專利名稱：與流感病毒復(fù)制相關(guān)的長鏈非編碼核酸片段以及它們的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與流感病毒復(fù)制相關(guān)的長鏈非編碼核酸片段以及它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, IncRNA)是指長200nt以上的不編碼蛋白質(zhì)的RNA。轉(zhuǎn)錄組計劃完成后，人們發(fā)現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞中4/5的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并不編碼蛋白質(zhì)，其中不少是IncRNA。最初以為這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物只是“噪音”，但近年的研究表明，IncRNA在細(xì)胞生命活動中發(fā)揮著重要而廣泛的作用。流感病毒是正粘病毒科的單鏈RNA病毒，因其基因變異迅速，大流行不斷發(fā)生。在全球范圍，流感每年導(dǎo)致幾十萬人死亡，預(yù)防接種及治療費用亦十分高昂。由于部分流感病毒毒株對金剛烷胺和金剛乙胺有耐藥性，目前有效的抗病毒藥物為神經(jīng)胺酸酶抑制劑達(dá)菲和扎那米韋，但價格昂貴，而且副作用及耐藥毒株亦有報道。研制新型抗病毒藥物的任務(wù)仍然艱巨。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供與流感病毒復(fù)制相關(guān)的長鏈非編碼核酸片段以及它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種shRNA(shRNAl)，其生成siRNA，所述siRNA為反向互補的雙鏈RNA，其中的一條鏈如序列表的序列11所示。所述shRNAl具體可如序列表的序列12所示。

編碼所述shRNAl的DNA分子(DNA分子I)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有所述DNA分子I的重組載體(重組載體1)1也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體I可為重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒I)或重組病毒(重組病毒I)。所述重組質(zhì)粒I具體可為在pSIH-Hl-copGFP慢病毒表達(dá)載體的BamHI和EcoRI酶切位點之間插入序列表的序列2自5’末端第6至64位核苷酸所示雙鏈DNA得到的重組質(zhì)粒。所述重組病毒I具體可為將將所述重組質(zhì)粒l、pPACKHl-GAG質(zhì)粒、pPACKHl-REV質(zhì)粒和pVSV_G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞(如293T細(xì)胞)得到的重組病毒。重組質(zhì)粒l、pPACKHl-GAG質(zhì)粒、pPACKHl-REV質(zhì)粒和pVSV-G質(zhì)粒的質(zhì)量配比優(yōu)選為1:1 :1 :1。本發(fā)明還提供了另一種shRNA (shRNA2)，其生成siRNA，所述siRNA為反向互補的雙鏈RNA，其中的一條鏈如序列表的序列13所示。所述shRNA2具體可如序列表的序列14所示。編碼所述shRNA2的DNA分子(DNA分子2)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有所述DNA分子2的重組載體(重組載體2)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體2可為重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒2)或重組病毒(重組病毒2)。所述重組質(zhì)粒2具體可為在pSIH-Hl-copGFP慢病毒表達(dá)載體的BamHI和EcoRI酶切位點之間插入序列表的序列4自5’末端第6至64位核苷酸所示雙鏈DNA得到的重組質(zhì)粒。所述重組病毒2具體可為將將所述重組質(zhì)粒2、pPACKHl-GAG質(zhì)粒、pPACKHl-REV質(zhì)粒和pVSV_G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞(如293T細(xì)胞)得到的重組病毒。重組質(zhì)粒l、pPACKHl-GAG質(zhì)粒、pPACKHl-REV質(zhì)粒和pVSV-G質(zhì)粒的質(zhì)量配比優(yōu)選為1:1 :1 :1。本發(fā)明還保護(hù)抑制IVDN8表達(dá)的產(chǎn)品在制備藥物中的應(yīng)用；所述藥物的作用為如下(a)和/或(b)和/或(c) (a)抑制流感病毒；(b)抑制流感病毒在細(xì)胞中的復(fù)制和/或釋放；(c)治療和/或預(yù)防流感。