tnos結(jié)構(gòu)連接，連接反應(yīng)在T4 DNA連接酶作用下 16°C連接過夜，得含有熱激和四環(huán)素雙重調(diào)控的ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)的載體，即pVCT2262 載體，如圖10所示。pVCT2262工作原理如下在不含四環(huán)素條件下在溫度高于28°CHSP70m 啟動子能夠誘導(dǎo)Rhsf基因表達(dá)，Rhsf蛋白能夠調(diào)控0m35S啟動子，誘導(dǎo)ntCre基因表達(dá)， ntCre基因表達(dá)的Cre重組酶能夠特異識別Lox位點，刪除Lox位點之間的序列；在含有四環(huán)素條件下，四環(huán)素能夠與Rhsf蛋白結(jié)合,改變Rhsf蛋白的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致Rhsf蛋白不能調(diào)控 0m35S啟動子誘導(dǎo)ntCre基因表達(dá)。將PVCT2262載體采用凍融法轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化根癌桿菌菌株EHA105感受態(tài)細(xì)胞，得含 PVCT2028載體的EHA105。將含pVCT2028載體的EHA105菌液葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，在含I. Omg/ L四環(huán)素和150mg/L卡那霉素在MS附加2. 5mg/L BA的培養(yǎng)基上進行抗性篩選，得抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因煙草。將轉(zhuǎn)基因煙草一組轉(zhuǎn)移至只含150mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng) 35°C熱激處理10周，結(jié)果如圖Il(A)所示；另一組轉(zhuǎn)移至lmg/L四環(huán)素和150mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)35°C熱激處理10周，結(jié)果如圖11 (B)所示，結(jié)果顯示在含150mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的煙草中出現(xiàn)白化現(xiàn)象，而在含lmg/L四環(huán)素和150mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基上試管苗生長正常。結(jié)果表明，在含有I. Omg/L四環(huán)素和150mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，四環(huán)素能阻止高溫刪除LoxP位點之間的序列。將處理后的兩組轉(zhuǎn)基因煙草轉(zhuǎn)移至不含卡那霉素和四環(huán)素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)經(jīng)35°C熱激處理10周，轉(zhuǎn)基因煙草恢復(fù)正常生長，結(jié)果如圖11(C和D)所示。結(jié)果表明獲得的轉(zhuǎn)基因煙草，在無四環(huán)素條件下，卡那霉素抗性基因能夠在準(zhǔn)確的刪除，在培養(yǎng)基中添加四環(huán)素能防止在轉(zhuǎn)基因植株獲得過程中出現(xiàn)的非預(yù)期高溫啟動ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)，能夠用于植物轉(zhuǎn)基因中刪除抗性基因。本實施例以卡那霉素抗性基因為例，還可以為其他抗性基因，例如鏈霉素抗性基因、氨芐霉素抗性標(biāo)記基因、潮霉素抗性基因等抗性基因；也可以為非抗性基因的其他標(biāo)記基因，如Gus基因、GFP基因等標(biāo)記基因，同樣可以ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)有效的刪除。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.利用熱激和四環(huán)素雙重調(diào)控的ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)，其特征在于所述ntCre/LoxP 刪除系統(tǒng)包括ntCre重組酶特異識別的2個LoxP位點和位于2個LoxP位點之間的靶基因部分，所述2個LoxP位點分別為位于靶基因3’端的第一 LoxP位點和位于靶基因5’端的第二 LoxP位點；還包括HSF70m啟動子調(diào)控的Iihsf基因表達(dá)盒和0m35S啟動子調(diào)控的ntCre 重組酶基因表達(dá)盒部分，所述0m35S啟動子由Iihsf基因調(diào)控，所述HSF70m啟動子核酸序列如SEQID NO. 1所示，所述Iihsf基因核酸序列如SEQ ID NO. 24所示，所述0m35S啟動子核酸序列如SEQ ID NO. 8所示，所述LoxP位點核酸序列如SEQ ID NO. 25所示，所述ntCre重組酶基因核酸序列如SEQ ID NO. 26所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)，其特征在于所述ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)是所述第一 LoxP位點，靶基因，0m35S啟動子調(diào)控的ntCre重組酶基因表達(dá)盒，HSF70m 啟動子調(diào)控的Misf基因表達(dá)盒和第二 LoxP位點順序串聯(lián)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)，其特征在于所述靶基因為抗性標(biāo)記基因。
4.含有權(quán)利要求1-3任一項所述ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)的重組表達(dá)載體。
