識別人類乳突病毒(hpv)l2蛋白質(zhì)的單克隆抗體及使用其的測定hpv中和抗體的效價的方法
【專利摘要】本發(fā)明系有關(guān)對于多種高危險型HPV等具有結(jié)合活性的單克隆抗體的開發(fā)。本發(fā)明亦提供簡單又高通量的測定交叉中和抗體效價的方法，其可用于分析實驗對象血清樣品中抗HPV的交叉中和抗體等。本發(fā)明測定交叉中和抗體效價的方法包含：制備對抗具有高危險型HPV共同特異性氨基酸序列的肽的單克隆抗體，及使用此單克隆抗體分析交叉中和抗體等步驟。
【專利說明】識別人類乳突病毒(HPV) L2蛋白質(zhì)的單克隆抗體及使用其的測定HPV中和抗體的效價的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及識別HPV L2蛋白質(zhì)的單克隆抗體及使用該單克隆抗體測定交叉中和抗體的抗體效價的方法。
現(xiàn)有技術(shù)
[0002]HPV具有超過100種基因型。感染黏膜上皮(黏膜HPV)的基因型中，至少有15種(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 與 73 等高危險型)系子宮頸癌的原因。
[0003]HPV顆粒具有20面體殼體結(jié)構(gòu)，系由LI蛋白質(zhì)的72個五聚物(殼粒)與L2蛋白質(zhì)的12個分子組成，其內(nèi)裝入DNA基因體。于利用重組DNA技術(shù)大量單獨表達(dá)LI蛋白質(zhì)時，形成類殼體結(jié)構(gòu)(L1-殼體)。于與L2蛋白質(zhì)共表達(dá)時，形成與病毒顆粒相同組成的殼體(L1/L2-殼體)。L1-殼體具有強免疫原性，于接種于動物時，顯示不需任何佐劑即誘發(fā)抗體生成及誘發(fā)細(xì)胞免疫性。此免疫原性對HPV的類型具特異性，以第16型L1-殼體免疫處理時，誘發(fā)針對第16型具特異性的反應(yīng)。
[0004]L1-殼體作為疫苗抗原用時，可預(yù)防HPV感染。含HPV第6、11、16與18型的L1-殼體或以HPV第16與 18型作為抗原的疫苗已于國外開發(fā)，亦于日本上市。然而，彼等第一代疫苗抗原具高度類型特異性，例如，第16型L1-殼體疫苗僅能預(yù)防HPV第16型的感染。因此，有需要開發(fā)一種疫苗抗原，其誘發(fā)諸高危險型共同的中和抗體。
[0005]本發(fā)明人等先前已發(fā)現(xiàn)，HPV第16型的L2蛋白質(zhì)含有類型共同中和抗原決定部位，并已證實彼等抗原決定部位可作為第二代類型共同HPV疫苗抗原的用(非專利文件1、非專利文件2、非專利文件3、非專利文件4)。
[0006]尤其，于所有高危險型HPV中，HPV16L2蛋白質(zhì)的氨基酸56至75氨基酸序列為高保守，以與鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)接合的形式(KLH-P56/75)，或以由插入第16型LI蛋白質(zhì)氨基酸430至433內(nèi)的攜帶此區(qū)域的嵌合蛋白質(zhì)組成的嵌合殼體[16L1-430 (56/75)嵌合殼體]的形式接種于動物時，此區(qū)域可誘發(fā)有效對抗廣泛類型的交叉中和抗體(專利文件1、非專利文件3、與非專利文件4)。由彼等發(fā)現(xiàn)顯示，具有L2蛋白質(zhì)的氨基酸56至75氨基酸序列的抗原，系作為第二代HPV疫苗用以有效對抗所有高危險型HPV的大有可為候選者，其實際應(yīng)用目前正在開發(fā)中。
[0007][現(xiàn)有技術(shù)文獻]
[0008][專利文獻]
[0009]專利文件1:W02009/001867
[0010][非專利文獻]
[0011]非專利文獻 I:Kawana K, et al.:Common neutralization epitopein minor capsid protein L2of human papillomavirus type s16and6.J.Virology, 73，6188-6190，1999
[0012]非專利文獻 2:Kawana K，et al.，:Safety and immunogenicity of a peptidecontaining the cross-neutralization epitope of HPV16L2administered nasally inhealthy volunteers.Vaccine, 21:4256-4260, 2003
[0013]非專利文獻3: Kondo K，et a 1., !Neutralization ofHPV16， 18，31，and58pseudovirons with antisera induced by immunizing rabbits withsynthetic peptides representing segments of the HPV16minor capsid proteinL2surface region.Virology, 358:266-272,2007
[0014]非專利文獻 4:Kondo K，et al., Modification of human papillomavirus-likeparticle vaccine by insertion of the cross-reactive L2~epitopes.J.Med.Virol.,80:841-846, 2008

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015](發(fā)明要解決的課題)
[0016]為了實際使用包含L2蛋白質(zhì)的氨基酸56至75氨基酸序列的抗原作為第二代HPV疫苗，需要研究此抗原是否于人體中有效地誘發(fā)交叉中和抗體。特別是于臨床試驗中，由于得自實驗對象的許多血清樣品必須測定，因此需要一種簡單又高通量的方法以測定交叉中和抗體效價。
[0017]由于沒有允許HPV增殖的培養(yǎng)細(xì)胞株，因而使用一種感染性假病毒(其通過將報導(dǎo)基因的表達(dá)質(zhì)粒裝入HPV L1/L2-殼體而得到)監(jiān)測HPV感染。利用測定抑制此感染性假病毒的感染能力，檢測抗HPV的中和抗體。然而，此方法無法區(qū)分基因型-特異性中和抗體(亦即，對抗各HPV LI蛋白質(zhì)的抗體)的感染抑制及交叉中和抗體(亦即，對抗HPV型共同L2蛋白質(zhì)的抗體)的感染抑制，且因需要大量精力及時間，亦不適用于許多分析物的檢測。
[0018]于此等情況下，有 需要開發(fā)一種高通量方法，以測定由第二代HPV疫苗誘發(fā)的交叉中和抗體的抗體效價。
[0019](解決課題的方法)
[0020]本發(fā)明人等已制備一種針對具有聞危險型HPV的L2蛋白質(zhì)共同的特定氣基酸序列的肽的單克隆抗體，并已發(fā)現(xiàn)使用此單克隆抗體檢測由第二代HPV疫苗誘發(fā)的交叉中和抗體的方法；此發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致完成本發(fā)明。
[0021]亦即，本發(fā)明提供以下所示的抗HPV L2蛋白質(zhì)單克隆抗體、使用上述單克隆抗體檢測或診斷交叉中和抗體的方法、分析試劑盒、包含上述單克隆抗體的診斷試劑或醫(yī)藥品、以及產(chǎn)生上述單克隆抗體的細(xì)胞等。
[0022][I] 一種單克隆抗體，其識別人類乳突病毒L2蛋白質(zhì)的共同抗原決定部位。
[0023][2]根據(jù)上述[I]的單克隆抗體，其中，人類乳突病毒L2蛋白質(zhì)的該共同抗原決定部位由 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:24 或 SEQ ID NO:25 所示氨基酸序列組成。
[0024][3]根據(jù)上述[I]的單克隆抗體，其中，人類乳突病毒L2蛋白質(zhì)的該共同抗原決定部位由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列組成。
[0025][4]根據(jù)上述[I]的單克隆抗體，其包含SEQ ID NO: 11 (CDRHl)、SEQ ID NO:12(CDRH2)、SEQ ID NO:13(CDRH3)、SEQ ID NO:14 (CDRLl)、SEQ ID NO:15(CDRL2)及 SEQID N0:16(CDRL3)所示氨基酸序列。
[0026][5]根據(jù)上述[I]的單克隆抗體，其包含SEQ ID NO: 17 (CDRHl)、SEQ ID NO:18 (CDRH2)、SEQ ID NO:19(CDRH3)、SEQ ID NO:20 (CDRLl)、SEQ ID NO:21 (CDRL2)及 SEQID NO:22(Q)RL3)所不氣基酸序列。
[0027][6]根據(jù)上述[I]的單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)系SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，而其輕鏈可變區(qū)系SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