所述細(xì)胞具體可為A549細(xì)胞。所述流感病毒具體可為流感病毒W(wǎng)SN毒株。IVDN8為一種長鏈非編碼RNA，由序列表的序列I至序列5中任一所示DNA分子編碼。所述抑制IVDN8表達(dá)的產(chǎn)品為所述shRNAl、所述DNA分子1、所述重組質(zhì)粒1、所述重組病毒1、所述shRNA2、所述DNA分子2、所述重組質(zhì)粒2和所述重組病毒2中的至少一種。本發(fā)明還保護(hù)一種藥物，它的活性成分為抑制IVDN8表達(dá)的產(chǎn)品；所述藥物的作用為如下(a)和/或(b)和/或(c) (a)抑制流感病毒；(b)抑制流感病毒在細(xì)胞中的復(fù)制和/或釋放；(C)治療和/或預(yù)防流感。所述細(xì)胞具體可為A549細(xì)胞。所述流感病毒具體可為流感病毒W(wǎng)SN毒株。IVDN8為一種長鏈非編碼RNA，由序列表的序列I至序列5中任一所示DNA分子編碼。所述抑制IVDN8表達(dá)的產(chǎn)品為所述shRNAl、所述DNA分子1、所述重組質(zhì)粒1、所述重組病毒1、所述shRNA2、所述DNA分子2、所述重組質(zhì)粒2和所述重組病毒2中的至少一種。本發(fā)明還保護(hù)序列表的序列I所示的DNA片段。本發(fā)明還保護(hù)序列表的序列I所示的DNA片段編碼的RNA。

含有序列表的序列I所示的DNA片段的重組載體(重組載體3)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體可為重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒3)或重組病毒(重組病毒3)。所述重組質(zhì)粒3具體可為在pMIG逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的BglII和EcoRI酶切位點之間插入序列表的序列I所示雙鏈DNA得到的重組質(zhì)粒。所述重組病毒3具體可為將所述重組質(zhì)粒3、PCL-Eco質(zhì)粒和pCMV-VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞(如293T細(xì)胞)得到的重組病毒。重組質(zhì)粒UpCL-Eco質(zhì)粒和pCMV-VSV-G質(zhì)粒的質(zhì)量配比優(yōu)選為1:1 :1。序列表的序列I所示的DNA片段、序列表的序列I所示的DNA片段編碼的RNA、重組質(zhì)粒3或重組病毒3均可用于制備產(chǎn)品；所述產(chǎn)品的作用為促進(jìn)流感病毒在細(xì)胞中的復(fù)制和/或釋放。所述細(xì)胞具體可為A549細(xì)胞。所述流感病毒具體可為流感病毒W(wǎng)SN毒株。本發(fā)明還保護(hù)IVDN8作為靶點在開發(fā)治療和/或預(yù)防流感的藥物中的應(yīng)用。IVDN8為一種長鏈非編碼RNA，由序列表的序列I至序列5中任一所示DNA分子編碼。所述流感病毒具體可為流感病毒W(wǎng)SN毒株。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人肺癌細(xì)胞表達(dá)的一種長鏈非編碼RNA(IVDN8)可作為防治流感的新型藥物靶標(biāo)。IVDN8在細(xì)胞中呈組成型表達(dá)，參與流感病毒的感染復(fù)制過程。在細(xì)胞中人為過表達(dá)IVDN8時，流感病毒的復(fù)制水平略有增高；而干擾IVDN8的表達(dá)時，病毒的復(fù)制水平則降低?？梢奍VDN8被流感病毒利用以促進(jìn)自身的復(fù)制。感染了流感病毒的細(xì)胞中，細(xì)胞保護(hù)性機(jī)制下調(diào)IVDN8的表達(dá)水平。因此，通過藥物干擾或抑制IVDN8表達(dá)，從而抑制或降低流感病毒或其它病毒的復(fù)制水平，可預(yù)防性地保護(hù)機(jī)體與細(xì)胞，促進(jìn)人體對病毒的清除。這種以IVDN8為靶標(biāo)的抗病毒新機(jī)制和新方法將有助于降低流感的感染率、減輕癥狀或縮短病程。


圖1為感染流感病毒的A549細(xì)胞內(nèi)IVDN8表達(dá)水平降低；采用肌動蛋白mRNA作為內(nèi)參；1:A549細(xì)胞；2 :感染流感病毒的A549細(xì)胞。圖2為病毒感染復(fù)制過程與IVDN8豐度降低相關(guān)(實驗一);采用肌動蛋白mRNA作為內(nèi)參；1 A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞的RNA ；2 A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染感染病毒的A549細(xì)胞的RNA混合物；3 A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染CIAP處理過的RNA混合物。圖3為病毒感染復(fù)制過程與IVDN8豐度降低相關(guān)(實驗二 );采用肌動蛋白mRNA作為內(nèi)參；1 :A549細(xì)胞；2 :感染W(wǎng)SN毒株的A549細(xì)胞；3 :感染部分滅活病毒的A549細(xì)胞。