分泌抗血管生成抗體支架和可溶性受體的細胞系及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供編碼基于抗體的支架例如完全抗體、抗體Fab片段、單鏈抗體、可溶性VEGF受體-Fc融合蛋白和/或抗血管生成PDGF受體的核酸和多肽序列。還包括編碼這類抗血管生成抗體支架、VEGF受體和/或PDGF受體的細胞系。本發(fā)明還提供能夠遞送這類抗血管生成抗體支架、VEGF受體和/或PDGF受體的包封細胞療法裝置以及使用這些裝置遞送抗血管生成抗體支架、VEGF受體和/或PDGF受體以醫(yī)治患者的病癥的方法，所述病癥包括眼科疾病、血管疾病、炎性疾病和細胞增殖疾病。
【專利說明】分泌抗血管生成抗體支架和可溶性受體的細胞系及其用途
[0001]相關申請
本申請要求2010年12月2日提交的U.S.S.N.61/419，138的優(yōu)先權，所述申請通過引用以其整體結合到本文中。
發(fā)明領域
[0002]本發(fā)明總的來說涉及包封細胞療法(encapsulated cell therapy)領域。
[0003]發(fā)明背景
可以通過向患者供應由活細胞產生的一種或多種生物活性分子或通過從患者中除去由活細胞代謝的有害因子來醫(yī)治或減輕許多臨床病況、缺陷和疾病狀態(tài)。在許多情況下，這些分子可恢復或抵償器官或組織功能的損害或損失。因此，許多研究人員試圖通過移植提供分泌產物或影響代謝功能的完整器官、器官組織和/或細胞，來重構器官或組織功能。然而，雖然這類移植可提供顯著益處，但是在其應用中受到限制，因為對于移植是合適且是可得到的器官數目相對較少。此外，移植患者一般必須受免疫抑制以避免移植物的免疫排斥，免疫排斥引起移植物功能喪失和移植組織或細胞最終壞死。同樣地，在許多情況下，移植必須長期保持功能，甚至是患者有生之年。保持患者處于免疫抑制狀態(tài)持續(xù)相當的時間既是不希望的又是昂貴的。
[0004]在一個實例中，其中仍需要其它有效療法的是危及視力的眼部病癥。在治療這類疾病中的一個主要問題是因存在血-視網膜屏障而無法將治療劑遞送至眼部，以及以治療有效濃度將其保持在眼部。
[0005]許多生長因子在眼部疾病的治療中已顯示出希望。例如，已表明在各種動物模型中，BDNF和CNTF減緩視網膜神經節(jié)細胞的變性并減少光感受器的退化。參見例如GeneticTechnology News,第13卷,第I期(1993年I月)。另外，已表明神經生長因子在視神經切開術后提高視網膜神經節(jié)細胞存活，并且還表明在缺血后促進視網膜神經元恢復。參見例如 Siliprandi 等，Invest.0phthalmol.& Vis.Sc1., 34,第 3232-3245 頁(1993)。最近，設計出基于抗體支架(antibody scaffold)的生物制劑，并用于眼病癥,包括例如完全抗體(例如貝伐單抗)和抗體支架Fab片段(例如雷珠單抗(Ranibizumab))和免疫球蛋白Fc (例如阿柏西普(Aflibercept))。
[0006]移植程序的一個可取的替代方式是植入物理屏障(physical barrier)內的細胞或組織，所述物理屏障允許營養(yǎng)物、代謝物和分泌產物擴散，但將阻斷免疫排斥的細胞和分子效應物。已研究了保護產生所選產物的組織或細胞免于免疫系統(tǒng)的各種裝置。參見例如美國專利號5，158，881、W092/03327、W091/00119和W093/00128，所述每個專利均通過引用以其整體結合到本文中。這些裝置包括例如血管外擴散室(extravascular diffusionchamber)、血管內擴散室、血管內超濾室和微囊化細胞植入。參見Scharp, D.W.等，WorldJ.Surg., 8，第 221-9 頁(1984)。參見例如 Lim 等，Science 210: 908-910 (1980)；Sun, A.Μ., Methods in Enzymology 137: 575-579 (1988) ；W0 93/03901 和美國專利號5，002，661。這類裝置的使用可減少保持患者處于免疫抑制狀態(tài)的需要。然而，對于提供長期移植物功能，這些方法無一是令人滿意的。
[0007]因此，需要在延長的時間將合適量的所需物質遞送(或提供其它所需代謝功能)至眼或身體其它部位的方法，所需物質例如神經營養(yǎng)因子、抗血管生成因子、抗炎因子、酶、激素或其它因子。
[0008]發(fā)明概述
本文提供編碼包括抗體-支架、可溶性血管內皮生長因子(VEGF)受體和/或血小板衍生生長因子(TOGF)受體在內的抗血管生成蛋白的分離核酸，其中所述核酸包含選自以下的序列或由選自以下的序列組成:SEQ ID N0:USEQ ID NO:3,SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:19,SEQ ID NO: 21,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID N0:29 和 SEQ IDN0:31。本發(fā)明還提供編碼包含選自以下的氨基酸序列或由選自以下的氨基酸序列組成的多肽的核酸分子:SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO:
22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30 和 SEQ IDN0:32。
[0009]還提供編碼具有與SEQID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或
32的任一個有至少95%同一性的序列的多肽的核酸分子?；蛘?，所述核酸分子可為這類核酸分子的互補序列。本文所用術語“核酸分子”欲包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸類似物產生的DNA或RNA的類似物及其衍生物、片段和同源物。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA。
[0010]本文所用“分離的”核酸分子是與存在于核酸來源的其它核酸分子分離的核酸分子。優(yōu)選“分離的”核酸不含位于該核酸來源于其中的生物基因組DNA的該核酸側翼的序列(即位于該核酸5’和3’端的序列)。例如，在不同的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子可含有小于約5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、l kb、0.5 kb或0.1 kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于所述核酸來源于其中的細胞基因組DNA的該核酸分子的側翼。此外，“分離的”核酸分子，例如cDNA分子，當通過重組技術產生時，可基本上不含其它細胞物質或培養(yǎng)基，或者當化學合成時，基本上不含化學前體或其它化學物質。例如，本領域技術人員應認識到，“分離的”核酸可以是最初來自噬菌體展示篩選的完全合成的分子。因此，在這種情況下，“分離的”核酸可以是基本上不含其它細胞物質、培養(yǎng)基、化學前體、化學物質等的合成分子。
[0011]可采用標準分子生物技術和本文提供的序列信息來制備本發(fā)明的核酸分子(例如具有選自以下核苷酸序列的核酸分子:SEQ ID NO: USEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 5,SEQID NO: 7,SEQ ID NO: 9,SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 17,SEQID NO: 19,SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29 和SEQ ID N0:31 ;編碼具有選自以下序列的多肽的核酸分子:SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO: 16、SEQID NO:18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID N0:30和SEQ ID NO:32或這些核苷酸序列任一個的互補序列)。使用這些核酸序列的全部或部分，可采用標準雜交和克隆技術分離雜交探針或可溶性VEGF受體或TOGF受體分子(例如描述于 Sambrook 等(主編)，Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第 2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY, 1989 ;以及Ausubel等(主編)，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York,NY,1993)。
[0012]可按照標準PCR擴增和裝配技術，使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板和合適的寡核苷酸引物，來擴增本發(fā)明的任何核酸?？蓪⑷绱藬U增的核酸克隆至合適的載體中，并通過DNA序列分析進行表征。此外，可通過標準合成技術，例如使用自動化DNA合成儀，來制備對應于抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR核苷酸序列的寡核苷酸。
[0013]本文所用術語“寡核苷酸”是指一系列連接的核苷酸殘基，所述寡核苷酸具有足夠數目的核苷酸堿基用于PCR反應。短的寡核苷酸序列可以基因組或cDNA序列為基礎，或者由基因組或cDNA序列設計，并且用來擴增、證實或揭示特定細胞或組織中相同、相似或互補DNA或RNA的存在情況。寡核苷酸包含長度為約10 nt、50 nt或100 nt，優(yōu)選長度約15nt-30 nt的核酸序列的部分。在一個實施方案中，包含長度小于100 nt的核酸分子的寡核苷酸還可包含 SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29 或 31 或其互補序列的至少6個連續(xù)核苷酸。寡核苷酸可以是化學合成的，并且可用作探針。
[0014]在其它實施方案中，本發(fā)明的分離核酸分子包含是SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、
13、15、17、19、21、23、25、27、29或31所示核苷酸序列的互補序列的核酸分子。與這些核苷酸序列互補的核酸分子是這樣的核酸分子:與其可氫鍵結合的核苷酸序列充分互補且?guī)缀鯖]有錯配或沒有錯配，從而形成穩(wěn)定的雙鏈體。
[0015]本文所用術語“互補”是指核酸分子的核苷酸單元之間的Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對，而術語“結合”意指兩個多肽或化合物或相關多肽或化合物或其組合之間的物理或化學相互作用。結合包括離子、非離子、范德瓦爾斯、疏水相互作用等。物理相互作用可以是直接或間接的。間接相互作用可通過另一種多肽或化合物的作用產生或由另一種多肽或化合物的作用所致。直接結合是指相互作用不通過另一種多肽或化合物的作用而產生或者不因另一種多肽或化合物的作用所致而產生，而取而代之的是沒有其它顯著的化學中間體。
[0016]此外，本發(fā)明的核酸分子可只包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、