[0028][7]根據(jù)上述[I]的單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)系SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，而其輕鏈可變區(qū)系SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列。[0029][8]根據(jù)上述[6]的單克隆抗體，其識別人類乳突病毒L2蛋白質(zhì)，且由保藏號FERMBP-11304的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。
[0030][9]根據(jù)上述[7]的單克隆抗體，其識別人類乳突病毒L2蛋白質(zhì)，且由保藏號FERMBP-11305的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。
[0031][10] 一種測定人類乳突病毒(HPV)的交叉中和抗體的抗體效價的方法，該方法包括下述步驟:
[0032](a)使測試樣品與HPV抗原接觸，使該樣品中的抗體與該抗原結(jié)合的步驟；及
[0033](b)添加根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體至步驟(a)的反應(yīng)體系中，測定結(jié)合于該抗原的該單克隆抗體的量的步驟。
[0034][11] 一種測定人類乳突病毒(HPV)的交叉中和抗體的抗體效價的方法，該方法包括下述步驟:
[0035](a)使測試樣品與HPV抗原接觸，使該樣品中的抗體與該抗原結(jié)合的步驟；及
[0036](b)使步驟(a)中未與抗體結(jié)合的剩余的抗原決定部位與權(quán)利要求1所述的單克隆抗體接觸，測定結(jié)合于該抗原決定部位的該單克隆抗體的量。
[0037][12] 一種測定人類乳突病毒(HPV)的交叉中和抗體的抗體效價的方法，該方法包括下述步驟:
[0038](a)使權(quán)利要求1所述的單克隆抗體與測試樣品混合后，與HPV抗原接觸，形成抗體/抗原復(fù)合物 '及
[0039](b)測定步驟(a)所得抗體/抗原復(fù)合物中的、形成了抗體/抗原復(fù)合物的該單克隆抗體的量。
[0040][13] [10]或[11]所述的方法，其中，使結(jié)合于抗原的該單克隆抗體或與該抗原決定部位接觸并結(jié)合的單克隆抗體，與識別該單克隆抗體的標(biāo)記第二抗體接觸，通過在測試樣品存在及不存在下測定由該標(biāo)記第二抗體產(chǎn)生的信號的強度，測定該測試樣品中能夠存在的交叉中和抗體的抗體效價。
[0041][14-1]根據(jù)上述[12]的方法，其中，使步驟(a)中形成的單克隆抗體與抗原的復(fù)合物與識別該單克隆抗體的標(biāo)記第二抗體接觸，通過測定添加測試樣品前后的由該標(biāo)記第二抗體產(chǎn)生的信號強度，從而測定該測試樣品中能夠存在的交叉中和抗體的抗體效價。
[0042][14-2]根據(jù)上述[12]的方法，其中，使步驟(a)中形成的單克隆抗體與抗原的復(fù)合物與識別該單克隆抗體的標(biāo)記第二抗體接觸通過測試樣品存在及不存在下測定由標(biāo)記第二抗體產(chǎn)生的信號強度，從而測定測試樣品中能夠存在的交叉中和抗體的抗體效價。
[0043][15]根據(jù)上述[10]至[14-2]中任一項的方法，其中，該HPV抗原固定于固體支撐物。
[0044][16] 一種用于測定測試樣品中的HPV交叉中和抗體存在的試劑盒，其包含(a)固定于固體支撐物的HPV抗原，(b)根據(jù)上述[I]的單克隆抗體，及(c)識別根據(jù)上述[I]的單克隆抗體的標(biāo)記第二抗體。
[0045][17] 一種HPV感染的診斷試劑，其包含根據(jù)上述[I]的單克隆抗體。
[0046][18] 一種細(xì)胞株，其產(chǎn)生根據(jù)上述[I]的單克隆抗體。
[0047][19]根據(jù)上述[18]的細(xì)胞株，其保藏號為FERM BP-11304或FERM BP-11305。
[0048][20] 一種醫(yī)藥品，其包含根據(jù)上述[I]的單克隆抗體。
[0049][21] 一種HPV治療劑，其包含根據(jù)上述[I]的單克隆抗體。
[0050](發(fā)明的效果)
[0051]根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明單克隆抗體與HPV抗原間的結(jié)合可由與樣品的競爭抑制程度測定，從而得知樣品中交叉中和抗體的水平。由于使用ELISA，本發(fā)明方法因此迅速又簡單，且容許高通量測定臨床試驗中得自實驗對象的許多血清樣品中的交叉中和抗體效價。再者，本發(fā)明的單克隆抗體亦可用于診斷HPV感染或作為HPV感染的治療劑用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1顯示利用ELISA的抗原決定部位圖譜定位結(jié)果。
[0053]圖2顯示P56/75由單克隆抗體13B及24B識別的抗原決定部位，以及高危險型HPV間保守的氨基酸序列區(qū)。
[0054]圖3顯示利用單克隆抗體13B及24B的第16型及58型假病毒的中和。
[0055]圖4顯示單克隆抗體13B及24B與高危險型L1/L2-殼體的結(jié)合。
[0056]圖5顯示如何使用單克隆抗體13B及24B以ELISA測定交叉中和抗體效價。
[0057]圖6顯示經(jīng)KLH-接合肽或嵌合殼體免疫處理的兔子中誘發(fā)的交叉中和抗體。
[0058]圖7顯示單克隆抗體13B及24B中重鏈及輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，以及其互補決定區(qū)(⑶Rs)。
[0059]圖8顯示利用ELISA的抗原決定部位圖譜定位結(jié)果。
[0060]圖9顯示P56/75中被單克隆抗體13B及24B識別的抗原決定部位，以及高危險型HPV間保守的氨基酸序列區(qū)。
[0061]圖10顯示利用單克隆抗體13B及24B的第16、18、31、33、35、51、52及58型假病
毒的中和。
[0062]圖11顯示單克隆抗體13B及24B與高危險型L1/L2-殼體的結(jié)合。
[0063]發(fā)明的【具體實施方式】
[0064]下文將說明如何制備識別HPV L2蛋白質(zhì)單克隆抗體(下文亦稱為本發(fā)明單克隆抗體)的抗原，及如何制備此類單克隆抗體。
[0065]人類乳突病毒具有LI及L2兩個結(jié)構(gòu)基因，其產(chǎn)物具有如同殼體蛋白質(zhì)的功能。 [0066]“人類乳突病毒L2蛋白質(zhì)”一詞意指由人類乳突病毒(HPV)的L2基因編碼的蛋白質(zhì)(Zhou J et al., Expression of vaccinia recombinant HPV16LIand L20RF proteinsin epithelial cells is sufficient for assembly of HPV virion-like particles.Virology.185:251-257, 1991)。[0067]用于本發(fā)明的HPV L2蛋白質(zhì)或L2肽可為，例如，由GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (SEQID NO: I)所示的蛋白質(zhì)(多肽)或其衍生物。
[0068]具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生物的實例包括(I)由上述氨基酸序列中刪除I或多個[較佳為約I至10個，更佳為數(shù)個(I至9或I至5個)，又更佳為1、2或3個]氨基酸構(gòu)成者；(2)于上述氨基酸序列中添加I或多個[較佳為約I至20個，更佳為約I至10個，又更佳為數(shù)個(I至9個)，尚又更佳為1、2或3個]氨基酸構(gòu)成者；(3)于上述氨基酸序列中插入I或多個[較佳為約I至20個，更佳為約I至10個，又更佳為數(shù)個(I至9個)，尚又更佳為1、2或3個]氨基酸構(gòu)成者；或(4)于上述氨基酸序列中取代I或多個[較佳為約I至10個，更佳為數(shù)個(I至9或I至5個)，又更佳為1、2或3個]其他氨基酸構(gòu)成者；或(5)其任何組合。
[0069]應(yīng)注意的是，本文使用的蛋白質(zhì)(多肽)標(biāo)記法中，依照標(biāo)準(zhǔn)用法及慣例，左側(cè)方向為N端(氨基端)方向,右側(cè)方向為C端(羧基端)方向。
[0070]本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)于C末端可具有選自羧基、羧酸酯基、酰胺基基或酯的任何基團。
[0071]本文所用的“抗體”一詞意指能識別或與作為抗原的HPV L2蛋白質(zhì)結(jié)合的整個抗體分子或其片段；其可為多克隆或單克隆。
[0072]本文所用的“單克隆抗體”一詞系指得自單一類型抗體產(chǎn)生細(xì)胞的抗體分子?！皢慰寺】贵w” 一詞涵蓋單克隆抗體分子本身或其片段。
[0073]上述抗體或單克隆抗體的“片段”系指全長抗體的一部分，通常包含抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)的部分；舉例而言，抗體片段包括Fab、Fab’、F (ab’)2及Fv片段；其他片段包括雙功能抗體(diabodies)、線性抗體、單鏈抗體分子、及由抗體片段組成的多重特異性抗體。