圖4為Northern印跡鑒定IVDN8的主要表達(dá)形式；1 =Riboruler RNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；2 A549細(xì)胞RNA (30微克);3 :感染W(wǎng)SN毒株12小時后的A549細(xì)胞RNA (30微克)。圖5為IVDN8的干擾對病毒復(fù)制的影響實驗中重組細(xì)胞和對照細(xì)胞中的IVDN8水平；采用肌動蛋白mRNA作為內(nèi)參；1 :對照細(xì)胞(pSIH) ；2 :重組細(xì)胞甲(IVDN8shl) ；3 :重組細(xì)胞乙(IVDN8sh2)。

圖6為IVDN8干擾對病毒復(fù)制的影響實驗的HA滴度結(jié)果。圖7為IVDN8的過表達(dá)對病毒復(fù)制的影響實驗中重組細(xì)胞丙(pMIG_IVDN8A)和對照細(xì)胞(PMIG)中的IVDN8水平；采用肌動蛋白mRNA作為內(nèi)參。圖8為IVDN8過表達(dá)對病毒復(fù)制的影響實驗的HA滴度結(jié)果。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。MOI =每個細(xì)胞感染病毒的病毒顆粒數(shù)量。感染液為含2mg/mL胰蛋白酶的DMEM培養(yǎng)液。A549細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞系)美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American type culturecollection, ATCC)，編號為 CCL-185。流感病毒W(wǎng)SN毒株美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American type culturecollection, ATCC)，編號為 VR-825。實施例2中所用的包裝質(zhì)粒為pPACKHl質(zhì)粒混合物(由如下三種質(zhì)粒組成pPACKHl-GAG質(zhì)粒，pPACKHl-REV質(zhì)粒，pVSV-G質(zhì)粒)Lentivector Packaging Kit, SystemBiosciences,編號 LV100A-10實施例3中所用的包裝質(zhì)粒為pCL-Eco質(zhì)粒和pCMV_VSV_G質(zhì)粒兩個質(zhì)粒均為Addgene產(chǎn)品，編號分別為12371和8454。293T 細(xì)胞美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American type culture collection,ATCC)，編號為 CRL-11268。實施例1、流感病毒感染與細(xì)胞內(nèi)IVDN8表達(dá)相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)以及相關(guān)性的具體分析一、流感病毒感染與細(xì)胞內(nèi)IVDN8表達(dá)相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)
使用生物芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞在感染流感病毒后，胞內(nèi)一些長鏈非編碼RNA的表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，其中IVDN8的表達(dá)水平被下調(diào)。IVDN8的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列有多種IVDN8A (見序列表的序列 6，1194bp，基因位置為 chrl2 :119413206-119418111)、IVDN8B (見序列表的序列7，3587bp，基因位置為chr12 :119409495-119418132)、IVDN8C (見序列表的序列 8，1207bp，基因位置為 chr 12 :119413212-119418096)、IVDN8D (見序列表的序列 9，1209bp，基因位置為 chr 12 :119413206-119418095)、IVDN8E (見序列表的序列 10，1910bp，基因位置為chr 12 :119412514-119418111)等等。IVDN8A和IVDN8B是具有代表性的剪接異構(gòu)體。二、感染流感病毒的A549細(xì)胞內(nèi)IVDN8表達(dá)水平降低1、A549細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37°C，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱。2、吸棄步驟I的細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入感染液和WSN毒株(Μ0Ι = 3)，孵育I小時；設(shè)置不用WSN毒株感染的平行對照。3、將步驟2的細(xì)胞換用新感染液，繼續(xù)培養(yǎng)12小時。4、收集完成步驟3的細(xì)胞并提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。5、以cDNA為模板，用DN8M-F和DN8M-R組成的引物對(靶序列為IVDN8基因片段)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。DN8M-F:5’ -ATTCCTCCGCAACAGACACC-3’ ；DN8M-R 5，-CATGGCTTAGTAGGGACAGAT-3，。6、將步驟5的PC R擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖電泳分析，見圖1。結(jié)果表明，感染W(wǎng)SN毒株后A549細(xì)胞內(nèi)的IVDN8表達(dá)水平明顯下降。三、病毒感染復(fù)制過程與IVDN8豐度降低相關(guān)( 一 )實驗一1、A549細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37°C，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱。2、吸棄步驟I的細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入感染液和WSN毒株(Μ0Ι = 3)孵育I小時；設(shè)置不用WSN毒株感染的平行對照。3、將步驟2的細(xì)胞換用新感染液，繼續(xù)培養(yǎng)12小時。4、收集染毒細(xì)胞并提取RNA (包含細(xì)胞RNA及流感病毒感染復(fù)制過程中產(chǎn)生的RNA混合物)。同樣收集未感染W(wǎng)SN毒株的細(xì)胞，并提取RNA作為平行對照。5、取適量步驟4中染毒細(xì)胞的RNA，用CIAP(Takara，大連)進(jìn)行去磷酸化處理，以切掉病毒RNA5’端特有的三磷酸根，即去除病毒RNA上的病原相關(guān)分子模式(PAMP)，作為對照(CIAP處理過的RNA混合物)。6、將步驟4的染毒細(xì)胞RNA、步驟4的對照細(xì)胞RNA和步驟5的CIAP-RNA分別進(jìn)行如下操作:將2yg尺應(yīng)和5“1^轉(zhuǎn)染試劑]^€^(^3111；[1162000(1鮮;[11'€^11)混合，按照說明書方法，加入6孔板上新培養(yǎng)的A549細(xì)胞中，刺激細(xì)胞4小時。7、收集完成步驟6的細(xì)胞并提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。8、以cDNA為模板，用DN8M-F和DN8M-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
9、將步驟8的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖電泳分析，見圖2。染毒細(xì)胞的RNA混合物可引起IVDN8表達(dá)下降，對照細(xì)胞的RNA和CIAP處理過的RNA混合物均未引起IVDN8豐度的明顯變化。結(jié)果表明，病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的RNA是導(dǎo)致IVDN8表達(dá)下調(diào)的主要成分。( 二 )實驗二1、A549細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37°C，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱。2、將WSN毒株在56°C水浴中處理30min，得到部分滅活病毒(56°C滅活的病毒可感染細(xì)胞，但無法包裝或釋放出完整毒粒)。

3、吸棄步驟I的細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入感染液和WSN毒株(或步驟2得到的部分滅活病毒)，MOI = 5,孵育I小時；設(shè)置不用任何毒株感染的平行對照。4、將步驟3的細(xì)胞換用新感染液，繼續(xù)培養(yǎng)15小時。5、收集完成步驟4的細(xì)胞并提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。6、以cDNA為模板，用DN8M-F和DN8M-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。7、將步驟6的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖電泳分析，見圖3。相比未經(jīng)處理的WSN毒株引起的IVDN8豐度下降，56°C滅活的病毒可引起IVDN8豐度降低，但程度較輕。IVDN8豐度降低可能與病毒感染有關(guān)，而程度的減輕可能是由于缺少病毒復(fù)制過程形成的病原相關(guān)分子模式的刺激作用。