23、25、2、29或31的核酸序列的一部分，例如可用作探針或引物的片段或編碼本發(fā)明的抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或I3DGF受體的任一種的生物活性部分的片段。本文提供的片段分別定義為至少6個(連續(xù))核酸或至少4個(連續(xù))氨基酸的序列，該長度分別在核酸的情況下足以允許特異性雜交或在氨基酸的情況下足以允許表位的特異性識別，并且比全長序列至多少一些部分。片段可來源于所選核酸或氨基酸序列的任何連續(xù)部分。衍生物是直接地或通過修飾或部分取代由天然化合物形成的核酸序列或氨基酸序列。類似物是具有類似(但又不同于)天然化合物的結構卻在某些組分或側鏈方面不同的核酸序列或氨基酸序列。類似物可以是合成的或來自不同的進化起源，并且與野生型相比，可具有類似或相反的代謝活性。同源物是來源于不同物種的特定基因的核酸序列或氨基酸序列。
[0017]如果衍生物或類似物含有修飾的核酸或氨基酸，則衍生物和類似物可以是全長的或非全長的。本發(fā)明的核酸或蛋白質的衍生物或類似物包括但不限于以下分子:包含在相同大小的核酸或氨基酸序列內或當與其中通過本領域已知計算機同源性程序進行比對的比對序列比較時，與本發(fā)明的核酸或蛋白質基本同源、在不同實施方案達至少約30%、50%、70%、80%或95%同一性(優(yōu)選50-95%同一性)的區(qū)域，或者其編碼核酸能夠與編碼上述蛋白質的序列的互補序列在嚴格、中等嚴格或低嚴格條件下雜交。參見例如AusubeI等，CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993 和下文。
[0018]本發(fā)明還包括因遺傳密碼的簡并性所致而不同于SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、
15、17、19、21、23、25、27、29或31所示核苷酸序列、但因此編碼與由SEQ ID NO: 1、3、5、7、
9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31所示核苷酸序列所編碼的相同的抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR蛋白的核酸分子。
[0019]在另一個實施方案中，本發(fā)明的分離核酸分子的長度為至少6個核苷酸，并在嚴格條件下與包含 SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29 或 31 的核苷酸序列的核酸分子雜交。在另一個實施方案中，核酸的長度為至少10、25、50、100、250、500、1000,1500,2000個或更多個核苷酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明的分離核酸分子與編碼區(qū)例如 SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29 或 31 雜交。[0020]本文所用術語“在嚴格條件下雜交”旨在描述彼此至少60%同源的核苷酸序列通常彼此保持雜交的雜交和洗滌條件。此外，本文所用短語“嚴格雜交條件”是指探針、引物或寡核苷酸將與其靶序列但不與其它序列雜交的條件。嚴格條件是序列依賴性的，在不同環(huán)境下將不同。與較短的序列相比，較長的序列在較高溫度下特異性地雜交。一般來講，選擇在規(guī)定離子強度和PH下低于特定序列熱熔點(Tm)約5°C的嚴格條件。Tm是與靶序列互補的探針的50%與靶序列雜交達到平衡時的溫度(在規(guī)定的離子強度、pH和核酸濃度下)。由于靶序列一般過量存在，因此在Tm下，在平衡下50%的探針被占據。嚴格條件通常是以下條件:其中在PH 7.0-8.3下，鹽濃度小于約1.0 M鈉離子、通常約0.01-1.0 M鈉離子(或其它鹽)，且對于短的探針、引物或寡核苷酸(例如10 nt-50 nt)，溫度為至少約30°C，而對較長的探針、引物和寡核苷酸，溫度為至少約60°C。嚴格條件還可通過加入去穩(wěn)定劑(例如甲酰胺)實現。
[0021]嚴格條件是本領域技術人員已知的，可見于Ausubel等(主編)，CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6。優(yōu)選所述條件使得彼此至少約65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%或99%同源的序列通常保持彼此雜交。嚴格雜交條件的非限制性實例是在65°C下在包含6X SSC、50 mM Tris-HCl (pH7.5)、I mM EDTA、0.02% PVP、0.02% 菲可(Ficoll)、0.02% BSA 和 500 mg/ml 變性鮭精 DNA的高鹽緩沖液中雜交，接著在50°C下在0.2X SSC,0.01% BSA—次或多次洗滌。中等嚴格雜交條件的非限制性實例是在55°C下在6X SSC、5X Denhardt溶液、0.5% SDS和100 mg/ml變性鮭精DNA中雜交，接著在37°C下在IX SSC、0.1% SDS中一次或多次洗滌。可采用的其它中等嚴格條件是本領域眾所周知的。參見例如Ausubel等(主編)，1993，CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY 和 Kriegler, 1990, GeneTransfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY。低嚴格性雜交條件的非限制性實例是在40°C下在35%甲酰胺、5X SSC、50 mM Tris-HCl (pH 7.5),5mM EDTA、0.02% PVP、0.02% 菲可、0.2% BSAU00 mg/ml 變性鮭精 DNA、10% (wt/vol)硫酸葡聚糖中雜交，接著在 50°C下在 2X SSC,25 mM Tris-HCl (pH 7.4)、5 mM EDTA 和 0.1% SDS中一次或多次洗滌?？刹捎玫钠渌蛧栏裥詶l件是本領域眾所周知的(例如物種間雜交所用的條件)。參見例如 Ausubel 等(主編)，1993, Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, NY和Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual, Stockton Press, NY ;Shilo和Weinberg, 1981, Proc Natl AcadSci USA 78\ 6789-6792。
[0022]還提供本文所述的任何核酸分子編碼的多肽。例如，這些多肽可以是抗血管生成抗體支架和/或可溶性VEGF受體或TOGF受體。在一些實施方案中，本文所述抗血管生成抗體支架和/或可溶性VEGF受體或TOGF受體(例如優(yōu)先)與VEGF結合。這些抗血管生成抗體支架和/或可溶性VEGF受體與VEGF的結合或與TOGF受體聯合與TOGF的結合抑制內皮細胞增殖和血管通透性。
[0023]本發(fā)明還包括與具有SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32的氨基酸序列的多肽有至少80%同一性的分離多肽。或者，分離多肽與具有SEQ IDNO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 或 32 的氨基酸序列的多肽的片段(即至少6個連續(xù)氨基酸)為至少80%同源。此外，本發(fā)明還包括與具有SEQ ID NO: 2、4、6、8、
10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32的氨基酸序列的多肽的衍生物、類似物或同源物至少80%同源的分離多肽。同樣地，本發(fā)明還提供與具有SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、
14、16、18、20、22、24、26、28、30或32的氨基酸序列的多肽的等位基因變體有至少80%同一性的分離多肽。本領域技術人員應認識到，這類多肽應由能夠與SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、
13、15、17、19、21、23、25、27、29或31的核酸分子在嚴格條件下雜交的核酸分子編碼。
[0024]本文所用術語“蛋白質”和“多肽”旨在可互換的。本發(fā)明的新多肽包括抗血管生成抗體支架和可溶性VEGF受體或TOGF受體多肽，其序列以SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、
14、16、18、20、22、24、26、28、30或32提供。本發(fā)明還包括突變或變異多肽或其功能性片段，所述多肽殘基的任一個可自 SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32所示相應殘基改變而來，同時仍編碼保持其抗血管生成抗體支架和/或可溶性VEGF受體或TOGF受體活性和生理功能的 多肽。在突變或變異蛋白質中，多達20%或以上的殘基可被如此改變。
[0025]總的來說，保持抗血管生成或可溶性VEGFR樣或I3DGFR樣功能的抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體變體包括其中序列中特定位置上的殘基被其它氨基酸取代的任何變體，并且還包括親代蛋白質的兩個殘基之間插入一個或多個額外殘基的可能性以及自親代序列缺失一個或多個殘基的可能性。本發(fā)明包括任何氨基酸取代、插入或缺失。在有利的情況下，取代是保守取代。
[0026]本領域技術人員應認識到，本發(fā)明還涉及分離的抗血管生成抗體支架和可溶性VEGFR或TOGFR多肽及其生物活性部分或其衍生物、片段、類似物或同源物?？刹捎脴藴实鞍踪|純化技術，通過合適的純化方案，從細胞或組織來源中分離本文所述抗血管生成抗體支架和可溶性VEGFR或TOGFR構建體。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗血管生成抗體支架和可溶性VEGFR或TOGFR多肽通過重組DNA技術產生。作為重組表達的備選方法，可采用標準肽合成技術，以化學方法合成抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或PDGFR蛋白或多肽。
[0027]“分離的”或“純化的”多肽或其生物活性部分基本上不含抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽來源于其中的細胞或組織來源的細胞物質或其它污染性蛋白質或多肽，或者基本上不含化學合成時的化學前體或其它化學物質。用語“基本上不含細胞物質”包括抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽的制備物，其中將多肽與其分離或重組產生于其中的細胞的細胞組分分離。例如，用語“基本上不含細胞物質”包括抗血管生成抗體支架或VEGFR或TOGFR多肽的制備物，所述制備物具有小于約30% (以干重計)的非抗血管生成抗體支架或非VEGFR或TOGFR蛋白(本文亦稱為“污染性蛋白質”)，更優(yōu)選小于約20%的非抗血管生成抗體支架或非VEGFR或非I3DGFR蛋白，還更優(yōu)選小于約10%的非抗血管生成抗體支架或非VEGFR或非TOGFR蛋白，最優(yōu)選小于約5%非抗血管生成抗體支架或非VEGFR非TOGFR蛋白。如果抗血管生成抗體支架或VEGFR或TOGFR多肽或其生物活性部分是重組產生的，則還優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基占蛋白質制備物體積的小于約20%，更優(yōu)選小于約10%，最優(yōu)選小于約5%。