[0074]本發(fā)明方法中所用的較佳單克隆抗體為IgGl或IgG2抗體，其包含源自小鼠的輕鏈與重鏈可變區(qū)，及源自小鼠的Y I重鏈與K輕鏈恒定區(qū)。
[0075]此外，如后文所述，作為醫(yī)藥品用者較佳為部分或完全人源化或為嵌合的單克隆抗體。
[0076]本文所用的“共同抗原決定部位”一詞意指HPV L2蛋白質(zhì)氨基酸序列內(nèi)的區(qū)域，其于高危險型HPV間為高保守，及可被本發(fā)明單克隆抗體識別；其實例為氨基酸序列 GTGGRTGYIPL(SEQ ID NO:2)、GGLGIGTGSGTGGR (SEQ ID NO:3)、SGTGGRTGYI (SEQ IDNO:24)或 LGIGTGSGTG(SEQ ID NO:25)或氨基酸序列 GTGGRTGYIPL(SEQ ID NO:2)或GGLGIGTGSGTGGR (SEQ ID NO:3)，或其突變序列。
[0077]具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:24 與 SEQ ID NO:25 所示氨基酸序列的突變序列的多肽包括⑴由上述氨基酸序列中刪除I至3個(或I至2個、或I個)氨基酸構(gòu)成者；(2)于上述氨基酸序列中添加I至3個(或I至2個、或I個)氨基酸構(gòu)成者；⑶于上述氨基酸序列中插入I至3個(或I至2個、或I個)氨基酸構(gòu)成者；或(4)于上述氨基酸序列中取代I至3個(或I至2個、或I個)其他氨基酸構(gòu)成者；或(5)其任何組合。
[0078]本文所用的“識別HPV L2蛋白質(zhì)”一詞意指特異性地結(jié)合HPV L2蛋白質(zhì)，更具體而言，意指該特異性抗原-抗體反應(yīng)可利用例如酶免疫測定法的免疫測定法檢測。
[0079]根據(jù)本發(fā)明的識別HPV L2蛋白質(zhì)的單克隆抗體可為任何型態(tài)，只要其特異性地結(jié)合HPV L2蛋白質(zhì)的部分肽[較佳為SEQ ID N0:1的HPV L2肽(P56/75)]即可。此類單克隆抗體的實例包括特異性地結(jié)合具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或其衍生物的多肽者。
[0080]根據(jù)本發(fā)明的識別HPV L2蛋白質(zhì)的單克隆抗體的更具體實例，包括特異性地結(jié)合HPV L2蛋白質(zhì)中的共同抗原決定部位者(較佳為SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:24 或 SEQ ID NO:25 的肽)。
[0081]識別SEQ ID NO:2肽的單克隆抗體于本文中系指13B，而識別SEQ ID N0:3肽的單克隆抗體于本文中系指24B。13B亦涵蓋識別SEQ ID NO:24肽的單克隆抗體，24B亦涵蓋識別SEQ ID NO:25肽的單克隆抗體。
[0082]本文所用的“互補決定區(qū)” 一詞意指于可變區(qū)內(nèi)的區(qū)域，其以互補方式直接與抗原結(jié)合，更具體而言系指圖7所示重鏈或輕鏈的三個區(qū)域(⑶RH1、⑶RH2及⑶RH3，或⑶RL1、CDRL2 及 CDRL3)。
[0083]較佳的單克隆抗體為單克隆抗體13B或24B，其互補決定區(qū)(⑶Rs)具有圖7所示重鏈及輕鏈的⑶Rl至⑶R3序列。
[0084]更佳者為其重鏈可變區(qū)系SEQ ID NO:7所示氨基酸序列及其輕鏈可變區(qū)系SEQ IDNO:8所示氨基酸序列，其中SEQ ID NOs:7與8所示氨基酸序列，除其互補決定區(qū)外，可為其突變序列的單克隆抗體。此類互補決定區(qū)為例如SEQ ID NOs: 11至16所示氨基酸序列的至少一者。
[0085]替代地較佳者為其重鏈可變區(qū)系SEQ ID NO:9所示氨基酸序列及其輕鏈可變區(qū)系SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列，其中SEQ ID NOs:9與10所示氨基酸序列，除其互補決定區(qū)外，可為其突變序列的單克隆抗體。此類互補決定區(qū)為例如SEQ ID NOs:17至22所示氨基酸序列的至少一者。
[0086]除其互補決定區(qū)外，SEQ ID NOs:7至10所示氨基酸序列的突變序列包括⑴由上述氨基酸序列中刪除I或多個[較佳為約I至10個，更佳為數(shù)個(I至9或I至5個)，又更佳為1、2或3個]氨基酸構(gòu)成者；(2)于上述氨基酸序列中添加I或多個[較佳為約I至20個，更佳為約I至10個，又更佳為數(shù)個(I至9個)，尚又更佳為1、2或3個]氨基酸構(gòu)成者；(3)于上述氨基酸序列中插入I或多個[較佳為約I至20個，更佳為約I至10個，又更佳為數(shù)個(I至9個)，尚又更佳為1、2或3個]氨基酸構(gòu)成者；或(4)于上述氨基酸序列中取代I或多個[較佳為約I至10個，更佳為數(shù)個(I至9或I至5個)，又更佳為
1、2或3個]其他氨基酸構(gòu)成者；或(5)其任何組合。
[0087]恒定區(qū)的氨基酸序列可為衍生自人類或哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、綿羊、豬、牛、貓、狗、猴子)的IgGl或IgG2抗體者。
[0088]單克隆抗體13B的實例包括由標(biāo)示為小鼠-小鼠雜交瘤13B(FERM BP-11304)的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體；單克隆抗體24B的實例包括由標(biāo)示為小鼠-小鼠雜交瘤24B(FERM BP-11305)的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0089]“交叉中和抗體” 一詞意指能中和二或多個HPV基因型的抗體，或能中和2或多個HPV基因型感染的抗體。已知HPV具有非常大量的基因型，例如第6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 與 73 型(參見 zur Hausen H.Papillomavirusinfections—a major cause of human cancers.Biochim Biophys Acta.1288:F55-78, 1996)。較佳的交叉中和抗體為能中和三或多個高危險型HPV(第16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68與73型)的抗體。更佳者為能中和第16與18型以及選自第33、52與58型的至少一或多個HPV類型的抗體。更具體而言，較佳者為能特異地結(jié)合上述高危險型HPV的L2蛋白質(zhì)且能中和HPV的抗體。
[0090]“HPV抗原” 一詞意指于交叉中和抗體的檢測中，能用以形成抗原/抗體復(fù)合物的抗原。可使用的HPV抗原可為任何基因型，只要其具有共同類型的抗原決定部位(例如，共同抗原決定部位)，例如攜帶L2蛋白質(zhì)的殼體或假病毒。較佳者為HPV16的L1/L2嵌合殼體。再者，亦可能使用全長L2肽或其部分[例如，L2肽(56至75)]或其突變體、或與鑰孔血藍(lán)蛋白(例如，KLH-P56/75)或與BSA接合的L2肽等作為HPV抗原。
[0091]“標(biāo)記第二抗體”一詞意指識別本發(fā)明單克隆抗體的抗體，其系以能產(chǎn)生可檢測信號(例如酶活性、放射性同位素、生色或發(fā)光)的物質(zhì)標(biāo)記。
[0092]茲于下文說明如何制備本發(fā)明單克隆抗體的抗原，以及如何制備本發(fā)明的單克隆抗體。
[0093](I)制備抗原
[0094]任何抗原均可用以制備本發(fā)明單克隆抗體，例如具有涵蓋HPV L2蛋白質(zhì)氨基酸56至75序列的肽[L2肽(56至75)]，更具體而言為具有一或多個抗原決定基的(合成)肽，其與含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或其鹽的多肽，以及由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或其衍生物組成的多肽(亦簡稱為L2肽抗原)相同。
[0095]含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或其鹽的多肽可藉由已知方法制備，例如，根據(jù)于W009/01867所記載的·方法。此外，作為L2肽抗原用的肽亦可(I)根據(jù)肽合成的已知技術(shù)或
(2)利用以適當(dāng)肽酶切割含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2、3、24或25所示氨基酸序列的多肽予以制備。
[0096]肽合成技術(shù)可為固相合成技術(shù)或液相合成技術(shù)。亦即，部分肽或能構(gòu)成此類肽的氨基酸與其余部分縮合，若產(chǎn)物具有保護基團，則消除彼等保護基團，從而可制備所需肽。縮合及消除保護基團的已知程序可于下述文件中找到，例如:
[0097]⑴ M.Bodanszky and Μ.A.0ndetti, Peptide Synthesis, IntersciencePublishers, New York(1966);及