結(jié)果表明，病毒的感染及復(fù)制過程均與IVDN8的表達(dá)下調(diào)相關(guān)。四、IVDN8在細(xì)胞內(nèi)的主要表達(dá)形式回收實施例1步驟二的5的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(長793bp)，進(jìn)行生物素標(biāo)記(Invitrogen),通過Northern印跡方法(Invitrogen)檢測A549細(xì)胞的RNA,觀察未感染W(wǎng)SN毒株的細(xì)胞中，以及感染W(wǎng)SN毒株12小時后，IVDN8在胞內(nèi)的主要表達(dá)形式及其長度。結(jié)果見圖4。A549細(xì)胞中IVDN8以長度約為1400nt的剪接形式(類似IVDN8A)為主，長約3800nt的RNA形式(類似IVDN8B)次之，量較少。當(dāng)A549細(xì)胞感染病毒后，長的IVDN8條帶未見明顯變化，相比之下，短的IVDN8表達(dá)水平下降，此外還出現(xiàn)第三種長約1800nt的RNA，表達(dá)量比HOOntRNA略少。實施例2、IVDN8A干擾表達(dá)實驗一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建(一 )重組質(zhì)粒甲的構(gòu)建1、合成序列表的序列2所示的單鏈DNA和序列表的序列3所示的單鏈DNA(在兩個單鏈DNA的兩端直接引入酶切位點的粘性末端)，并退火得到雙鏈DNA。2、用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI酶切pSIH-Hl-copGFP慢病毒表達(dá)載體(SystemBiosciences)，回收載體骨架(約 7200bp)。3、將步驟I的雙鏈DNA和步驟2的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒甲。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒甲進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在pSIH-Hl-copGFP慢病毒表達(dá)載體的BamHI和EcoRI酶切位點之間插入序列表的序列2自5’末端第6至64位核苷酸所示雙鏈DNA得到的重組質(zhì)粒。序列表的序列2自5’末端第6至64位核苷酸所示雙鏈DNA表達(dá)序列表的序列12所示的shRNA(shRNAl)。序列12所示的shRNA中，自5’末端第I至21位核苷酸和第34至54位核苷酸為反向互補序列，第12至33位核苷酸為間隔序列。序列12所示的shRNA在細(xì)胞內(nèi)生成siRNA，其中一條鏈如序列12自5’末端第I至21位核苷酸所示(序列表的序列11)，另一條鏈如序列12自5’末端第34至54位核苷酸所示。(二)重組質(zhì)粒乙的構(gòu)建1、合成序列表的序列4所示的單鏈DNA和序列表的序列5所示的單鏈DNA，并退火得到雙鏈DNA。2、用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI酶切pSIH-Hl-copGFP慢病毒表達(dá)載體(SystemBiosciences，編號 SI501A-1)，回收載體骨架(約 7200bp)。3、將步驟I的雙鏈DNA和步驟2的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒乙。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒乙進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在pSIH-Hl-copGFP慢病毒表達(dá)載體的BamHI和EcoRI酶切位點之間插入序列表的序列4自5’末端第6至64位核苷酸所示雙鏈DNA得到的重組質(zhì)粒。序列表的序列4自5’末端第6至64位核苷酸所示雙鏈DNA表達(dá)序列表的序列14所示的shRNA (shRNA2)。序列14所示的shRNA中，自5’末端第I至21位核苷酸和第34至54位核苷酸為反向互補序列，第12至33位核苷酸為間隔序列。序列14所示的shRNA在細(xì)胞內(nèi)生成siRNA，其中一條鏈如序列14自5’末端第I至21位核苷酸所示(序列表的序列13)，另一條鏈如序列14自5’末端第34至54位核苷酸所示。(三)對照質(zhì)粒對照質(zhì)粒的名稱為pSIH -突光素酶shRNA,突光素酶shRNA模板購自SystemBiosciences,按照說明構(gòu)建；對照質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)在pSIH_Hl慢病毒表達(dá)載體的BamHI和EcoRI酶切位點之間插入了熒光素酶shRNA的編碼基因。