[0028]同樣地，用語“基本上不含化學前體或其它化學物質”包括抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽的制備物，其中將多肽與參與多肽合成的化學前體或其它化學物質分離。例如，用語“基本上不含化學前體或其它化學物質”包括抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽的制備物，其具有小于約30% (以干重計)的化學前體或非抗血管生成抗體支架或非VEGFR或非TOGFR化學物質，更優(yōu)選小于約20%化學前體或非抗血管生成抗體支架或非VEGFR或非I3DGFR化學物質，還更優(yōu)選小于約10%化學前體或非抗血管生成抗體支架或非VEGFR或非TOGFR化學物質，最優(yōu)選小于約5%化學前體或非抗血管生成抗體支架或非VEGFR非TOGFR化學物質。
[0029]本發(fā)明的抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽構建體的生物活性部分包括這樣的肽，其包含與抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽的氨基酸序列充分同源或來源于抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽的氨基酸序列的氨基酸序列，例如，與本文所述全長抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR構建體相比包括較少氨基酸并顯示本發(fā)明的抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽的至少一種活性的 SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 或 32 所示的氨基酸序列。通常，生物活性部分包含具有抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽的至少一種活性的結構域或基序。
[0030]為了確定2個氨基酸序列或2個核酸的百分比同源性，將序列進行比對以用于最佳比較目的(例如可將空位引入第一氨基酸或核酸序列的序列中用于與第二氨基酸或核酸序列進行最佳比對)。然后比較相應氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。如果第一序列的位置被與第二序列相應位置的相同氨基酸殘基或核苷酸占據，則該分子在該位置上是同源的(即本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。
[0031]核酸序列同源性可作為2個序列間的同一性程度來確定。同源性可應用本領域已知計算機程序確定，例如GCG程序包所提供的GAP軟件。參見Needleman和Wunsch 1970J Mol Biol 48: 443-453。術語“序列同一性”是指在特定比較區(qū)內在逐個殘基的基礎上2個多核苷酸或多肽序列是相同的程度。術語“序列同一性百分比”如下計算:通過比較在該比較區(qū)內的2個最優(yōu)比對序列，確定在2個序列中出現相同核酸堿基(例如A、T、C、G、U或I，在核酸的情況下)的位置數以得到匹配位置數，將該匹配位置數除以該比較區(qū)的位置總數(即窗口大小)，將結果乘以100，得到序列同一性百分比。本文所用術語“基本同一性”表示多核苷酸序列的特性，其中多核苷酸包含在比較區(qū)內與參比序列相比具有至少80%序列同一性、優(yōu)選至少85%同一性、常常90-95%序列同一性、更通常至少99%序列同一性的序列。
[0032]本發(fā)明還提供抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF或TOGFR受體嵌合或融合蛋白。本發(fā)明的抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或I3DGFR嵌合或融合蛋白可通過標準重組DNA技術產生。例如，按照常規(guī)技術，例如通過利用用于連接的平端或交錯端、提供合適末端的限制性內切酶消化、適當時補平黏端、避免不需要的連接的堿性磷酸酶處理和酶促連接，將編碼不同多肽序列的DNA片段符合讀框地連接起來。在另一個實施方案中，可通過常規(guī)技術包括自動化DNA合成儀合成融合基因?；蛘撸蚱蔚腜CR擴增可使用在兩個連續(xù)的基因片段間產生互補突出端的錨定引物進行，所述基因片段可隨后退火并再擴增以產生嵌合基因序列(參見例如 Ausubel 等(主編)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons, 1992)。此外，許多已編碼某一融合部分(例如GST多肽)的表達載體是市售可獲得的。
[0033]本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的任何核酸分子的載體。具體地講，本發(fā)明還涉及載體、優(yōu)選表達載體，其含有編碼本發(fā)明的抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽或其衍生物、片段、類似物或同源物的核酸。本文所用術語“載體”是指能夠將另一個核酸轉運到其與之連接的核酸分子上。載體的一種類型是“質?！保涫侵钙渲锌蛇B接額外DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。載體的另一種類型是病毒載體，其中額外的DNA區(qū)段可連接至病毒基因組。某些載體能夠在其所導入的宿主細胞中自主復制(例如具有細菌復制起點和附加型哺乳動物載體的細菌載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)在導入宿主細胞時整合到宿主細胞基因組中，從而與宿主基因組一起復制。此外，某些載體能夠指導與之有效連接的基因的表達。這類載體在本文稱為“表達載體”。一般來講，重組DNA技術中應用的表達載體常常呈質粒的形式。在本說明書中，“質?！焙汀拜d體”可互換使用，因為質粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明欲包括提供等同功能的表達載體的這類其它形式，例如病毒載體(例如復制缺陷型反轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒和基于轉座子的重組系統(tǒng))。
[0034]本發(fā)明的重組表達載體包含呈適于在宿主細胞中表達核酸的形式的本發(fā)明的任何核酸，這意味著重組表達載 體包括根據待用于表達的宿主細胞選擇的與待表達的核酸序列有效連接的一個或多個調節(jié)序列。在重組表達載體內，“有效連接”欲指以允許核苷酸序列表達的方式與一個或多個調節(jié)序列連接的目標核苷酸序列(例如在體外轉錄/翻譯系統(tǒng)中或當載體導入宿主細胞時在宿主細胞中)。
[0035]術語“調節(jié)序列”欲包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如多腺苷酸化信號)。這類調節(jié)序列描述于例如 Goeddel ;Gene Expression Technology: Methods inEnzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)。調節(jié)序列包括在許多宿主細胞類型中指導核苷酸序列組成型表達的調節(jié)序列和只在某些宿主細胞中指導核苷酸序列表達的調節(jié)序列(例如組織特異性調節(jié)序列)。本領域技術人員應了解，表達載體的設計可取決于諸如待轉化的宿主細胞的選擇、所需蛋白質的表達水平等因素?？蓪⒈景l(fā)明的表達載體導入宿主細胞，從而產生蛋白質或肽，包括本文所述核酸編碼的融合蛋白或肽(例如抗血管生成抗體支架、可溶性VEGFR或TOGFR多肽、抗血管生成抗體支架的突變體形式、可溶性VEGFR或TOGFR多肽的突變體形式、融合蛋白等)。
[0036]可設計本發(fā)明的重組表達載體用于在原核或真核細胞中表達本發(fā)明的抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR構建體。用于原核和真核細胞兩者中的其它合適表達系統(tǒng)是本領域已知的(參見例如Sambrook等,Molecular Cloning: A Laboratory Manual.第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y.，1989,第 16 和 17 章)。
[0037]另外，本發(fā)明還提供含有這類載體(或本文所述任何核酸分子)的宿主細胞或細胞系。本文所用術語“宿主細胞”和“重組宿主細胞”在本文可互換使用。要了解這類術語不僅僅指特定的主題細胞，而且還指這類細胞的子代或潛在子代。因為某些修飾因突變或環(huán)境影響所致可出現在隨后的子代中，事實上，這類子代可能并不與親代細胞相同，但仍包括在本文所用的該術語的范圍內。
[0038]宿主細胞可以是任何原核或真核細胞。以非限制性實例為例，宿主細胞可以是ARPE-19細胞。然而，其它合適的宿主細胞是本領域技術人員已知的。
[0039]可通過常規(guī)轉化或轉染技術，將載體DNA導入原核或真核細胞中。本文所述術語“轉化”和“轉染”欲指用于將外源核酸(例如DNA)導入宿主細胞的各種公認技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂轉染或電穿孔。轉化或轉染宿主細胞的合適方法可見于 Sambrook 等(Molecular Cloning: A Laboratory Manual.第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y., 1989)和其它實驗室指南。
[0040]對于哺乳動物細胞的穩(wěn)定轉染，要了解，根據所用的表達載體和轉染技術，僅一小部分細胞可將外源DNA整合至其基因組。為了鑒定和選擇這些整合子(integrant)，一般將編碼選擇標記(例如抗生素抗性)的基因與目標基因一起導入宿主細胞中。各種選擇標記包括賦予藥物(例如G418、潮霉素、甲氨蝶呤和/或殺稻瘟素)抗性的選擇標記?？蓪⑽挥谂c編碼抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF或TOGF受體構建體的相同載體上的編碼選擇標記的核酸導入宿主細胞，或者可引入各自的載體中。用導入的核酸穩(wěn)定轉染的細胞可通過藥物選擇來鑒定(例如摻入選擇標記基因`的細胞將存活，而其它細胞則死亡)。
[0041]可使用本發(fā)明的宿主細胞，例如培養(yǎng)中的原核或真核宿主細胞，以產生(即表達)本文所述的任何抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽構建體。因此，本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的宿主細胞產生這些抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽的方法。在一個實施方案中，所述方法包括將本發(fā)明的宿主細胞(已向其中導入編碼抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR的重組表達載體)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得產生抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR多肽。在另一個實施方案中，所述方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細胞中分離抗血管生成抗體支架或可溶性VEGFR或TOGFR。