5.權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體的制備方法，其特征在于，具體步驟如下將含有 HSF70m啟動子調(diào)控的Iihsf基因表達(dá)盒和0m35S啟動子調(diào)控的ntCre重組酶基因表達(dá)盒部分連入pVCT2231載體的酶切位點處；所述PVCT2231載體由pCAMBIA1320載體、pVCT1191載體和pBmi9載體制備，具體步驟為從PVCT1191載體中克隆nptnm基因，并在nptnm基因3’端加上LoxP位點，獲得 nptIIm-LoxP組件，然后將nptllm-LoxP組件替換pCAMBIA1302載體上的潮霉素抗性基因 hptll，并將含LoxP位點的序列反向插入pCAMBIA1302載體，替換pCAMBIA1302載體的35S 啟動子和mGFP5基因編碼區(qū)；同時從pBIN19載體中克隆Pnos啟動子，替換pCAMBIA1302載體上調(diào)控hptll基因的2X35S啟動子，即得pVCT2231載體；所述PVCT1191載體由pCR2. 1-T0P0載體改造而來，具體為，刪除pCR2. 1-T0P0載體上氨芐抗性基因并自環(huán)化連接構(gòu)建的載體，即PVCT1191載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述重組表達(dá)載體的制備方法，其特征在于，所述pVCT2231載體制備具體步驟為(1)將所得nptllm-LoxP基因連入pMD18_T載體中，得pVCT1202載體，并用SalI和 XhoI雙酶切所得的pVCT1202載體，瓊脂糖凝膠電泳并回收nptllm-LoxP組件，將回收的 npt I Im-LoxP組件連入pCAMBIA1302載體的2個XhoI酶切位點之間，得pVCT2071載體；(2)克隆的所述Pnos啟動子，用MlI和EcoR I酶切，瓊脂糖凝膠電泳并回收，將所得的Pnos啟動子連入所得pVCT2071載體的Β ο I和EcoR I酶切位點之間，得pVCT2072載體；(3)用NotI酶切所得PVCT1202載體，用KlenowFragment酶補為平末端，再用XbaI 酶切，回收含LoxP位點的pVCT1202載體片段，同時用PmaCI和)(baI酶切所得pVCT2072載體，回收含nptnm基因的pVCT2072載體片段，將回收的pVCT1202載體片段與pVCT2072載體片段連接，得PVCT2231載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述重組表達(dá)載體的制備方法，其特征在于所述nptllm-LoxP組件的制備，具體步驟為(1)以所得PVCT1191載體為模板，上游引物如SEQID NO. 19所示核酸序列，下游引物如SEQ ID NO. 20所示核酸序列，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘，95°C 變性10秒，52°C退火20秒，72°C延伸1分鐘20秒，3個循環(huán)，再經(jīng)95°C變性10秒，60°C退火20秒，72°C延伸1分鐘20秒，27個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，得nptnm基因；(2)以所得nptnm基因為模板，上游引物如SEQID NO. 19所示核酸序列，下游引物如 SEQ ID NO. 21所示核酸序列，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘，95°C變性 10秒，46 V退火20秒，720C延伸1分鐘20秒，3個循環(huán)，再經(jīng)95 V變性10秒，60 V退火20 秒，72°C延伸1分鐘20秒，27個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，得nptIIm-LoxP組件。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項所述重組表達(dá)載體的制備方法，其特征在于所述Pnos啟動子制備方法，具體步驟為以PBIN19載體為模板，上游引物為如SEQ ID NO. 22核酸序列， 下游引物如SEQ ID N0. 23核酸序列，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3分鐘， 94°C變性20秒，57°C退火20秒，72°C延伸1分鐘30秒，35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘， 得Pnos啟動子。
9.權(quán)利要求1-3任一項所述ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用熱激和四環(huán)素雙重調(diào)控的ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)，所述ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)包括ntCre重組酶特異識別的2個LoxP位點和位于2個LoxP位點之間的靶基因部分，所述2個LoxP位點分別為位于靶基因3’端的第一LoxP位點和位于靶基因5’端的第二LoxP位點；還包括HSF70m啟動子調(diào)控的Rhsf基因表達(dá)盒和Om35S啟動子調(diào)控的ntCre重組酶基因表達(dá)盒部分，所述Om35S啟動子由Rhsf基因調(diào)控；該刪除系統(tǒng)受熱激和四環(huán)素雙重調(diào)控，能夠在無四環(huán)素環(huán)境下通過熱激刪除2個LoxP位點之間的靶基因；本發(fā)明還公開了含ntCre/LoxP刪除系統(tǒng)的重組表達(dá)載體，可以應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因中刪除靶基因，具有刪除周期短，操作簡單等優(yōu)點。
文檔編號C12N15/66GK102533749SQ201210032918
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月14日
發(fā)明者張興國, 張香琴, 朱利泉, 杜小兵, 眭順照, 蘇承剛 申請人:西南大學(xué)