[0098](ii)Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)。
[0099]反應(yīng)后，可利用標(biāo)準(zhǔn)純化程序(例如組合使用溶劑萃取法、蒸餾、管柱層析法、液體層析法及再結(jié)晶)純化及單離該肽。若如此得到的肽呈游離型，則可藉由已知方法將其轉(zhuǎn)化為適當(dāng)鹽類型；相反地，若得到的肽呈鹽類型，則可藉由已知方法將其轉(zhuǎn)化為游離型。
[0100]酰胺型的肽可使用適于形成酰胺的市售可得肽合成樹脂予以合成。此類樹脂的實例包括氯甲基樹脂、羥甲基樹脂、二苯甲胺樹脂、胺甲基樹脂、4-芐氧基芐醇樹脂、4-甲基二苯甲胺樹脂、PAM樹脂、4-羥甲基甲苯酰胺甲基樹脂、聚丙烯酰胺樹脂、4-(2’，4’ - 二甲氧苯基-羥甲基)苯氧樹脂、4-(2’，4’-二甲氧苯基-弗甲氧羰酰(Fmoc)胺乙基)苯氧樹脂等。使用此類樹脂，根據(jù)各種已知縮合技術(shù)，使其α-氨基及側(cè)鏈(各)官能基經(jīng)適當(dāng)保護的氨基酸于樹脂上與所需肽序列一致地予以縮合。反應(yīng)的最后步驟中，使肽與樹脂裂離，同時移除各種保護基團，從而制得所需肽。替代地，使用氯三苯甲基樹脂、肟樹脂、4-羥苯甲酸樹脂或類似物合成及使部分經(jīng)保護的肽裂離并以例行方式移除保護基團，從而可制得所需肽。[0101]如上所述，為了縮合經(jīng)保護的氨基酸，可使用可用于肽合成的各種活化試劑，特佳者為碳二亞胺類。碳二亞胺類的實例包括DCC、N，N’ - 二異丙基碳二亞胺、N-乙基-N’ - (3- 二甲胺脯胺酰基)碳二亞胺等。欲以彼等試劑活化，可使經(jīng)保護的氨基酸與抑制消旋反應(yīng)添加劑(例如，HOBt, HOOBt) 一同直接添加于樹脂，或可于添加至樹脂的前，經(jīng)活化成為對稱酸酐類或HOBt酯類或HOOBt酯類。用于活化經(jīng)保護的氨基酸或其與樹脂縮合反應(yīng)的溶劑可從已知可用于肽縮合反應(yīng)的溶劑間適當(dāng)選定；其實例包括酰胺類(例如，N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯啶酮)、鹵化烴(例如，二氯甲烷、氯仿)、醇類(例如，三氟乙醇)、亞砜類(例如，二甲亞砜)、三級胺(例如，吡啶)、醚類(例如，二烷、四氫呋喃)、腈類(例如，乙腈、丙腈)、酯類(例如，乙酸甲酯、乙酸乙酯)或其適當(dāng)混合物。反應(yīng)溫度可從已知用于肽鍵形成反應(yīng)的范圍適當(dāng)選定，通常從約-20°C至約50°C的范圍適當(dāng)選定。通常使用約1.5倍至約4倍過量的活化氨基酸衍生物。經(jīng)茚三酮反應(yīng)測試，若縮合不夠，則可于未消除保護基團下，重復(fù)縮合反應(yīng)而確保充分縮合。若連重復(fù)反應(yīng)也未達(dá)成充分縮合，則可藉由乙酸酐或乙酰咪唑使未反應(yīng)的氨基酸乙?；?，從而防止對其后反應(yīng)的任何影響。 [0102]起始?xì)饣嶂校瑲饣Ｗo基的實例可為節(jié)氧基擬基、叔丁氧基擬基、叔戍氧基擬基、異茨氧基擬基、甲氧基節(jié)氧基擬基、2_氯-節(jié)氧基擬基、2_溴-節(jié)氧基擬基、金剛燒氧基羰基、三氟乙?；⑻；?、甲?；?、2-硝基苯基亞磺基、二苯基膦噻吩甲?；-9-弗甲氧基擬基等?？⒒Ｗo基的實例可為CV6烷基、C3_8環(huán)烷基、C7_14芳烷基、2_金剛烷基、4-硝基芐基、4-甲氧基芐基、4-氯芐基、苯甲?；谆c芐氧基羰酰肼基、叔丁氧基羰基酰肼基、三苯甲基酰肼基等。
[0103]絲氨酸與蘇氨酸中的羥基，舉例而言，可利用酯化或醚化予以保護。于此情形下，適用于酯化的基團實例包括低級(C1J烷?；?例如，乙?；?、芳?；?例如，芐?；?、碳酸衍生的基團(例如，芐氧基羰基、乙氧基羰基)等。同樣地，適用于醚化的基團實例包括芐基、四氧批喃基、叔丁基等。
[0104]酪氨酸中的酚羥基的保護基實例包括芐基、氯-芐基、2-硝基芐基、溴-芐氧基羰基、叔丁基等。
[0105]組氨酸中的咪唑的保護基實例包括對甲苯磺?；?、4-甲氧基-2，3，6-三甲苯磺?；?、二硝基酚基、芐氧基甲基、叔丁氧基甲基、叔丁氧基羰基、三苯甲基、N-9-弗甲氧基羰基
坐寸ο
[0106]起始物質(zhì)中活化型羧基的實例為對應(yīng)的酸酐類、迭氮化物、活化酯類[帶有醇的酯類(例如，五氯酚、2，4，5-三氯酚、2，4- 二硝基酚、氰甲醇、對硝基酚、HONB、N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基酞酰亞胺、HOBt)]等。起始物質(zhì)中活化型氨基的實例為對應(yīng)的磷酰胺類。
[0107]移除(消除)保護基團的技術(shù)包括，例如，催化劑(例如，Pd-黑或Pd-碳)存在下，于氫氣流中的催化還原；以無水氟化氫、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或其混合物等酸處理；以二異丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪等堿處理，以及于液態(tài)氨中以鈉還原。利用上述酸處理的消除反應(yīng)通常于溫度_20°C至40°C進行，并添加對酸處理有效的陽離子捕獲劑(例如，苯甲醚、酚、苯甲硫醚、間甲酚、對甲酚、二甲硫醚、1，4-丁二硫醇，1，2-乙二硫醇)。同樣地，于組氨酸中作為咪唑保護基用的2，4- 二硝基苯基可藉由硫酚處理而移除，色氨酸中作為吲哚保護基用的甲酰基不僅可如上述，于1，2-乙烷二硫醇或1，4-丁烷二硫醇存在下，經(jīng)由酸處理脫保護，惟亦可以稀釋氫氧化鈉、稀釋氨水等堿處理予以移除。
[0108]起始物質(zhì)中，不應(yīng)涉及反應(yīng)的官能基的保護與保護基，以及保護基的消除與涉及反應(yīng)的官能基的活化，可從已知基團或已知方法中適當(dāng)選定。
[0109]獲得酰胺型肽的另一技術(shù)如下。首先，使羧基端氨基酸的α -羧基酰胺化，接著從氨基側(cè)使肽鏈延伸至所需鏈長，隨后自此肽鏈利用只移除N末端α -氨基上的保護基制備一肽，及利用只移除C端羧基上的保護基制備一肽(或氨基酸)，如上述，于混合溶劑中使此二肽進一步縮合。此縮合反應(yīng)的細(xì)節(jié)如上述。將利用縮合反應(yīng)制得的經(jīng)保護的肽純化后，以上述方法移除所有保護基，制得所需的粗制肽。充分利用各種已知純化技術(shù)純化此粗制肽，將其主要溶離份冷凍干燥，從而可制得酰胺型的所需肽。
[0110]欲獲得酯型肽時，使羧基端氨基酸的α -羧基與所需醇縮合，得到氨基酸酯，隨后重復(fù)用以獲得酰胺型肽的相同程序，從而可制得酯型的所需肽。
[0111]L2肽抗原可直接用于免疫處理。替代地，L2肽抗原亦可接合或吸附至適當(dāng)載劑上以用于免疫處理。該載劑可為任何類型，且只要對抗接合或吸附于該載劑上的L2肽抗原的單克隆抗體可有效被誘發(fā)，則可以任何比率與L2肽抗原(半抗原)混合以供接合或吸附。一般而言，可使用每半抗原0.1至100重量比的常被用于制備對抗半抗原的單克隆抗體的天然或合成的聚合載劑以供接合或吸附?？晒┦褂玫奶烊痪酆陷d劑實例包括哺乳動物血清白蛋白(例如牛、兔或人類血清白蛋白)、哺乳動物甲狀腺球蛋白(例如?；蛲眉谞钕偾虻鞍?、哺乳動物血紅素(例如牛、兔、人類或綿羊血紅素)、鑰孔血藍(lán)蛋白等?？晒┦褂玫暮铣删酆陷d劑實例包括聚合物或共聚物的各種乳膠，例如聚氨基酸類、聚苯乙烯類、聚丙烯酸類(polyacryls)、聚乙烯類、聚丙烯類等。
[0112]此外，各種縮合劑可用于半抗原與載劑間的偶合。便于使用的縮合劑實例包括容許酪氨酸、組氨酸或色氨酸交聯(lián)的重氮化合物(例如，雙重氮聯(lián)苯胺)；容許氨基酸間的交聯(lián)的二醛化合物(例如，戊二醛)；二異氰酸酯化合物(例如，甲苯_2，4- 二異氰酸酯)；容許硫醇基間的交聯(lián)的二馬來亞酰胺化合物(例如，N, N’ -鄰伸苯基二馬來亞酰胺)；容許氨基與硫醇基間的交聯(lián)的馬來亞酰胺活化酯化合物；容許氨基與羧基間的交聯(lián)的碳二亞胺化合物等。此外，關(guān)于氨基間的交聯(lián)，其中一氨基可與具有二硫吡啶基[例如，3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀酰亞氨基(STOP)]的活化酯試劑反應(yīng)，然后還原從而引入硫醇基，而另一氨基可以馬來亞酰胺活化酯試劑處理以引入馬來亞酰胺基基，隨后使此二氨基反應(yīng)。
[0113]于本發(fā)明單克隆抗體的制備中，如上述的L2肽抗原較佳為與KLH(鑰孔血藍(lán)蛋白)接合。應(yīng)注意的是，KLH與L2肽抗原間較佳的復(fù)合物系于N末端具附加的半胱氨酸殘基，以避免肽區(qū)遭此KLH遮蓋。
[0114](2)制備單克隆抗體
[0115]利用例如腹膜內(nèi)輸注、靜脈內(nèi)輸注、皮內(nèi)注射、皮下注射或其他施用模式，單獨或與載劑或稀釋劑組合下，施用L2肽抗原至溫血動物可能產(chǎn)生抗體的部位。欲增強抗體產(chǎn)生力，于施用抗原期間，可施用弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑。通常系每2至6周重復(fù)施用一次，總共二至10次。溫血動物的實例包括猴子、兔、狗、天竺鼠、小鼠、大鼠、綿羊、山羊、雞等，于單克隆抗體制備中，較佳為使用小鼠。