[0042]同樣地，本發(fā)明還提供經遺傳工程改造以產生治療量的抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體的ARPE-19細胞的細胞系，其中抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或I3DGF受體由選自以下的核酸序列編碼:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3, SEQ IDN0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ IDNO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQID NO: 29和SEQ ID NO: 31。同樣地，本發(fā)明還提供經遺傳工程改造以產生包含選自以下氨基酸序列的抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF或TOGF受體的ARPE-19細胞的細胞系:SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30 和 SEQ ID NO:32。
[0043]優(yōu)選治療量為至少I pg-1000 μ g/天/6mm裝置。本領域技術人員應認識到，治療量可以是落入該范圍(包括性的)的任何量。此外，本發(fā)明的細胞系和裝置能夠表達該治療量持續(xù)至少三周的一段時間。在一些實施方案中，治療量為至少100-10,000 ng/天。在一個非限制性的實施方案中，該量為至少4 yg/天。
[0044]本文還描述了可植入細胞培養(yǎng)裝置，所述裝置含有本發(fā)明的一個或多個細胞系(即經遺傳工程改造以產生治療量的本文所述抗血管生成抗體支架和/或可溶性VEGF受體或TOGFR受體的任一種的ARPE-19細胞)和圍繞核心(core)的半透膜，其中所述膜允許其中的抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體擴散通過。術語“囊(capsule)”和“裝置”在本文可互換使用，是指含有經遺傳工程改造的細胞和細胞系(例如ARPE-19細胞或細胞系)的任何生物人工器官。
[0045]在一些實施方案中，核心另外含有配置在半透膜內的基質。以非限制性實例為例，基質可包括水凝膠或胞外基質組分。例如，水凝膠可含有與多價離子交聯的藻酸鹽。在其它實施方案中，基質包括大量單絲，其中單絲被捻成紗或被織成網或被捻成呈無紡線的紗，且其中細胞或組織分布在上面。本領域技術人員應認識到，絲狀細胞支持性基質可由選自以下的生物相容性材料制造:丙烯酸類、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙腈、聚對苯二甲酸乙二醇酯、尼龍、聚酰胺、聚氨酯、聚丁酯(polybutester)、絲、棉、殼多糖、碳和/或生物相容性金屬。本文所用“內部支架(internal scaffold) ”是一種適用于本發(fā)明任何裝置的“基質”的非限制性實例。
[0046]在一些實施方案中，本文所述細胞包封裝置還具有系鏈錨(tether anchor)。例如，系鏈錨可以是適于將所述囊錨定在眼結構上的錨環(huán)。本文所述的任何裝置適于植入眼部或選自以下的另一個身體靶區(qū):脾、耳、心臟、結腸、肝、腎、乳腺、關節(jié)、骨髓、皮下和腹膜間隙。以非限制性實例為例，可將囊植入玻璃體、水樣液、眼球筋膜下間隙(Subtenon’ sspace)、眼周間隙、眼后房和/或眼前房。
[0047]本文所述裝置的外罩(jacket)優(yōu)選由選擇性滲透的免疫隔離膜(immunoisolatory membrane)制成。例如，外罩由超濾膜或微濾膜制成。本領域技術人員應認識到，超濾膜通常具有1-100 nm的孔徑大小，而微濾膜通常具有0.1-10 μ m的孔徑大小。在其它實施方案中，外罩可由無孔膜材料(例如水凝膠或聚氨酯)制成。術語“外罩”和“半透膜”在本文可互換使用。
[0048]在本文所述任何裝置中，可使囊成形為中空纖維或平片(flat sheet)。此外，在不同的實施方案中，至少一種額外的生物活性分子可從這些裝置中共同遞送。例如,至少一種額外的生物活性分子可來自非細胞或細胞源(即至少一種額外的生物活性分子由核心中的一種或多種經遺傳工程改造的ARPE-19細胞產生)。
[0049]本文還提供用于通過將本發(fā)明的可植入細胞培養(yǎng)裝置植入患者眼部來治療眼科病癥并允許抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體從裝置中擴散和與眼中的VEGF和/或TOGF結合從而治療眼科病癥的方法。例如，待治療的眼科病癥可選自早產兒視網膜病、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病視網膜病、年齡相關性黃斑變性、青光眼、色素性視網膜炎、白內障形成、成視網膜細胞瘤和視網膜缺血。在一個優(yōu)選的實施方案中，年齡相關性黃斑變性是濕性年齡相關性黃斑變性。在另一個優(yōu)選的實施方案中，眼科病癥是糖尿病視網膜病。
[0050]本發(fā)明還提供用于通過將本發(fā)明的可植入細胞培養(yǎng)裝置植入患有細胞增殖病癥的患者中并且允許抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體從裝置中擴散并與VEGF或TOGF結合來抑制內皮細胞增殖的方法，其中所述結合抑制患者的內皮細胞增殖。例如，所述病癥選自血液學病癥、動脈粥樣硬化、炎癥、血管通透性增加和惡性腫瘤。
[0051]還提供通過將本文所述可植入細胞培養(yǎng)裝置植入接受宿主的靶區(qū)來將抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體遞送給接受宿主的方法，其中包封的一種或多種ARPE-19細胞在靶區(qū)分泌抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體。優(yōu)選的靶區(qū)包括中樞神經系統(tǒng)，包括腦、腦室、脊髓或眼的水樣液和玻璃體液。其它靶區(qū)可包括但不限于用于全身遞送的整個身體和/或身體器官內或附近的局部靶區(qū)，例如乳腺、結腸、脾、卵巢、睪丸和/或骨髓。
[0052]本領域技術人員應認識到，在本文所述的有關眼植入和/或眼病癥的任何方法中，介于0.1 Pg和1000 μ g/患者/天的本發(fā)明的抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體可從可植入細胞培養(yǎng)裝置中擴散。然而，對于至身體其它靶區(qū)的全身植入，治療有效量可為1000 mg/患者/天以上。本領域技術人員應認識到，對于這類全身適應癥，將必須采用大得多的ECT裝置。
[0053]對于眼植入,優(yōu)選治療量是介于I pg與1000 μ g/天/6 mm裝置(包括性的)之間的任何量。在一些實施方案中，治療量為至少1000 ng/天(1.0 pcd)。此外，本發(fā)明的細胞系和裝置能夠表達該治療量持續(xù)至少三周的一段時間。
[0054]另外，本發(fā)明還提供用于制備本發(fā)明的可植入細胞培養(yǎng)裝置的方法。在一種方法中，至少一種ARPE-19細胞經遺傳工程改造以分泌由選自以下核酸序列編碼的抗血管生成抗體支架或可溶性 VEGF 受體或 PDGF 受體:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:17,SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29 和 SEQID NO: 31，且遺傳修飾的ARPE-19細胞被包封在半透膜內，其中所述膜允許抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體從中擴散通過。在另一種方法中，至少一種ARPE-19細胞經遺傳工程改造以分泌包含選自以下氨基酸序列的抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或 PDGF 受體:SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID N0:30 和 SEQ ID N0:32，且遺傳修飾的ARPE-19細胞被包封在半透膜內，其中所述膜允許抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或I3DGF受體從中擴散通過。
[0055]本發(fā)明還描述了經遺傳工程改造以產生本發(fā)明的任何多肽(例如SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32)的一種或多種ARPE-19細胞在制備本發(fā)明的任何可植入細胞培養(yǎng)裝置中的用途，所述裝置用于治療血管病癥包括眼的血管病癥，例如通過將裝置植入患者眼中或在其它患病部位用于局部的和靶向的抗血管生成因子遞送。
[0056]此外，可通過將裝置植入患者眼中并且通過允許本發(fā)明的抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體從裝置中擴散并與眼中的VEGF和/或TOGF結合，來使用本文所述的任何可植入細胞培養(yǎng)裝置用于治療眼科病癥。
[0057]還提供經遺傳工程改造以產生本發(fā)明的任何多肽的一種或多種ARPE-19細胞，用于通過將本發(fā)明的任何可植入細胞培養(yǎng)裝置植入患者眼中并且通過允許抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體從裝置中擴散并與眼中的VEGF或TOGF結合來治療眼科病癥。
[0058]還可將本文所述的任何分離的核酸分子用于制備經遺傳工程改造以產生本發(fā)明的多肽之一的一種或多種ARPE-19細胞，用于通過將本發(fā)明的可植入細胞培養(yǎng)裝置植入患者眼中并且通過允許抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體從裝置中擴散并與眼中的VEGF或TOGF結合來治療眼科病癥。此外，本發(fā)明的任何分離的核酸分子也可用于治療眼科病癥，其中治療包括將本發(fā)明的可植入細胞培養(yǎng)裝置植入患者眼中并且允許抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體從裝置中擴散并與眼中的VEGF和/或PDGF結合，其中所述裝置中的所述一種或多種ARPE-19細胞已用所述分離的核酸分子進行遺傳工程改造從而產生本文所述的任何分離的多肽。