二、IVDN8干擾對病毒復(fù)制的影響(一)重組細(xì)胞和對照細(xì)胞的獲得按照說明書(System Biosciences),將重組質(zhì)粒甲與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝出攜帶shRNAl編碼DNA的假病毒顆粒，然后將所述假病毒顆粒感染A549細(xì)胞，得到重組細(xì)胞甲(IVDN8shl細(xì)胞株)。按照說明書(System Biosciences),將重組質(zhì)粒乙與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝出攜帶shRNA2編碼DNA的假病毒顆粒，然后將所述假病毒顆粒感染A549細(xì)胞，得到重組細(xì)胞乙(IVDN8sh2細(xì)胞株)。按照說明書(System Biosciences),將對照質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝出攜帶熒光素酶shRNA編碼DNA的假病毒顆粒，然后將所述假病毒顆粒感染A549細(xì)胞，得到對照細(xì)胞甲(PSIH細(xì)胞株)。步驟(一)制備重組細(xì)胞(或?qū)φ占?xì)胞)的過程中，重組質(zhì)粒(或?qū)φ召|(zhì)粒)與三個包裝質(zhì)粒的質(zhì)量比1:1 :1 :1。( 二)重組細(xì)胞和對照細(xì)胞中IVDN8表達(dá)水平的鑒定提取重組細(xì)胞甲、重組細(xì)胞乙或?qū)φ占?xì)胞甲的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，用DN8M-F和DN8M-R組成的引物對進(jìn)行PCR鑒定(靶序列約為793bp)。結(jié)果見圖5。與對照細(xì)胞甲相比，表達(dá)shRNAl的細(xì)胞株(IVDN8shl)中IVDN8表達(dá)水平降低70% -90%，表達(dá)shRNA2的細(xì)胞株(IVDN8sh2)中IVDN8表達(dá)水平降低約30% -50%。(三)IVDN8干擾對病毒復(fù)制的影響將重組細(xì)胞甲、重組細(xì)胞乙或?qū)φ占?xì)胞甲分別進(jìn)行如下實驗1、細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37°C，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱。2、吸棄步驟I的細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入感染液和WSN毒株(Μ0Ι = O. 3)，孵育I小時。3、將步驟2的細(xì)胞換用新感染液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。4、不同時間(感染后10h_24h)取步驟3的細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過血凝試驗觀察病毒復(fù)制水平。血凝試驗具體步驟如下在96孔U型平板上，將細(xì)胞培養(yǎng)上清用PBS緩沖液進(jìn)行系列2倍稀釋，獲得2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048倍稀釋液各25 μ L，每孔加入25 μ L O. 5%雞血紅細(xì)胞，室溫放置30min，記錄發(fā)生血凝的最大稀釋度(即HA滴度)。結(jié)果見圖6。干擾IVDN8表達(dá)的細(xì)胞株釋放的病毒毒粒低于對照細(xì)胞。結(jié)果提示，通過干擾IVDN8表達(dá)的方法，可減少細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制或毒粒釋放。實施例3、IVDN8A過表達(dá)實驗一、重組質(zhì)粒丙的構(gòu)建1、提取A549細(xì)胞的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

2、以步驟I的cDNA為模板，用IVDN8A-F和IVDN8A-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。IVDN8A-F :5，-tttgagatctacggcgtcggttg-3^ ；IVDN8A-R :5，-tggt_gaattcgagaggtggactcac-3^ 3、用限制性內(nèi)切酶BglII和EcoRI酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶BglII和EcoRI酶切pMIG逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體(Addgene公司)，回收載體骨架(約6000bp)。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒丙。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒丙進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在PMIG逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的BglII和EcoRI酶切位點之間插入序列表的序列I所示雙鏈DNA得到的重組質(zhì)粒。