[0116]為了制備單克隆抗體，于以L2肽抗原免疫處理的溫血動物(例如小鼠)中，挑選顯現(xiàn)抗體效價者，并于最后免疫處理2至5天后，摘取其脾臟或淋巴結(jié)。可使彼等脾臟或淋巴結(jié)中所含抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，從而制備產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤(下文中亦稱為本發(fā)明的抗體產(chǎn)生雜交瘤)。
[0117]血清中的抗L2肽抗體效價，舉例而言，可利用如下文后述的標(biāo)記L2肽與抗血清樣品反應(yīng)，然后測定該標(biāo)記結(jié)合于抗體分子的活性予以測定。細(xì)胞融合可藉由已知方法完成，例如，根據(jù) Kdhier與 Milstein [Nature, vol.256，page495 (1975)]的方法。融合啟動子的實例包括聚乙二醇(PEG)、仙臺(Sendai)病毒等，較佳為使用PEG或類似物。骨髓瘤細(xì)胞的實例包括NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等，較佳為使用P3U1或類似物。所使用的抗體產(chǎn)生細(xì)胞(脾臟細(xì)胞)與骨髓瘤細(xì)胞間的較佳比率通常約1:1至20:1，以約10%至80%的濃度添加PEG (較佳為PEG1000至PEG6000)，溫度通常為20°C至40°C，較佳為30°C至37°C，通常持續(xù)培養(yǎng)I至10分鐘，從而達(dá)成有效的細(xì)胞融合。
[0118]可使用各種技術(shù)篩選本發(fā)明之抗體產(chǎn)生雜交瘤。例如,將雜交瘤培養(yǎng)上清液各自添加至含有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列之多肽或其鹽或其部分肽直接或與載劑組合吸附于其上之固相(例如微量培養(yǎng)板)，接著添加放射性或酶性標(biāo)記之抗免疫球蛋白抗體(用于細(xì)胞融合之抗體產(chǎn)生細(xì)胞系源自小鼠時，則使用抗小鼠免疫球蛋白抗體)或蛋白質(zhì)A,以檢測結(jié)合于該固相之本發(fā)明抗體。替代地,將雜交瘤培養(yǎng)上清液各自添加至抗免疫球蛋白抗體或蛋白質(zhì)A吸附于其上之固相，接著添加放射性或酶性標(biāo)記之含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列之多肽，以檢測結(jié)合于該固相之本發(fā)明單克隆抗體。于上述篩選中，亦可使用HPV16L1/L2-殼體作為抗原。本發(fā)明之單克隆抗體產(chǎn)生雜交瘤之篩選或育種，通常系于HAT (次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷)存在下之含10%至20%胎牛血清之動物細(xì)胞培養(yǎng)基(例如，RPMI1640)中完成。各雜交瘤培養(yǎng)上清液之抗體效價可藉由如上述測定本發(fā)明抗體于抗血清中抗體效價之相同方法測定。
[0119]本發(fā)明單克隆抗體可從本發(fā)明抗體產(chǎn)生雜交瘤之培養(yǎng)產(chǎn)物(例如培養(yǎng)上清液、培養(yǎng)細(xì)胞)中獲得。替代地，本發(fā)明單克隆抗體亦可從以本發(fā)明抗體產(chǎn)生雜交瘤活體接種(例如腹膜內(nèi))非人類溫血動物之體液(例如腹水、血液)中獲得。如同多克隆抗體之標(biāo)準(zhǔn)分離及純化，本發(fā)明之單克隆抗體可根據(jù)免疫球蛋白之分離及純化技術(shù)[例如，鹽析法、酒精沉淀、等電點沉淀、電泳、以離子交換劑(例如，DEAE)吸附/脫附、超速離心法、凝膠過濾法、使用僅收集單克隆抗體分子之固定化抗原之固相或活性吸附劑(例如，蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G)然后解離以獲得單克隆抗體分子之特殊純化技術(shù)]，從此類培養(yǎng)產(chǎn)物或體液中分離及純化。
[0120]如上述，本發(fā)明單克隆抗體可利用于溫血動物之體內(nèi)或體外培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，及從其體液或培養(yǎng)產(chǎn)物中收集單克隆抗體分子獲得。
[0121]應(yīng)注意的是，(a)產(chǎn)生與含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列之多肽之部分區(qū)域具反應(yīng)性之本發(fā)明單克隆抗體之雜交瘤，及(b)產(chǎn)生與上述多肽具反應(yīng)性惟不與其部分區(qū)域具反應(yīng)性之本發(fā)明單克隆抗體之雜交瘤，舉例而言，可利用測定對應(yīng)于部分區(qū)域之肽與由各雜交瘤產(chǎn)生之單克隆抗體間之結(jié)合進行篩選。
[0122](3)交叉中和抗體之分析
[0123]本發(fā)明單克隆抗體提供交叉中和抗體之有效分析或檢測，較佳為對抗人類乳突病毒(HPV)之交叉中和抗體抗體效價之有效分析或檢測。
[0124]更具體而言，可利用下述完成分析:[0125]方法A，其包括下述步驟:
[0126](a)使測試樣品與HPV抗原接觸，以建立樣品中抗體與抗原之結(jié)合 '及
[0127](b)使步驟(a)中仍未與抗體結(jié)合之剩余的抗原決定部位與本發(fā)明單克隆抗體接觸，以測定結(jié)合抗原決定部位之單克隆抗體量；或
[0128]方法B，其包括下述步驟:
[0129](a)使本發(fā)明單克隆抗體與測試樣品之混合物與HPV抗原接觸，以形成抗體/抗原復(fù)合物；及
[0130](b)測定步驟(a)所得抗體/抗原復(fù)合物中，用以形成彼等復(fù)合物之本發(fā)明單克隆抗體量。
[0131]替代地，方法A可包括下述步驟:
[0132](a)使測試樣品與HPV抗原接觸，以建立樣品中抗體與抗原之結(jié)合 '及
[0133](b)添加本發(fā)明單克隆抗體至步驟(a)之反應(yīng)系中，以測定結(jié)合于抗原之單克隆抗體量。
[0134]下文將進一步說明根據(jù)本發(fā)明之交叉中和抗體之分析。
[0135]本發(fā)明單克隆抗體可用于任何類型之分析。測試溶液中對應(yīng)于交叉中和抗體量之本發(fā)明單克隆抗體量之分析，較佳為可利用化學(xué)或物理方法檢測，然后從含有已知抗體量之標(biāo)準(zhǔn)溶液進行計算。
[0136]本發(fā)明方法使用根據(jù)本發(fā)明之識別HPV L2蛋白質(zhì)中共同抗原決定部位之單克隆抗體，及意欲根據(jù)結(jié)合于該HPV抗原之抗體量，測定樣品之抗體效價。因此，本發(fā)明方法可測定對抗HPV之識別該共同抗原決定部位之交叉中和抗體之抗體效價。
[0137]其細(xì)節(jié)如下。
[0138]于使用方法A時，為了分析測試樣品中識別類型共同抗原決定部位之抗體，乃使固定量之抗原與系列稀釋之樣品接觸，以建立樣品中抗體與抗原之結(jié)合，隨后添加足量之本發(fā)明單克隆抗體，以測定結(jié)合于抗原之本發(fā)明單克隆抗體量。于此情形下，足量之本發(fā)明單克隆抗體意指單克隆抗體之量等于或大于可結(jié)合于存在反應(yīng)系中抗原決定部位之單克隆抗體總量；其可從用于該分析之HPV抗原量及抗體效價測定。添加于步驟(a)反應(yīng)系之本發(fā)明單克隆抗體系與剩余的之抗原決定部位接觸及結(jié)合。本文所用之“剩余的抗原決定部位” 一詞意指未與樣品中之抗體分子結(jié)合之HPV抗原決定部位，或從存在反應(yīng)系中之所有抗原決定部位中排除結(jié)合于樣品中之抗體分子之抗原決定部位后，剩余的之HPV抗原決定部位。本發(fā)明之單克隆抗體可結(jié)合于所接觸抗原決定部位中其可識別之抗原決定部位。結(jié)合于抗原之本發(fā)明單克隆抗體，可為結(jié)合于步驟(a)測試樣品中未結(jié)合抗體分子之抗原分子者，或可為經(jīng)由與樣品中之抗體分子置換而結(jié)合于抗原分子者。結(jié)合于抗原之本發(fā)明單克隆抗體之量舉例而言，可利用使識別該單克隆抗體之標(biāo)記第二抗體與單克隆抗體接觸(例如，與剩余的抗原決定部位接觸之單克隆抗體)，及測定由該標(biāo)記第二抗體產(chǎn)生之信號強度予以測定。此方法指示足以占據(jù)抗原決定部位(亦即結(jié)合于反應(yīng)系中全部抗原決定部位)之樣品最大稀釋。例如，可比較測試樣品存在與否間之信號強度，從而測定測試樣品中可能之交叉中和抗體之抗體效價。測試樣品不存在下之信號強度可利用以能作為負(fù)對照組之樣品(例如，水、緩沖液、血液)置換步驟(a)之測試樣品進行測定。
[0139]于使用方法B時，為了分析測試樣品中識別類型共同抗原決定部位之抗體，乃使系列稀釋之樣品各自與固定量之本發(fā)明抗體混合，接著使各混合物與固定量抗原反應(yīng)，以形成抗體/抗原復(fù)合物，隨后測定結(jié)合于抗原之本發(fā)明單克隆抗體量。例如，結(jié)合于抗原之本發(fā)明單克隆抗體之量可利用使本發(fā)明單克隆抗體與抗原間形成之抗體/抗原復(fù)合物與識別該單克隆抗體之標(biāo)記第二抗體接觸，并測定由該標(biāo)記第二抗體產(chǎn)生之信號強度予以測定。此方法指示經(jīng)由競爭結(jié)合抑制本發(fā)明單克隆抗體結(jié)合作用(根據(jù)對抑制先行測定之參考值)之樣品最大稀釋。例如，可比較測試樣品存在與否間或添加測試樣品前后間之信號強度，從而測定測試樣品中可能之交叉中和抗體之抗體效價。測試樣品不存在下之信號強度可利用以能作為負(fù)對照組之樣品(例如，水、緩沖液、血液)置換步驟(a)之測試樣品進行測定。