[0059]在本文所述的任何實施方案中，血管病癥選自但不限于例如早產兒視網膜病、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病視網膜病、年齡相關性黃斑變性(例如濕性年齡相關性黃斑變性)、青光眼、色素性視網膜炎、白內障形成、成視網膜細胞瘤和視網膜缺血。本領域技術人員應認識到，本文所述任何裝置還可用來治療各種非眼部的血管病癥。
[0060]本發(fā)明還提供經遺傳工程改造以產生本發(fā)明的多肽(例如抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子)的一種或多種ARPE-19細胞在制備本發(fā)明的可植入細胞培養(yǎng)裝置中的用途，用于通過將裝置植入患有細胞增殖病癥的患者的眼中并且通過允許抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體從裝置中擴散并與眼中的VEGF和/或TOGF結合從而抑制所述患者的內皮細胞增殖，來抑制內皮細胞增殖。同樣地，本發(fā)明還提供本發(fā)明的可植入細胞培養(yǎng)裝置，用于通過將裝置植入患有細胞增殖病癥的患者的眼中并且通過允許抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體從裝置中擴散并與眼中的VEGF和/或PDGF結合從而抑制所述患者的內皮細胞增殖，來抑制內皮細胞增殖。
[0061]在其它實施方案中，本發(fā)明提供經遺傳工程改造以產生本發(fā)明的任何多肽的一種或多種ARPE-19細胞，用于通過將本文所述的任何可植入細胞培養(yǎng)裝置植入患有細胞增殖病癥的患者的眼中并且通過允許抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體從裝置中擴散并與眼中的VEGF或TOGF結合從而抑制所述患者的內皮細胞增殖，來抑制內皮細胞增殖。
[0062]還考慮了本文所述的任何分離的核酸分子在制備經遺傳工程改造以產生本發(fā)明的一種或多種多肽的一種或多種ARPE-19細胞中的用途，用于通過將本發(fā)明的可植入細胞培養(yǎng)裝置植入患有細胞增殖病癥的患者的眼中并且通過允許抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體從裝置中擴散并與眼中的VEGF或TOGF結合從而抑制所述患者的內皮細胞增殖，來抑制內皮細胞增殖。
[0063]此外，本發(fā)明還提供用于抑制內皮細胞增殖的本發(fā)明的任何分離的核酸分子，治療包括將本發(fā)明的可植入細胞培養(yǎng)裝置植入患有細胞增殖病癥的患者的眼中并且允許抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體從裝置中擴散并與眼中的VEGF和/或roGF結合從而抑制所述患者的內皮細胞增殖，且其中所述裝置中的所述一種或多種ARPE-19細胞已用所述分離的核酸分子進行遺傳工程改造從而產生本發(fā)明的多肽。
[0064]本領域技術人員應認識到，細胞增殖病癥可選自血液學病癥、動脈粥樣硬化、炎癥、血管通透性增加和惡性腫瘤，并可局限于身體的各個部分，包括但不限于眼。因此，可將ECT裝置置于這些局部區(qū)域附近以治療所提及的病癥。
[0065]本文還提供經遺傳工程改造以產生本文所述任何多肽的一種或多種ARPE-19細胞在制備本發(fā)明的可植入細胞培養(yǎng)裝置中的用途，用于通過將裝置植入接受宿主的靶區(qū)且其中包封的一種或多種ARPE-19細胞在靶區(qū)分泌抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或F1DGF受體,而將抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或F1DGF受體遞送給接受宿主。同樣地，本發(fā)明的任何可植入細胞培養(yǎng)裝置可用于通過將裝置植入接受宿主的靶區(qū)，且其中包封的一種或多種ARPE-19細胞在靶區(qū)分泌抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或PDGF受體，而將抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體遞送給接受宿主。
[0066]此外，經遺傳工程改造以產生本文所述任何多肽的一種或多種ARPE-19細胞可用于通過將任何本發(fā)明的可植入細胞培養(yǎng)裝置植入接受宿主的靶區(qū)，且其中包封的一種或多種ARPE-19細胞在靶區(qū)分泌抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體，而將抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或F1DGF受體遞送給接受宿主。
[0067]同樣地，本文所述的任何分離的核酸分子可用于經遺傳工程改造以產生本文所述任何多肽的一種或多種ARPE-19細胞的制備，用于通過將本發(fā)明的可植入細胞培養(yǎng)裝置植入接受宿主的靶區(qū)，且其中包封的一種或多種ARPE-19細胞在靶區(qū)分泌抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體，而將抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體遞送給接受宿主。
`[0068]本文所述的任何分離的核酸分子還可用于將抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或roGF受體遞送給接受宿主，所述遞送包括將本發(fā)明的可植入細胞培養(yǎng)裝置植入接受宿主的靶區(qū)，其中包封的一種或多種ARPE-19細胞在靶區(qū)分泌抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體，且其中所述裝置中的所述一種或多種ARPE-19細胞已用所述分離的核酸分子進行遺傳工程改造從而產生本發(fā)明的任何多肽。
[0069]本領域技術人員應認識到，靶區(qū)選自中樞神經系統(tǒng)，包括腦、腦室、脊髓及眼的水樣液和玻璃體液。其它靶區(qū)可位于身體的其它部位，并把ECT裝置置于那些部位附近。各部位可包括但不限于脾、耳、心臟、結腸、肝、腎、乳腺、關節(jié)、骨髓、皮下和腹膜間隙。
[0070]另外，本發(fā)明還提供產生分離多肽的方法，所述方法包括表達本文所述的任何分離的核酸分子并收獲所表達的多肽。
[0071]本發(fā)明還提供包含經遺傳工程改造以產生治療有效量的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子(例如至少10，000 ng/天/IO6個細胞)的ARPE-19細胞的細胞系。優(yōu)選細胞系產生治療有效量持續(xù)至少3個月的一段時間(即3、6、9、12、15、18、21、24個月或更多個月)。
[0072]在一些非限制性的實施方案中，可采用重復轉染方法，將一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子導入ARPE-19細胞。具體地講，重復轉染可以是I次轉染、2次轉染、3次轉染或更多次轉染(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次轉染)。如果重復轉染方法為I次轉染，則細胞系將含有一種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。如果重復轉染方法為2次轉染，則細胞系將含有2種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。這些可以是相同或不同的抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。如果重復轉染方法為3次轉染，將細胞系將含有3種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。這些可以是相同或不同的抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。本領域技術人員應認識到，重復轉染方法中的轉染數將決定所得細胞系中的(相同或不同)抗血管生成抗體支架和/或抗血管生成分子的數目。
[0073]在一些實施方案中，如果重復轉染為I次轉染，則細胞系產生介于10,000與30，000 ng/天/IO6個細胞之間的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。優(yōu)選細胞系產生大約或至少15,000 ng/天/IO6個細胞的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。在其它實施方案中，如果重復轉染為2次轉染，則細胞系產生介于30，000與50，000 ng/天/IO6個細胞之間的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。優(yōu)選細胞系產生大約或至少35，000 ng/天/IO6個細胞的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。在另外其它的實施方案中，如果重復轉染為3次轉染，則細胞系產生介于50，000與75，000 ng/天/IO6個細胞之間的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。優(yōu)選細胞系產生大約或至少70，000 ng/天/IO6個細胞的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。
[0074]抗血管生成分子可以是例如可溶性VEGF受體和/或可溶性TOGF受體。
[0075]可采用重復轉染方法將相同的抗血管生成抗體支架和/或抗血管生成分子的多個拷貝導入ARPE-19細胞?；蛘撸€可采用重復轉染方法將不同的抗血管生成抗體支架和/或抗血管生成分子的多個拷貝導入ARPE-19細胞。
[0076]在一個實施方案 中，ARPE-19細胞是使用包含由SEQ ID N0.1的核酸序列編碼的可溶性VEGF受體或含有SEQ ID N0.2的氨基酸序列的可溶性VEGF受體的載體經過遺傳工程改造的。
[0077]本發(fā)明還提供包含經遺傳工程改造以產生治療有效量的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子的ARPE-19細胞的任何細胞系，其中治療有效量為至少10，000ng/ 天 /IO6 個細胞(例如至少 15，000,20, 000,25, 000,30, 000,35, 000,40, 000,45, 000、50，000,55, 000,60, 000,65, 000,70, 000,75, 000 或更多 ng/ 天 /IO6 個細胞。這類細胞系能夠產生這種治療有效量持續(xù)至少3個月(例如至少6、9、12、15、18、21或24個月)或更長。本領域技術人員應認識到，在一些實施方案中，這類細胞系可采用本文所述重復轉染方法產生。然而，還可采用本領域已知的其它方法以獲得治療有效量的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子的產生。