二、IVDN8過表達(dá)對病毒復(fù)制的影響(一)重組細(xì)胞和對照細(xì)胞的獲得將重組質(zhì)粒丙與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝出攜帶IVDN8A片段編碼DNA的假病毒顆粒，然后將所述假病毒顆粒感染A549細(xì)胞，得到重組細(xì)胞丙(pMIG-1VDN8A細(xì)胞株)。重組質(zhì)粒丙、PCL-Eco質(zhì)粒和pCMV-VSV-G質(zhì)粒的質(zhì)量比1:1 :1。按照以上方法，將pMIG逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝出假病毒顆粒，然后將所述假病毒顆粒感染A549細(xì)胞，得到對照細(xì)胞乙(pMIG細(xì)胞株)。pMIG逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體、PCL-Eco質(zhì)粒和pCMV-VSV-G質(zhì)粒的質(zhì)量比1:1 :1。(二)重組細(xì)胞和對照細(xì)胞中IVDN8表達(dá)水平的鑒定提取重組細(xì)胞丙或?qū)φ占?xì)胞乙的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，用DN8M-F和DN8M-R組成的引物對進(jìn)行PCR鑒定(靶序列約為793bp)。結(jié)果見圖7。pMIG-1VDN8A細(xì)胞株中IVDN8的表達(dá)量顯著高于pMIG細(xì)胞株。(三)IVDN8過表達(dá)對病毒復(fù)制的影響
將IVDN8A細(xì)胞株和pMIG細(xì)胞株分別進(jìn)行如下實驗1、細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37°C，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱。2、吸棄步驟1的細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入感染液和WSN毒株(Μ01 = O. 8)，孵育I小時。3、將步驟2的細(xì)胞換用新感染液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。4、不同時間(感染后10h_24h)取步驟3的細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過血凝試驗觀察病毒復(fù)制水平。血凝試驗具體步驟同實施例3的步驟三的4。結(jié)果見圖8。過表達(dá)細(xì) 胞株(PMIG-1VDN8A)釋放至上清中的病毒高于對照細(xì)胞(pMIG)。這表明IVDN8的功能活性是參與并促進(jìn)流感病毒的感染復(fù)制過程。
序列表
〈110〉中國科學(xué)院微生物研究所
〈120〉與流感病毒復(fù)制相關(guān)的長鏈非編碼核酸片段以及它們的應(yīng)用
〈130〉 CGGNAY122068
〈160〉 14
〈210〉 I〈211〉 1194〈212〉 DNA
〈213〉人屬人 iMomo sapiens)
〈400〉 I
acggcgtcggttgcccgggcaatgggccgcacgctacgaggcccacacacccagaaggtg60gagccccggccgggttacgcggaccacccagctgtctggagagatgaagaaaatgaggtt120caaagagatgaagtctcttgcctaaagtcagtgacagaaagtgacagagctgggatgtga180atcctggtctgactctacagtcccacatggtagatggaacctccgagcaaCHCdcLcLcLCcL240aagggagttgatgcctccgaacagagtaatgtcgctggagacactaagcatcgtcggccc300ctggcaggagctccctaaatatgtgttggatggatggaagaaaggatggatagttcagag360tacttcagccttgattcctccgcaacagacacctgaaacttgaccctacattggttcttg420gccatcgtgatcttccttggacagaatcacctttcagctccggtcatcagactttcccag480ggccctcagaaagcccttcagagttgttactcacaggcaggctgagggattccttacggg540gtctgcagctctcctcacctcatccacaagtaggaccgtggcctgttcctcactactgcc600ccaggatcactctgttcccagcccagtccagcaatcacttgtctagctttctggaacctt660gagtactttcttgaaccatgagtcctgtgaccaccctagcagctctaaccctcccttatc720tgaaaggaagtgtgaggtgaccttgcaggtcccagagttgattgaagaccccatccagaa780agaaggcaccctgtgggagagattgcaaggcctaggtctgaatccggaagcttccacccc840atggagaagggctggcaccagcctggggctggcagtggagctgagctttggagccaagga900clglaclgcaglgcagggagaglgaggccagaaaggclgagacaaclcagggaaagaaaa960