[0140]本文所用之“抗體效價” 一詞意指抗體對其抗原之結(jié)合強度指數(shù)或樣品中之抗體量指數(shù)。于本發(fā)明方法中，抗體效價可呈稀釋因子予以測定。先行測定本發(fā)明單克隆抗體結(jié)合量之參考點，當(dāng)樣品之稀釋因子達(dá)到此參考點時，可視其為樣品中所含抗體之抗體效價。例如，于方法A之情形下，反應(yīng)系中結(jié)合所有抗原決定部位所需之樣品稀釋因子，亦即，樣品不再顯示本發(fā)明單克隆抗體結(jié)合量之任何減少時之稀釋因子，可決定為樣品中所含抗體之抗體效價。同樣地，于方法B之情形下，本發(fā)明單克隆抗體之結(jié)合抑制所需之樣品稀釋因子，亦即，樣品不再顯示本發(fā)明單克隆抗體結(jié)合量之任何增加時之稀釋因子，可決定為樣品中所含抗體之抗體效價。
[0141]較高稀釋因子表示較高之抗體效價，而較低稀釋因子表示較低之抗體效價。
[0142]于上述方法A中，“接觸” 一詞意指測試樣品或本發(fā)明單克隆抗體與測試樣品之混合物，與HPV抗原一起置于彼 等于特定條件下可反應(yīng)之環(huán)境中，更具體而言，意指測試樣品中之抗體或本發(fā)明單克隆抗體，與HPV抗原一起置于特定條件下該等抗體或單克隆抗體結(jié)合于HPV抗原之環(huán)境中?！敖佑|” 一詞涵蓋測試樣品之混合或與HPV抗原之混合物、HPV抗原與測試樣品之混合或混合物、HPV抗原固定化固體支撐物與測試樣品之共存或混合物、將測試樣品或混合物注射入固體支撐物中等。在測試樣品、或單克隆抗體或其混合物與HPV抗原間接觸后，測試樣品中之抗體或本發(fā)明單克隆抗體即結(jié)合于HPV抗原。
[0143](i)測試樣品之制備
[0144]較佳之測試樣品為人類全血或血清等。如下文所述，全血可視需要于制備為ELISA/RIA之測試樣品或西方印跡法(western blotting)之測試樣品前,高速離心以移除不溶性物質(zhì)。
[0145]作為ELISA/RIA之測試樣品用時，舉例而言，收集之血清可直接或以緩沖液適當(dāng)稀釋后使用。作為西方印跡法(電泳)之測試樣品用時，舉例而言，血清可直接或以緩沖液適當(dāng)稀釋后使用。于圓點/狹縫印跡法情形下，測試樣品可以如上述之相同方法制備。
[0146](ii)將HPV抗原固定于固相上
[0147]欲特異性地檢測如此獲得之測試樣品中之交叉中和抗體，可利用免疫沉淀法、配體結(jié)合技術(shù)或類似方法使HPV抗原沉淀，然后不被固定于固相上而供檢測，或替代地，HPV抗原可固定于固體支撐物上(固相)，然后供檢測。關(guān)于將蛋白質(zhì)固定于固相上，西方印跡法、圓點印跡法或狹縫印跡法中所用之膜包括硝化纖維素膜(例如，BioRad Laboratories產(chǎn)品)、尼龍膜[例如，Hybond-ECL(Amersham Pharmacia)]、棉膜[例如 Blot AbsorbentFilter (BioRad Laboratories)]或聚偏氟乙烯(PVDF)膜(例如 BioRad Laboratories 產(chǎn)品)等°
[0148]用以自電泳凝膠移轉(zhuǎn)抗原蛋白質(zhì)至薄膜之所謂印跡技術(shù)包括濕式印跡(J.E.Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Margulies, E.M.Shevach, ff.Strober 之CURRENTPR0T0C0LS IN IMMUNOLOGY volume2ed)，以及半干式印跡[參見CURRENTPROTOCOLSIN IMMUNOLOGY volume2 (文獻同上)]。用于圓點印跡或狹縫印跡之儀器亦為市售可得[例如 Bio-Dot(BioRad Laboratories)]。
[0149]另一方面，關(guān)于根據(jù)ELISA/RIA之檢測或定量，系將HPV抗原或其稀釋物[例如以含有0.05%迭氮化鈉之磷酸鹽緩沖鹽液(下文中稱為“PBS”)稀釋者]分配至特別設(shè)計之96孔板[例如Immunoplate Maxisorp (Nunc)]中，然后令其于4°C至室溫靜置隔夜或于37° C靜置I至3小時，從而使HPV抗原經(jīng)由吸附于孔底表面而被固定于固相上。
[0150](4)測定交叉中和抗體之抗體效價
[0151]于此用于測定抗體效價之技術(shù)包括各種已知技術(shù)，例如放射性免疫測定法(下文稱為“RIA”)、固相酶免疫測定法(下文稱為“ELISA”)、螢光抗體技術(shù)、被動血球凝集等，就檢測靈敏度、快速、精確度、可自動化操作等而言，以ELISA為更佳。
[0152]舉例而言，根據(jù)ELISA，本發(fā)明之抗體效價測定可利用下述程序完成。首先，將純化或部分純化之HPV抗原吸附于例如ELISA用之96孔板固相表面上，然后于足夠形成抗體/抗原復(fù)合物之條件下，與經(jīng)系列稀釋之測試樣品(例如人類血清)中之交叉中和抗體接觸一段時間。洗滌后，以根據(jù)本發(fā)明之鼠類單克隆抗體作為第一抗體接觸，本發(fā)明單克隆抗體即結(jié)合于仍未與抗體結(jié)合之剩余的抗原決定部位。接著，添加酶標(biāo)記之抗小鼠抗體作為第二抗體，使其結(jié)合于鼠類單克隆抗體。洗滌后，添加酶基質(zhì)，測定由于基質(zhì)降解之生色所誘發(fā)之吸光度變化，從而計算抗體效價。
[0153]除上述程序外，測試樣品在用于測定之前，可與根據(jù)本發(fā)明之鼠類單克隆抗體混合，作為第一抗體用。
[0154]各測試樣品系列稀釋(例如，二或多個步驟，較佳為三或多個步驟之稀釋)所得吸光度數(shù)據(jù)，可利用平行線分析用以定量各血清之交叉中和抗體效價。關(guān)于平行線分析，可使用含本發(fā)明單克隆抗體之標(biāo)準(zhǔn)溶液[參見實施例3 (測試方法3)]。
[0155]用于本發(fā)明方法中之HPV抗原可為于大腸桿菌細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)之全部或部分HPV L2蛋白質(zhì)、由HPVLl及L2蛋白質(zhì)組成之殼體、假病毒、或具有部分L2蛋白質(zhì)序列之合成肽。
[0156]用于本發(fā)明方法之單克隆抗體可為13B、24B、或13B及24B之混合物。替代地，用于本發(fā)明方法之單克隆抗體為根據(jù)本發(fā)明之單克隆抗體；較佳為識別HPV L2蛋白質(zhì)中共同抗原決定部位之單克隆抗體；更佳為包含SEQ ID NO: 11 (CDRHl)、SEQ ID NO:12 (CDRH2)、SEQ ID NO:13(CDRH3)、SEQ ID NO: 14 (CDRLl)、SEQ ID N0:15(CDRL2)與 SEQ ID NO:16(CDRL3)所示氨基酸序列之單克隆抗體，或包含SEQ ID NO: 17 (CDRHl)、SEQ ID NO:18 (CDRH2)、SEQ ID NO:19(CDRH3)、SEQ ID NO:20 (CDRLl)、SEQ ID NO:21 (CDRL2)與 SEQID NO:22(⑶RL3)所示氨基酸序列之單克隆抗體；又更佳為其重鏈可變區(qū)系SEQ ID NO:7所示氨基酸序列及其輕鏈可變區(qū)系SEQ ID NO:8所示氨基酸序列之單克隆抗體，或其重鏈可變區(qū)系SEQ ID NO:9所示氨基酸序列及其輕鏈可變區(qū)系SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列之單克隆抗體；或尚又更佳為由雜交瘤細(xì)胞株FERM BP-11304或FERM BP-11305所產(chǎn)生之單克隆抗體。
[0157]如上述，本發(fā)明單克隆抗體基于其特異性而可用于交叉中和抗體之檢測或分析。
[0158]⑴檢測
[0159]為了用于檢測，本發(fā)明單克隆抗體可直接標(biāo)記或與特異地識別該抗體(識別與用以制備單克隆抗體相同動物來源之抗體)之標(biāo)記第二抗體合作，作為第一抗體用。
[0160]較佳之標(biāo)記類型，包括但不限于酶(堿性磷酸酶或辣根過氧化酶)或生物素(惟酶標(biāo)記鏈霉抗生物素蛋白進一步結(jié)合于第二抗體上之生物素)。有關(guān)使用標(biāo)記第二抗體(或標(biāo)記鏈霉抗生物素蛋白)技術(shù)，預(yù)先標(biāo)記抗體(或鏈霉抗生物素蛋白)之各種產(chǎn)品為市售可得。于RIA情形下，系使用例如I125放射性同位素標(biāo)記之抗體，及利用液體閃爍計數(shù)器或類似儀器完成分析。
[0161]利用檢測彼等酶標(biāo)記之活性，測定交叉中和抗體之量(效價)。于堿性磷酸酶或辣根過氧化酶時，經(jīng)由彼等酶之催化作用而引起生色或光發(fā)射之基質(zhì)為市售可得。于本發(fā)明中，使用以辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記之酶較佳。
[0162]于使用生色基質(zhì)時，西方印跡法或圓點/狹縫印跡法可憑目視檢測。于ELISA中，較佳為利用市售可得之微量板計讀器測定各孔吸光度予以定量(測定波長隨基質(zhì)而不同)。