[0078]本文所述的任何細胞系可經遺傳工程改造以分泌由選自以下核酸序列編碼的抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或I3DGF受體:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3, SEQ IDN0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ IDNO: 17,SEQ ID NO: 19,SEQ ID N0:2USEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ IDN0:29和SEQ ID NO:31。同樣地，本文所述的任何細胞系可經遺傳工程改造以分泌包含選自以下氨基酸序列的抗血管生成抗體支架或可溶性VEGF受體或TOGF受體:SEQ ID NO:2,SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30 和 SEQ ID NO:32。
[0079]本文還描述了含有核心的可植入細胞培養(yǎng)裝置，所述核心含有本發(fā)明的一個或多個細胞系(即采用重復轉染方法經遺傳工程改造產生治療有效量的本文所述的任何抗血管生成抗體支架和/或抗血管生成分子的ARPE-19細胞或經遺傳工程改造以分泌至少10,000 ng/天/IO6個細胞的ARPE-19細胞)和包繞核心的半透膜，其中所述膜允許一種或多種抗血管生成抗體支架和/或抗血管生成分子從中擴散通過。
[0080]在一些實施方案中，核心含有0.5-1.0 X IO6個細胞。
[0081]核心還可含有配置在半透膜內的基質。在其它實施方案中，基質包括大量單絲，其中單絲被捻成紗或被織成網或被捻成呈無紡線的紗，且其中細胞或組織分布在上面。本領域技術人員應認識到，單絲可由選自以下的生物相容性材料制成:丙烯酸類、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙腈、聚對苯二甲酸乙二醇酯、尼龍、聚酰胺、聚氨酯、聚丁酯、絲、棉、殼多糖、碳和/或生物相容性金屬。例如，單絲為包含介于裝置內體積的40-85%的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)纖維。
[0082]本文所述細胞包封裝置還可具有系鏈錨。例如，系鏈錨可以是適于將裝置錨定在眼結構上的錨環(huán)。[0083]可將本文所述的任何裝置植入(或用于植入)眼或身體的另一個靶區(qū)，例如脾、耳、心臟、結腸、肝、腎、乳腺、關節(jié)、骨髓、皮下和/或腹膜間隙。以非限制性實例為例，可將裝置植入(或用于植入)玻璃體、水樣液、眼球筋膜下間隙、眼周間隙、眼后房和/或眼前房。
[0084]本文所述裝置的半透膜優(yōu)選由選擇性滲透的免疫保護膜(immunoprotectivemembrane)制成。在其它實施方案中，半透膜由超濾膜或微濾膜制成。本領域技術人員應認識到，半透膜通常具有約100 nm的中值孔徑大小。
[0085]在另外其它的實施方案中，半透膜由無孔膜材料(例如水凝膠或聚氨酯)制成。在本文所述的任何裝置中，半透膜的標稱分子量截止值(MWCO)為500 kD。優(yōu)選半透膜厚度為約90-120 um之間。本文所述的任何裝置可配置成中空纖維或平片。裝置的長度可為約4mm-11 mm之間。在一些實施方案中，裝置具有介于約0.9 mm-1.2 mm之間的內徑。在一個優(yōu)選的實施方案中，裝置的末端使用甲基丙烯酸甲酯密封。
[0086]本發(fā)明的任何裝置可包括以下額外特性的1、2、3、4、5、6、7個或全部:
a.核心含有介于0.5-1.0 X IO6個之間的ARPE-19細胞；
b.裝置的長度為4mm-11 mm之間；
c.裝置的內徑為0.9-1.2 mm之間；
d.裝置的末端使用甲基丙烯酸甲酯密封；
e.半透膜具有約100nm的中值孔徑大??；
f.半透膜的標稱分子量截止值(MWCO)為500kD ；
g.半透膜的厚度為90-120μπι之間；
h.核心含有內部支架，其中支架包含占裝置內體積40-85%的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)纖維；和
1.其任何組合。
[0087]此外，在不同的實施方案中，至少一種額外的生物活性分子可從這些裝置中共同遞送。例如，至少一種額外的生物活性分子可來自非細胞或細胞源(即至少一種額外的生物活性分子由核心中的一種或多種經遺傳工程改造的ARPE-19細胞產生)。
[0088]本發(fā)明還提供本發(fā)明的任何可植入細胞培養(yǎng)裝置將合適治療劑量的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子遞送至受試者眼中的用途，其中治療劑量為至少 100 ng/天 / 眼(例如至少 100、200、300、400、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000ng/天/眼或更多)。同樣地，本發(fā)明還提供一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子，用于通過將合適治療劑量的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子遞送到受試者眼中來治療需要治療的受試者，其中治療劑量為至少100 ng/天/眼(例如至少 100、200、300、400、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000 ng/天 / 眼或更多)。
[0089]本文還提供用于治療眼科病癥的方法，所述方法通過將本發(fā)明的任何可植入細胞培養(yǎng)裝置植入患者眼中并且允許抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子從裝置中擴散并與眼中的VEGF和/或TOGF結合，從而治療眼科病癥。在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于治療眼科病癥的細胞系(即本文所述的任何細胞系)，其中將細胞系摻入可植入細胞培養(yǎng)裝置中、其中將裝置植入患者眼中，且其中抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子從裝置中擴散并與眼中的VEGF和/或TOGF結合，從而治療眼科病癥。
[0090]例如，待治療的眼科病癥可選自早產兒視網膜病、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病視網膜病、年齡相關性黃斑變性、青光眼、色素性視網膜炎、白內障形成、成視網膜細胞瘤和視網膜缺血。在一個優(yōu)選的實施方案中，年齡相關性黃斑變性是濕性年齡相關性黃斑變性。在一個優(yōu)選的實施方案中，眼科病癥是糖尿病視網膜病。
[0091]本發(fā)明還提供用于抑制內皮細胞增殖或血管形成的方法，所述方法通過將本發(fā)明的可植入細胞培養(yǎng)裝置植入患有細胞增殖病癥的患者中，并且允許抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子從裝置中擴散并與VEGF和/或TOGF結合，其中所述結合抑制患者的內皮細胞增殖或血管形成。例如，所述病癥可選自血液學病癥、動脈粥樣硬化、炎癥、血管通透性增加和惡性腫瘤。在這類方法中，每天每患者的治療有效量的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子從裝置中擴散。`
[0092]還提供將抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子遞送給接受宿主的方法，所述方法如下進行:通過將本文所述的任何可植入細胞培養(yǎng)裝置植入接受宿主的靶區(qū)，其中包封的一種或多種ARPE-19細胞在靶區(qū)分泌抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。優(yōu)選的靶區(qū)可包括但不限于中樞神經系統(tǒng)，包括腦、腦室、脊髓、眼的水樣液和玻璃體液、脾、耳、心臟、結腸、肝、腎、乳腺、關節(jié)、骨髓、皮下和/或腹膜間隙。其它靶區(qū)可包括但不限于用于全身遞送的整個身體和/或身體器官內或附近的局部靶位點，例如乳腺、結腸、脾、卵巢、睪丸和/或骨髓。在這類方法中，每天每患者的治療有效量的抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子擴散至靶區(qū)。
[0093]本領域技術人員應認識到，在本文所述的有關眼植入和/或眼病癥的任何方法中，每天每患者的治療有效量的本發(fā)明的抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子從可植入細胞培養(yǎng)裝置中擴散。例如，介于0.1 Pg與1000 μ g/患者/天之間的本發(fā)明的抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子可從可植入細胞培養(yǎng)裝置中擴散(例如進入一個或多個靶區(qū))。
[0094]本發(fā)明還提供用于制備本發(fā)明的可植入細胞培養(yǎng)裝置的方法。例如，通過遺傳工程改造至少一種ARPE-19細胞以分泌一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子(例如由選自以下核酸序列編碼的那些:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ IDNO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29 和 SEQID NO: 31)，并將遺傳修飾的ARPE-19細胞包封在半透膜內，其中所述膜允許抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子從中擴散通過。在一個優(yōu)選的實例中，本發(fā)明的抗血管生成分子是可溶性VEGF受體和/或可溶性I3DGF受體。
[0095]除非另有限定，否則本文所用的所有技術和科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解的相同含義。雖然與本文所述方法與材料類似或等同的方法與材料可用于實施或測試本發(fā)明，但下面描述了合適的方法與材料。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻均通過引用以其整體予以結合。在有沖突的情況下，將以本申請(包括定義)為準。另外，材料、方法和實施例只是說明性的，并非旨在限制性的。
[0096]根據下列詳述和權利要求書，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將是顯然的。
[0097]附圖簡述
圖1是顯示pCpGfree-vitro表達載體(InvivoGen)圖譜的示意圖。
[0098]圖2顯示用表達分子p834的細胞進行的細胞系篩選和命中測定(hitdetermination)的實例。
[0099]圖3顯示分子p834和p873的蛋白質印跡結果和分子p834的SDS-PAGE結果。
[0100]圖4顯示p834和p8 38的HUVEC生物測定。
[0101]圖5顯示p834的溶液結合測定。
[0102]圖6顯示表達p834的細胞系的穩(wěn)定性。
[0103]圖7顯示保存在容器中4周后p834 ECT裝置的組織切片。
[0104]圖8顯示植入新西蘭白兔眼中3個月后移出的p834 ECT裝置的組織學。
[0105]圖9顯示質量與效能圖中產生834蛋白的細胞系的P⑶。對第一、第二和第三轉染/重復細胞系作圖。