cctcccttct ggctaatagtcaagcaccgc ctgagtagac caacactctc ctgtccacag1020
gggcagcaga tgaagacaca accagagagg actaacaggc cccctcagct ctcagtcaga1080
gggcagagca acacagaata gacattaaag gaacagactt tgaggccagg cagccttggg1140
tgtgcatctg tccctactaa gccatgtgac attaaacaag tgagtccacc tctc1194
<210〉2
〈211〉65
<212〉DNA〈213〉人工序列
〈220〉
<223>
<400〉 2
gatccgccct tcagagttgt tactttcttc ctgtcagaaa agtaacaact ctgaagggct60
ttttg65
〈210〉3
〈211〉65
〈212〉DNA<213>人工序列
〈220〉
<223>
〈400〉 3
aattcaaaaa gcccttcaga gttgttactt ttctgacagg aagaaagtaa caactctgaa60
gggcg65
權(quán)利要求
1.一種shRNA，其生成SiRNAJy^ii siRNA為反向互補的雙鏈RNA，其中的一條鏈如序列表的序列11所示。
2.—種shRNA，其生成siRNA，所述siRNA為反向互補的雙鏈RNA，其中的一條鏈如序列表的序列13所示。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述shRNA的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求3所述DNA分子的重組載體。
5.抑制IVDN8表達(dá)的產(chǎn)品在制備藥物中的應(yīng)用；所述藥物的作用為如下(a)和/或(b)和/或(c) (a)抑制流感病毒；(b)抑制流感病毒在細(xì)胞中的復(fù)制和/或釋放；(C)治療和/或預(yù)防流感。
6.一種藥物，它的活性成分為抑制IVDN8表達(dá)的產(chǎn)品；所述藥物的作用為如下(a)和/或(b)和/或(c) (a)抑制流感病毒；(b)抑制流感病毒在細(xì)胞中的復(fù)制和/或釋放；(c)治療和/或預(yù)防流感。
7.序列表的序列I所示的DNA片段或序列表的序列I所示的DNA片段編碼的RNA。
8.含有權(quán)利要求7所述DNA片段的重組質(zhì)粒。
9.權(quán)利要求7所述DNA、權(quán)利要求7所述RNA或權(quán)利要求8所述重組質(zhì)粒在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的作用為促進(jìn)流感病毒在細(xì)胞中的復(fù)制和/或釋放。
10.1VDN8作為靶點在開發(fā)治療和/或預(yù)防流感的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了與流感病毒復(fù)制相關(guān)的長鏈非編碼核酸片段以及它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供的shRNA，其生成siRNA，所述siRNA為雙鏈RNA，如序列表的序列11或序列13所示。所述shRNA具體可如序列表的序列12或序列14所示。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人肺癌細(xì)胞表達(dá)的一種長鏈非編碼RNA(IVDN8)可作為防治流感的新型藥物靶標(biāo)，干擾IVDN8的表達(dá)時，病毒的復(fù)制水平則降低。因此，通過藥物干擾或抑制IVDN8表達(dá)，從而抑制或降低流感病毒或其它病毒的復(fù)制水平，可預(yù)防性地保護(hù)機(jī)體與細(xì)胞，促進(jìn)人體對病毒的清除。這種以IVDN8為靶標(biāo)的抗病毒新機(jī)制和新方法將有助于降低流感的感染率、減輕癥狀或縮短病程。
文檔編號C12N15/63GK103045592SQ20121002736
公開日2013年4月17日 申請日期2012年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月8日
發(fā)明者陳吉龍, 歐陽晶 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所