[0163]另一方面，于使用光發(fā)射基質(zhì)時，利用于X光片或影像板上之自動放射攝影術(shù)，或利用拍立得相機之照相術(shù)，可藉由西方印跡法或圓點/狹縫印跡法進行檢測；亦可利用密度檢測法或以 Molecular Imager Fx 系統(tǒng)(BioRad Laboratories)定量等。于 ELISA 中使用光發(fā)射基質(zhì)時，系以發(fā)射微量板計讀器(例如BioRad Laboratories產(chǎn)品)測定酶活性。
[0164](ii)測定操作
[0165]I)西方印跡法、圓點印跡法或狹縫印跡法
[0166]首先，為了避免單克隆抗體分子之非特異性吸附，使薄膜于含有此類非特異性吸附之抑制劑(例如，脫脂牛乳、酪蛋白、牛血清白蛋白、明膠、聚乙烯吡咯啶酮)之緩沖液中預(yù)浸潰(封阻)一段特定時間。封阻液系由例如5%脫脂牛乳與0.05%至0.l%Tween20之磷酸緩沖鹽液(PBS)或tris-緩沖鹽液(TBS)組成。脫脂牛乳可用Block Ace (DainipponPharmaceutical C0., Ltd., Japan)、1% 至 10% 牛血清白蛋白、0.5% 至 3% 明膠或 1% 聚乙烯吡咯啶酮等代替。封阻時間為于4°C 16至24小時或于室溫I至3小時。
[0167]接著，以含有0.05%至0.l%Tween20之PBS或TBS (下文中亦稱為“洗滌液”)洗滌該薄膜以移除多余的封阻液，然后于以封阻液適當(dāng)稀釋之測試樣品或本發(fā)明單克隆抗體之溶液中浸潰一段特定時間，從而使測試樣品中之交叉中和抗體或單克隆抗體結(jié)合于薄膜上之抗原分子，以形成抗體/抗原復(fù)合物?？衫梦鞣接≯E法預(yù)備實驗決定用于樣品或單克隆抗體之稀釋因子。此抗體反應(yīng)操作較佳為于室溫進行2小時。完成抗體反應(yīng)操作后，以洗滌液洗滌薄膜；然后于上述形成之抗體/抗原復(fù)合物中，添加適當(dāng)稀釋之單克隆抗體或測試樣品及使其結(jié)合。 若使用有標(biāo)記單克隆抗體，則可立即進行檢測。若使用無標(biāo)記單克隆抗體，則使該復(fù)合物進一步進行第二抗體反應(yīng)。于使用市售可得產(chǎn)品作為標(biāo)記第二抗體時，使用前以封阻液稀釋2000倍至20000倍(根據(jù)隨附說明書，若于其中找到較佳稀釋因子)。洗滌去除第一抗體后，于室溫使該薄膜浸潰于第二抗體溶液中45分鐘至I小時，并以洗滌液洗滌，隨后以適于所用標(biāo)記方法之方式檢測。洗滌操作舉例而言可如下完成:首先于洗滌液中振蕩該薄膜15分鐘，置換新鮮洗滌液后繼續(xù)振蕩5分鐘，然后以新鮮洗滌液置換后再振蕩5分鐘，若需要，則于洗滌操作期間可繼續(xù)置換洗滌液。
[0168]2) ELISA/RIA
[0169]首先，為了避免單克隆抗體分子非特異性地吸附于HPV抗原固定板孔底表面，使用之前與西方印跡法同樣地封阻該板，封阻條件如西方印跡法中所述。
[0170]接著，以含有0.05%至0.l%Tween20之PBS或TBS (下文中亦稱為“洗滌液”)洗滌各孔以移除多余的封阻液，然后將以洗滌液適當(dāng)稀釋之測試樣品溶液分配至諸孔中，隨后培育一段特定時間以容許樣品中之交叉中和抗體與抗原分子結(jié)合。用于樣品之稀釋因子舉例而言，可利用ELISA預(yù)備實驗決定。此抗體反應(yīng)操作較佳為于室溫進行約I小時。完成抗體反應(yīng)操作后，以洗滌液洗滌各孔。接著，將適當(dāng)稀釋之本發(fā)明單克隆抗體溶液分配至各孔中，經(jīng)由培育一段特定時間使其與抗原分子結(jié)合。若使用有標(biāo)記單克隆抗體，則可立即進行檢測。若使用無標(biāo)記單克隆抗體，則使該板進一步進行第二抗體反應(yīng)。于使用市售可得產(chǎn)品作為標(biāo)記第二抗體時，使用前以封阻液稀釋2000倍至20000倍(根據(jù)隨附說明書，若于其中找到較佳稀釋因子)。洗滌去除第一抗體后，將第二抗體溶液分配至各孔中，并于室溫培育I至3小時。以洗滌液洗滌各孔，隨后以適于所用標(biāo)記方法之方式檢測。洗滌操作舉例而言可如下完成:首先將洗滌液分配至各孔中，并使板振蕩5分鐘，置換新鮮洗滌液后繼續(xù)振蕩5分鐘，然后以新鮮洗滌液置換后再振蕩5分鐘，若需要，洗滌操作期間可繼續(xù)置換洗滌液。
[0171] 應(yīng)注意的是測試樣品與本發(fā)明單克隆抗體可適當(dāng)?shù)匾韵喾错樞蚴褂谩?br> [0172]本發(fā)明亦提供測定測試樣品中抗HPV交叉中和抗體存在或抗體效價之試劑盒，或測定抗HPV交叉中和抗體抗體效價之試劑盒。更具體而言，此類試劑盒包含(a)固定于固體支撐物之HPV抗原，(b)本發(fā)明之單克隆抗體，及(c)識別本發(fā)明單克隆抗體之標(biāo)記第二抗體。此類試劑盒可進一步包含測定所需之試劑、緩沖液、水、容器、使用說明書等。
[0173](5)包含本發(fā)明單克隆抗體之醫(yī)藥品
[0174]本發(fā)明單克隆抗體可作為醫(yī)藥品用，例如HPV之預(yù)防或治療劑，亦即，HPV感染或HPV感染所誘發(fā)疾病之預(yù)防或治療劑。欲作為醫(yī)藥品用，該單克隆抗體必須可與需要治療或預(yù)防此類疾病之人類或動物物種相容。
[0175]HPV感染所誘發(fā)疾病包括子宮頸癌、尖形濕疣、疣、及其他疾病。包含本發(fā)明單克隆抗體之HPV預(yù)防或治療劑較佳為子宮頸癌之預(yù)防或治療劑。
[0176]于一較佳具體實例中，作為醫(yī)藥品用之本發(fā)明單克隆抗體，于施用人類時，具有減低的風(fēng)險抗原性。更具體而言，其為一種完全人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體例如小鼠-人類嵌合抗體，特佳為完全人類抗體。人源化及嵌合抗體可藉由基因工程方式，根據(jù)下文后述程序制備。完全人類抗體可利用人類-人類(或小鼠)雜交瘤產(chǎn)生，惟彼等理想地系利用人類抗體產(chǎn)生動物(例如小鼠)或如下文后述之噬菌體表達(dá)技術(shù)產(chǎn)生，使藉由穩(wěn)定方式及較低成本提供大量抗體。
[0177](i)嵌合抗體之制備
[0178]本文所用之〃嵌合抗體〃 一詞意指其H鏈與L鏈可變區(qū)(Vh與\)序列衍生自一種哺乳類物種，而恒定區(qū)(Ch與CJ序列則衍生自另一種哺乳類物種之抗體。該可變區(qū)序列較佳為衍生自可容易地自其制備雜交瘤之動物物種(例如小鼠)，而該恒定區(qū)序列較佳為衍生自欲施用目標(biāo)之哺乳類物種。 [0179]嵌合抗體之制備技術(shù)包括例如于美國專利案N0.6，331，415所記載之方法或自其部分修改之方法。更具體而言，首先利用例行方式，以如上述所得產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體之雜交瘤(例如，小鼠-小鼠雜交瘤)制備mRNA或總RNA，然后用以合成cDNA。使用cDNA作為模板，以例行方式用適當(dāng)引物[例如，以包含Vh或' N端序列之編碼核苷酸序列之寡DNA作為意義引物，及以可與N端序列之編碼核苷酸序列雜交之寡DNA為反義引物(參見，例如Bio/Technology，9 =88-89, 1991)]進行PCR，從而放大及純化編碼Vh與Vl之DNA。以相同方式，使用以另一哺乳動物(例如人類)淋巴細(xì)胞或類似物制備之RNA作為模板，以RT-PCR放大及純化編碼Ch與(^之DNA，再以例行方式將Vh與\分別連接于Ch與Q，所得嵌合H鏈DNA與嵌合L鏈DNA各自插入適當(dāng)表達(dá)載體[例如，于CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞等中之包含具轉(zhuǎn)錄活性之啟動子(例如CMV啟動子、SV40啟動子)之載體]中。編碼此二鏈之DNA可插入分離之載體，或可串聯(lián)插入單一載體中。所得嵌合H鏈與嵌合L鏈表達(dá)載體用以轉(zhuǎn)形至宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞之實例包括動物細(xì)胞，例如上文提及之小鼠骨髓瘤細(xì)胞，以及中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、衍生自猴子之C0S-7與非洲綠猴腎細(xì)胞、衍生自大鼠之GHS細(xì)胞等?？山逵扇魏芜m用于動物細(xì)胞之方式完成轉(zhuǎn)形，較佳為利用電穿孔或類似方法。于適于宿主細(xì)胞之培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段特定時間后,收集培養(yǎng)物上清液，以如上述之相同方法純化以分離嵌合之單克隆抗體分子。替代地，當(dāng)使用已建立之基因轉(zhuǎn)殖技術(shù)及大規(guī)模養(yǎng)殖家畜(家禽)技術(shù)已累積之動物(例如，母牛、山羊、雞)之生殖細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，以例行方式產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)殖動物時，則從所得動物之乳液或蛋可容易且大量地得到嵌合單克隆抗體。再者，使用已建立之基因轉(zhuǎn)殖技術(shù)及已被大規(guī)模栽培作為主要作物之植物細(xì)胞(例如，玉米、米、小麥、黃豆或煙草細(xì)胞)作為宿主細(xì)胞以產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)殖植物，例如利用顯微注射或電穿孔至原生質(zhì)粒中或利用粒子槍或Ti載體轉(zhuǎn)形至完整細(xì)胞，從而可自所得種子或樹葉獲得大量嵌合單克隆抗體。