[0106]圖10顯示通過用p963和p964轉染的細胞產生的TOGFR β Fe融合蛋白的檢測ELISA。
[0107]圖11顯示產生roGFR-Dl-D5_hIgGl Fe的克隆細胞系的實例。
[0108]圖12顯示分泌抗血管生成分子包括單克隆抗體、Fab片段、單鏈抗體和受體Fe的代表性細胞系。
[0109]圖13顯示體外ECT方式中代表性Mab、ScFv、Fab和受體Fe細胞系的裝置蛋白質產量。
[0110]圖14是顯示p834、p873和P917的相對結構的示意圖。
[0111]圖15是p834、p873和p917的序列比對。
[0112]圖16是p834和阿柏西普的序列比對。
[0113]圖17是顯示自組合荷載裝置分泌的I3DGFR-Fc和VEGFR-Fc的抗TOGFR加上抗Fe檢測的蛋白質印跡。
[0114]發(fā)明詳述
蛋白質是用于治療眼疾病的治療劑的主要類別。然而，基于大的抗體的蛋白質藥物不能夠旁路通過(bypass)血-視網膜屏障，因此，需要重復眼內給藥進行治療。之前已表明在人的臨床試驗中，包封細胞技術(encapsulated cell technology,ECT)眼內裝置可在2年的進程中將生物治療劑持續(xù)遞送到眼，從而表明該項技術也可擴展到其它眼用生物制劑中，例如與濕性AMD有關的眼用生物制劑。
[0115]合成了代表抗體支架生物制劑的主要類別的cDNA序列，包括例如完全抗體、抗體Fab片段、單鏈(ScFv)抗體和融合受體-Fe分子。使用cDNA表達載體以產生分泌基于所需抗體的生物制劑的穩(wěn)定的人細胞系。隨后將細胞系包封，以產生眼用ECT植入物。通過ELISA測定蛋白質分泌的速率。
[0116]培養(yǎng)的克隆細胞系分泌抗體支架蛋白質的全部類別，許多與基于CHO-細胞系的制造系統(tǒng)等同?？寺〖毎碉@示穩(wěn)固的重組蛋白分泌，一些細胞系的水平接近200-20，000ng/100萬個細胞/天(20 pcd)。在一些實施方案中，可采用1、2、3次或更多次轉染的重復轉染方法對細胞進行遺傳工程改造。出乎意料的是，重復DNA轉染和選擇顯著增加細胞系產生重組蛋白的能力，所述重組蛋白分泌50，000 ng/100萬個細胞/天至大于70，000 ng/100萬個細胞/天(70 pcd)?？刹捎弥貜娃D染方法將相同或不同的抗血管生成抗體支架和/或抗血管生成分子的多個拷貝導入細胞(例如ARPE-19細胞)。用包括I次轉染的重復轉染方法產生的分子可稱為“第一代”分子。用包括2次轉染的重復轉染方法產生的分子可稱為“第二代”分子。用包括3次轉染的重復轉染方法產生的分子可稱為“第三代”分子。
[0117]已成功地將產生基于活性抗體支架的生物制劑和受體融合蛋白的細胞系包封，且最初以高達50-1000 ng/天的水平檢出來自單個ECT裝置的重組蛋白的初期產量。隨后重復DNA轉染的細胞系聯合培養(yǎng)基優(yōu)化，提高眼用ECT裝置水平直到4，000-10，000 ng/天。
[0118]因此，這些ECT裝置可為用于大的生物分子的有效藥物遞送平臺，所述生物分子包括用于眼部適應癥以及局部和/或全身適應癥的抗體、抗體支架和/或受體融合蛋白。
[0119]血管內皮生長因子(VEGF)是參與血管發(fā)生(胚胎循環(huán)系統(tǒng)形成)和血管生成(自預先存在的血管系統(tǒng)的血管生長)兩者的信號轉導蛋白。雖然VEGF主要以其對血管內皮的作用而著稱，但它還影響各種各樣的其它細胞類型，例如刺激單核細胞/巨噬細胞遷移、神經元、癌細胞、腎上皮細胞等。
[0120]在VEGF家族內有許多蛋白質，這是由于mRNA可變剪接的結果而引起。各種剪接變體影響VEGF的功能，因為它們決定所得蛋白質是促血管生成還是抗血管生成。另外，剪接變體還影響VEGF與細胞表面上的硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)和neuripilin共同受體的相互作用，這進而提高VEGF結合并激活VEGF信號轉導受體(VEGFR)的能力。
[0121]VEGF剪接變體作為糖基化二硫鍵結合的二聚體從細胞中釋放。在結構上，VEGF屬于半胱氨酸結(cysteine-knot)生長因子的F1DGF家族，因此,存在幾種密切相關的蛋白質，即胎盤生長因子(P1GF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D，它們一起構成生長因子的VEGF亞家族。VEGF本身常被稱為VEGF-A，從而與這些其它的相關生長因子區(qū)分開來。
[0122]蛋白質的VEGF家族通過與存在于細胞表面上的VEGFR或酪氨酸激酶受體結合而刺激細胞反應。VEGF受體具有由7個免疫球蛋白樣結構域組成的胞外部分、單個跨膜跨越區(qū)和一個含有割裂酪氨酸-激酶結構域的胞內部分。VEGF-A與VEGFR-1 (Flt-1)和VEGFR-2(KDR/Flk-Ι)兩者結合。VEGFRl作為全長受體酪氨酸激酶(RTK)表達并呈可溶形式，其只攜帶胞外域。VEGFR-2似乎介導與 VEGF的幾乎所有已知的細胞反應，并在注定分化為成血成血管細胞和成血管細胞的中胚層祖細胞中表達。VEGFR-1的功能不太十分確定，但是被認為調節(jié)VEGFR-2信號轉導。VEGF-C和VEGF-D，而非VEGF-A，也是介導淋巴管生成的第3受體(VEGFR-3)的配體。
[0123]血小板衍生生長因子(TOGF)是在血管生成中起作用的生長因子。存在多種形式的roGF，所構成的二聚體含有兩個A鏈(AA)、兩個B鏈(BB)或混合的A/B鏈(AB)。PDGF是周細胞的有效促分裂原，周細胞是用作內皮細胞生長的支持物的一類細胞。I3DGF受體(PDGFR)以兩種形式(α和β)存在。TOGFR β對I3DGF-BB具有最高親和力，并且已表明呈融合蛋白-Fe形式或作為胞外可溶性受體的分泌蛋白質而發(fā)揮抗血管生成生物作用。最近，已證實在小鼠眼部血管新生模型(包括抗VEGF分子和拮抗性TOGF分子的組合)中有效的協同性抗血管生成活性。因此抗TOGF、抗VEGF療法的組合可比單獨的抗VEGF療法發(fā)揮更高的抗血管生成活性。
[0124]可采用本領域已知的標準技術，將目標基因(即編碼給定的抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子的基因，例如本發(fā)明的VEGF受體或TOGF受體構建體)插入合適表達載體的克隆位點。編碼VEGF受體分子的人(和其它哺乳動物)基因的核酸和氨基酸序列是已知的。參見例如美國專利號 4，997，929,5, 141，856,5, 364，769,5, 453，36UW0 93/06116、WO 95/30686，通過引用結合到本文中。
[0125]本發(fā)明考慮了各種特定的截短VEGF受體和/或TOGF受體構建體。還考慮了破壞VEGF與其受體或TOGF與其受體結合的抗血管生成抗體支架(即抗體和抗原結合片段及其衍生物、單鏈抗體等)。例如，本文所`述的可溶性VEGFR受體蛋白包含分泌性VEGF受體I (sVRl)、分泌性VEGF受體2 (sVR2)的片段和/或分泌性VEGF受體2和VEGF受體I的VEGF結合結構域的嵌合體。這些分泌性蛋白質結合VEGF，并且含有多個Ig樣結構域。來自VRl和VR2兩者的幾個免疫球蛋白樣結構域用于本文公開的可溶性VEGF受體構建體。本領域技術人員應認識到，結構域2 (D2)是sVRl的VEGF-結合結構域(“VBD” )，但它需要結構域3 (D3)用于VEGF的高親和力結合。sVRl的截短物(含有結構域1_3 (D1-3)或結構域2-3 (D-3))以比僅結構域2高的親和力結合VEGF。此外，這些截短物還中和VEGF的血管生成作用。VR2對于高親和力VEGF結合具有類似的要求，但是另外必須是二聚體的，因為單體形式以極低親和力結合。本文所述的各種受體構建體包括VR2的結構域1、2和3以及VRl的結構域2和VR2的結構域3的嵌合體。形式可以是單體形式或二聚體形式。本文所述的可溶性VEGF受體構建體的二聚化組分是全長Fe區(qū)。
[0126]在另一個實例中，已表明TOGFR β胞外域1-5結合H)GF。TOGFR β胞外域1_3的截短物也結合roGF。因此這些可溶性天然胞外域的組合或作為融合蛋白將允許roGF的可溶性拮抗劑的產生。I3DGFR β拮抗劑的使用可補充VEGF拮抗劑的抗血管生成作用，如多個眼部新血管形成模型所示(Jo等，2006)。
[0127]本發(fā)明還提供來源于(和/或生物類似于)已知的抗VEGF化合物及其生物反應性片段的抗血管生成抗體支架和受體融合蛋白。例如，已知的抗VEGF化合物包括但不限于抗VEGF受體片段(即阿柏西普)和/或抗VEGF抗體(或其抗原結合片段)(即貝伐單抗，DrugBank DB00112 ;或雷珠單抗DrugBank DB01270))。這些已知的抗VEGF化合物的序列是本領域已知的。在其它實例中，文獻中還描述了生物活性拮抗性I3DGF受體片段(Heidaran等，1990 ；Heidaran 等，1995 ；Nakamura 等 2001)。[0128]本發(fā)明具體的抗血管生成抗體支架和VEGF受體構建體包括:
1)p834 (VEGFR-Fc#l, [RS-VEGF 受體 1、結構域 2 和 VEGF 受體 2、結構域 3(R1D2-R2D3)]-EFEPKSC-hlgGl Fe)
2)p838 (VEGFR-Fc#2, [VEGF 受體 2、結構域 1、2 和 3 (R2D1-R2D2-R2D3)])
3)p876 (VEGF 抗體 ScFv#l，有 His 標簽)
4)p913 (VEGF 抗體 ScFv#2，沒有 His 標簽)
5)p873 (阿柏西普、VEGFR-Fc#3、VEGF受體1、結構域2和VEGF受體2、結構域3(R1D2-R2D3) hlgGl Fe)
6)p874/p875 (貝伐單抗、VEGF完全抗體#1，重鏈/輕鏈)
7)p915/p914 (雷珠單抗、VEGF抗體Fab，重鏈片段/輕鏈)
8)p916/p914 (雷珠單抗、VEGF完全抗體#2，重鏈/輕鏈)
9)p917 (VEGFR-Fc#l、[RS-VEGF 受體 1、結構域 2 和 VEGF 受體 2、結構域 3(RlD2-R2D3)]-hIgGl Fe)
本文首次描述的VEGF構建體優(yōu)于WO 09/149205中描述的那些VEGF受體構建體。具體地講，缺乏Fe尾的VEGF受體構建體(參見例如WO 09/149205的SEQ ID NO: 12)在動物模型中是高度炎癥性的，或者不能制備成穩(wěn)定的細胞系。W009/149205申請中的每個構建體包括IgG鉸鏈區(qū)但不包括Fe尾。 結果，這些構建體全部是F(ab)-2樣分子。本領域技術人員應認識到，已報道了 F(ab)’2蛋白顯示免疫原性(參見Fumia等,Molecular Immunology45:2951-61 (2008) ;Lutz 等，Autoinflammatory Reviews 7:508-13 (2008),每份文獻均通過引用以其整體結合到本文中)。
[0129]本發(fā)明的一個出人意料的發(fā)現是含有IgG鉸鏈區(qū)加上Fe尾的VEGF受體構建體，例如構建體P834 (SEQ ID NO:1)，在兔中產生遠遠少得多的免疫應答，而在臨床情況下完全不產生。
[0130]本文所述的3個構建體p834 (VEGF-Fc)、p873 (阿柏西普)和p917 (阿柏西普RS)具有略不同的氨基酸序列。例如，p834與p873之間的差異包括下列差異:
a.834在信號肽與成熟蛋白質之間含有RS氨基酸
b.834在鉸鏈處含有EFEPKSC
c.834含有末端K (天然)
d.873 含有 5’ attBl 和 3’ attB2 重組位點(recomb site)(未翻譯)
另外，產生了基于P873但除去attBl和attB2并且在信號肽與成熟蛋白質之間加回RS氨基酸的一種新的阿柏西普RS分子(p917)。圖14中圖解性地說明了這些序列差異，圖15中顯示了序列比對。P834和阿柏西普的序列比對見圖16。
[0131]令人吃驚的是，p834預料不到地勝過(即產生更多的抗血管生成抗體支架)p873和p917構建體兩者。
[0132]因此，p834在結構上既不同于本領域已知的其它構建體(即p873)和根據這些已知構建體產生的構建體(即P917)，并且又顯示相對于所述構建體的令人吃驚和預料不到的優(yōu)勢。
[0133]根據834、873和917產生了細胞系，并且測量了抗血管生成抗體支架產量。結果概括如下。
【權利要求】
1.一種細胞系，其包含經遺傳工程改造以產生治療有效量的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子的ARPE-19細胞，其中通過重復轉染方法將一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子導入ARPE-19細胞中，其中所述重復轉染包含1次轉染、2次轉染或3次轉染。
2.權利要求1的細胞系，其中當重復轉染為1次轉染時，所述細胞系產生介于10，OOO與30，000 ng/天/IO6個細胞之間的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。
3.權利要求2的細胞系，其中所述細胞系產生約15，000ng/天/1O6個細胞的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。
4.權利要求1的細胞系，其中當重復轉染為2次轉染時，所述細胞系產生介于30，000與50，000 ng/天/IO6個細胞之間的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。
5.權利要求4的細胞系，其中所述細胞系產生約35，000ng/天/1O6個細胞的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。
6.權利要求1的細胞系，其中當重復轉染為3次轉染時，所述細胞系產生介于50，000和75，000 ng/天/IO6個細胞的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。
7.權利要求6的細胞系，其中所述細胞系產生約70，000ng/天/1O6個細胞的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。
8.權利要求1的細胞系，其中使用包含由SEQID N0.1的核酸序列編碼的可溶性VEGF受體的載體對所述ARPE-19細胞進行遺傳工程改造。
9.權利要求1的細胞系，其中使用包含可溶性VEGF受體的載體對所述ARPE-19細胞進行遺傳工程改造，所述可溶性VEGF受體包含SEQ ID N0.2的氨基酸序列。
10.一種細胞系，其包含經遺傳工程改造以產生治療有效量的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子的ARPE-19細胞，其中治療有效量為至少10，000 ng/天/1O6個細胞。
11.一種可植入細胞培養(yǎng)裝置，所述裝置包含: a.核心，其包含權利要求1的細胞系或權利要求10的細胞系；和 b.包繞細胞系或細胞的半透膜，其中所述膜允許其中一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子擴散通過。
12.權利要求11的裝置，其中所述核心含有介于0.5-1.0*106個之間的ARPE-19細胞。
13.權利要求11的裝置，其中所述核心還包含布置在半透膜內的基質。
14.權利要求13的裝置，其中所述基質包含大量單絲，其中所述單絲 a.被捻成紗線或被織成網，或 b.被捻成呈無紡線的紗線， 且其中細胞分布在其中。
15.權利要求14的裝置，其中所述單絲包含選自以下的生物相容性材料:丙烯酸類、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙腈、聚對苯二甲酸乙二醇酯、尼龍、聚酰胺、聚氨酯、聚丁酯、絲、棉、殼多糖、碳和生物相容性金屬。
16.權利要求15的裝置，其中所述單絲包含聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)纖維，所述纖維占裝置內體積的40-85%之間。
17.權利要求11的裝置，其中所述裝置還包含系鏈錨。
18.權利要求17的裝置，其中所述系鏈錨包含錨環(huán)。
19.權利要求18的裝置，其中所述錨環(huán)適于將裝置錨定在眼結構上。
20.權利要求11的裝置，其中將所述裝置植入眼或選自以下的另一靶區(qū):脾、耳、心臟、結腸、肝、腎、乳腺、關節(jié)、骨髓、皮下和腹膜間隙。
21.權利要求20的裝置，其中將所述裝置植入玻璃體、水樣液、眼球筋膜下間隙、眼周間隙、眼的后房或前房。
22.權利要求11的裝置，其中所述半透膜包含選擇性滲透的免疫保護膜。
23.權利要求11的裝置，其中所述半透膜包含超濾膜或微濾膜。
24.權利要求22或23的裝置，其中所述半透膜具有100nm的中值孔徑大小。
25.權利要求11的裝置，其中所述半透膜包含無孔膜材料。
26.權利要求25的裝置，其中所述無孔膜材料是水凝膠或聚氨酯。
27.權利要求11的裝置，其中所述半透膜的標稱分子量截止值(MWCO)為500kD。
28.權利要求11的裝置，其中所述半透膜的厚度為90-120ym之間。
29.權利要求11的裝置，其中將所述囊配置為中空纖維或平片。
30.權利要求11的裝置，其中所述裝置的長度為4mm-11 mm之間。
31.權利要求11的裝置，其中所述裝置具有介于0.9 mm-1.2 mm之間的內徑。
32.權利要求11的裝置，其中所述裝置的末端使用甲基丙烯酸甲酯密封。
33.權利要求11的裝置，其中至少一種額外的生物活性分子從裝置中共同遞送。
34.權利要求11的裝置，其中所述至少一種額外的生物活性分子來自非細胞源。
35.權利要求11的裝置，其中所述至少一種額外的生物活性分子來自細胞源。
36.權利要求35的裝置，其中所述至少一種額外的生物活性分子由核心中的一種或多種經遺傳工程改造的ARPE-19細胞產生。
37.權利要求11的裝置，其還包含一個或多個額外的選自以下的特性: a.核心包含介于0.5-1.0 X IO6個之間的ARPE-19細胞； b.裝置的長度為4mm-11 mm之間； c.裝置的內徑介于0.9 mm-1.2 mm之間； d.裝置的末端使用甲基丙烯酸甲酯密封； e.半透膜具有約100nm的中值孔徑大?。? f.半透膜的標稱分子量截止值(MWCO)為500KD ； g.半透膜的厚度介于90-120μ m之間； h.核心包含內部支架，其中所述支架包含聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)纖維，所述纖維占裝置內體積的40-85% ;和 1.其組合。
38.權利要求37的裝置，其中所述裝置包含所述額外特性的2、3、4、5、6、7個或全部。
39.權利要求11的裝置將合適治療劑量的一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子遞送至受試者眼的用途，其中所述治療劑量為至少100 ng/天/眼。
40.一種用于治療眼科病癥的方法，所述方法包括將權利要求11的可植入細胞培養(yǎng)裝置植入患者眼中，并且允許一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子從裝置中擴散并與眼中的VEGF、PDGF或VEGF和TOGF兩者結合，從而治療眼科病癥。
41.權利要求40的方法，其中所述眼科病癥選自早產兒視網膜病、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病視網膜病、年齡相關性黃斑變性、青光眼、色素性視網膜炎、白內障形成、成視網膜細胞瘤和視網膜缺血。
42.權利要求41的方法，其中年齡相關性黃斑變性是濕性年齡相關性黃斑變性。
43.權利要求40的方法，其中所述眼科病癥是糖尿病視網膜病。
44.權利要求40的方法，其中介于0.1 pg和1000 μδ/眼/患者/天之間的抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子擴散至眼中，其中所述抗血管生成分子是可溶性VEGF受體或可溶性I3DGF受體。
45.一種用于抑制內皮細胞增殖或血管形成的方法，所述方法包括將權利要求11的可植入細胞培養(yǎng)裝置植入患有細胞增殖病癥的患者中，并且允許抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子從裝置中擴散且與VEGF、PDGF或VEGF和TOGF兩者結合，其中所述結合抑制患者的內皮細胞增殖或血管形成。
46.權利要求45的方法，其中所述病癥選自血液學病癥、動脈粥樣硬化、炎癥、血管通透性增加和惡性腫瘤。
47.權利要求45的方法，其中每天每患者的治療有效量的抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子從裝置中擴散。
48.一種將抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子遞送給接受宿主的方法，所述方法包括將權利要求11的可植入細胞培養(yǎng)裝置植入接受宿主的靶區(qū)，其中包封的一種或多種ARPE-19細胞在靶區(qū)分泌抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子。
49.權利要求48的方法，其中所述靶區(qū)選自中樞神經系統(tǒng)，包括腦、腦室、脊髓、眼的水樣液和玻璃體液、脾、耳、心臟、結腸、肝、腎、乳腺、關節(jié)、骨髓、皮下和腹膜間隙。
50.權利要求48的方法，其中每天每患者的治療有效量的抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子擴散至靶區(qū)。
51.一種用于制備權利要求11的可植入細胞培養(yǎng)裝置的方法，所述方法包括 a.對至少一種ARPE-19細胞進行遺傳工程改造以分泌一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子，和 b.將所述經遺傳工程改造的ARPE-19細胞包封在半透膜內，其中所述膜允許一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子從中擴散通過。
52.權利要求51的方法，其中所述一種或多種抗血管生成抗體支架或抗血管生成分子由選自以下的核酸序列編碼:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQID NO:9,SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQID NO:21,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29 和 SEQ ID NO:31。
【文檔編號】C12P21/00GK103502464SQ201180066605
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2011年11月30日 優(yōu)先權日:2010年12月2日
【發(fā)明者】V.凌, A.M.尼斯蒂恩, W.陶, P.F.斯塔比拉, K.考珀 申請人:神經技術美國有限公司