[0180]所得嵌合單克隆抗體以木瓜酶水解得到Fab，以胃蛋白酶水解得到F(ab’)2。
[0181]替代地，編碼小鼠Vh與'之各DNA可經(jīng)由適當(dāng)連接子{例如，編碼由I至40個氨基酸，較佳為3至30個氨基酸，更佳為5至20個氨基酸組成肽(例如，[Ser-(Gly)m]n或[(Gly)m-Ser]η (其中m為O至10之整數(shù)，η為I至5之整數(shù)))之DNA}粘接以產(chǎn)生scFv。此外，編碼Ch3之DNA可進一步經(jīng)由適當(dāng)連接子黏接以產(chǎn)生微型抗體單體，或替代地，編碼全長CH2DNA可進一步經(jīng)由適當(dāng)連接子黏接，以產(chǎn)生scFv-Fc。編碼以基因工程方式修飾(接合)之此等抗體分子之各DNA，置于適當(dāng)啟動子控制下時，能于微生物(例如，大腸桿菌、酵母)中表達(dá)，因而得以大規(guī)模產(chǎn)生抗體分子。
[0182]編碼小鼠Vh與'之各DNA串聯(lián)插入單一啟動子下游，然后引入大腸桿菌細(xì)胞中時，經(jīng)由單編碼區(qū)之基因表達(dá)形成稱為Fv之二聚體。同樣地，利用分子模擬，乂11與'架構(gòu)區(qū)(FRs)中之適當(dāng)氨基酸各自被Cys置換時，于此二鏈間，經(jīng)由分子間之雙硫鍵連接形成稱為dsFv之二聚體。
[0183](ii)人源化抗體
[0184]本文所用之“人源化抗體”一詞意指除了存在可變區(qū)中之各互補決定區(qū)(⑶Rs)外，所有區(qū)域(亦即，恒定區(qū)及可變區(qū)中之各FR)之序列系源自人類，而僅CDR序列系衍生自其他哺乳類物種之抗體。較佳之其他哺乳類物種包括例如可容易地由其制備雜交瘤之動物物種(例如小鼠)?！巴耆祟惪贵w”一詞意指包括各CDR之重鏈與輕鏈二者之所有序列實質(zhì)上系衍生自人類基因之抗體。
[0185]人源化抗體之制備技術(shù)包括，例如于美國專利案Nos.5，225，539、5，585，089、5，693，761與5，693，762所記載之方法或自其部分修改之方法。更具體而言，如同上述嵌合抗體之情況，分離編碼衍生自非人類哺乳類物種(例如，小鼠)之VH與VL之各DNA，然后以例行方式用自動DNA定序儀(例如，Applied Biosystems產(chǎn)品)定序。對照已知抗體序列之資料庫[例如Kabat資料庫(參見Kabat et al., “Sequences of Proteinsof Immunological Interest，，，US Department of Health and Human Services, PublicHealth Service, edited by NIH, 5th edition, 1991)],分析比對所得核苷酸序列或自其推論之氨基酸序列，以決定重鏈及輕鏈中之各CDR與各FR。設(shè)計核苷酸序列，使其FR序列類似于已決定FR序列的人類抗體之L鏈與H鏈[例如，人類K型L鏈亞群I及人類H鏈亞群II或III (SMKabat et al.，1991 (文獻同上))]之編碼核苷酸序列中之⑶R編碼區(qū)，以已決定異源⑶R之編碼核苷酸序列置換。將彼等核苷酸序列分割成約20至40個堿基之片段，互補于彼等核苷酸序列之序列亦分割成約20至40個堿基之片段，使與上述片段交替重迭。彼等片段各自以DNA合成儀合成，其可藉由例行方式進行雜交及黏接，以建構(gòu)編碼具有人類來源之各FR及衍生自另一哺乳類物種之各⑶R之Vh與' 之各DNA。就更迅速及有效地移植衍生自另一哺乳類物種之各CDR至人類來源之Vh與\而言，欲達(dá)此目的較佳者為利用PCR之定點突變。此類技術(shù)之實例包括見述于JP5-227970A等之序列性⑶R移植。如此得到之編碼Vh與\之各DNA可藉由如上述嵌合抗體之相同方式，分別粘接于編碼人類來源之Ch與Q之各DNA，然后將其引入適當(dāng)宿主細(xì)胞中，從而獲得產(chǎn)生人源化抗體之細(xì)胞或基因轉(zhuǎn)殖動物/植物。
[0186]如同嵌合抗體之情況，人源化抗體亦可利用基因工程程序轉(zhuǎn)變?yōu)閟cFv、scFv-Fc、微型抗體、dsFv、Fv等，及于使用適當(dāng)啟動子時，可于微生物(例如，大腸桿菌、酵母)中產(chǎn)生。
[0187]人源化抗體之制備技術(shù)亦可調(diào)整，舉例而言，以制備較佳為可施用雜交瘤制備技術(shù)尚未建立之其他動物物種[其實例為廣被養(yǎng)殖之家畜(家禽)，包括乳牛、豬、綿羊、山羊與雞，以及包括狗與貓之寵物動物]之單克隆抗體。
[0188](iii)使用產(chǎn)生人類抗體之動物制備完全人類抗體
[0189]于剔除(KO)內(nèi)源免疫球蛋白(Ig)基因之非人類溫血動物中，引入功能性人類Ig基因。以抗原免疫處理時，該動物將產(chǎn)生人類抗體而非自己之抗體。因此，使用雜交瘤制備技術(shù)已建立之動物(例如，小鼠)時，以習(xí)知用于制備小鼠單克隆抗體之相同方式，即可能獲得完全人類單克隆抗體。首先，將使用標(biāo)準(zhǔn)基因轉(zhuǎn)殖(Tg)技術(shù)之以人類IgH及L鏈微型基因轉(zhuǎn)形之小鼠，與使用標(biāo)準(zhǔn)KO技術(shù)使其內(nèi)源小鼠Ig基因不活化之小鼠交配，以獲得產(chǎn)生人類抗體之小鼠(參見Immunol.Today, 17:391-397, 1996)。由彼等小鼠產(chǎn)生之若干人類單克隆抗體已在進行臨床試驗，惟關(guān)于抗人類Ig人類抗體(HAHA)之產(chǎn)生則仍未見報導(dǎo)。
[0190]之后，AbgenixInc.[商品名:XenoMouose(參見例如 Nat.Genet.，15:146-156，1997 ;美國專利案 N0.5，939，598)]及 Medarex Inc.[商品名:Hu_Mab 小鼠(參見例如Nat.Biotechnol.，14:845-851, 1996 ;美國專利案N0.5，545，806)]利用酵母人工染色體(YAC)載體，產(chǎn)生攜帶較大人類Ig基因之Tg小鼠。此類小鼠得以產(chǎn)生更廣譜之人類抗體。然而，人類Ig基因由于抗原結(jié)合部位系由例如以約80類型V片段、約30類型D片段與約6類型J片段之各種組合建構(gòu)之VDJ外顯子(H鏈)編碼而達(dá)成其多樣性?；诖艘?，H鏈(染色體14)之全長達(dá)到約1.5Mb、K L鏈(染色體2)約2Mb及λ L鏈(染色體22)約1Mb。為了于其他動物物種中復(fù)制與人類同樣廣泛多樣性之抗體譜，一般期盼引入各Ig基因之全長序列。然而,可插入習(xí)知基因轉(zhuǎn)殖載體(例如,質(zhì)粒、粘接質(zhì)粒、BAC、YAC)之DNA通常為數(shù)kb至數(shù)百kb長，因此利用涉及注射選殖DNA至受精卵中之習(xí)知基因轉(zhuǎn)殖動物制備技術(shù)，難以引入全長序列。
[0191]Tomizuka 等(Nat.Genet., 16:133-143, 1997)將攜帶 Ig 基因之原態(tài)人類染色體片段(hCF)引入小鼠[轉(zhuǎn)殖染色體(TC)小鼠]中，以產(chǎn)生具有全長人類Ig基因之小鼠。亦即，首先，用紡錘體形成抑制劑(例如，乙酰甲基秋水仙素)處理具有人類染色體(其中包括H鏈基因之染色體14及包括K L鏈基因之染色體2各自以例如藥劑抗性之標(biāo)記物標(biāo)記)之人類-小鼠雜交細(xì)胞約48小時，以制備含有封于核膜內(nèi)之一個至數(shù)個染色體或其片段之微細(xì)胞，隨后利用微核融合，將染色體引入小鼠ES細(xì)胞中。以含藥之培養(yǎng)基挑選攜帶具有人類Ig基因之染色體或其片段之雜種ES細(xì)胞，并以通常用于制備KO小鼠之相同方式，將其顯微注射入小鼠胚胎中。分析所得嵌合小鼠之毛色圖案等以挑選生殖細(xì)胞嵌合體，從而建立攜帶人類染色體14片段(TC(hCF14))之TC小鼠品系及攜帶人類染色體2片段(TC(hCF2))之TC小鼠品系。以例行方式產(chǎn)生內(nèi)源H鏈及KL鏈基因被剔除之小鼠(分別為KO(IgH)及KO(IgK)),重復(fù)交配此四品系以建立具有全部四類型基因突變之小鼠品系(雙重 TC/K0)。
。[0192]以如常見用于制備小鼠單克隆抗體之相同方式處理如上述產(chǎn)生之雙重TC/K0小鼠時，即可制備產(chǎn)生抗原特異性人類單克隆抗體之雜交瘤。然而，由于包括KL鏈基因之hCF2于小鼠細(xì)胞中不穩(wěn)定，因此此類小鼠比正常小鼠得到雜交瘤之效率低而較為不利。
[0193]另一方面，上述Hu-Mab小鼠包含約50%之κ L鏈基因，惟具有雙重可變區(qū)簇之結(jié)構(gòu)。因此，彼等顯現(xiàn)與于具全長基因小鼠中觀察到之相同K鏈多樣性(另一方面，Hu-Mab小鼠由于僅包含約10%之H鏈基因，因此顯現(xiàn)低H鏈多樣性及對抗原之反應(yīng)不足)。此外，由于K L鏈基因經(jīng)由YAC載體(IgK-YAC)插入小鼠染色體中，所以穩(wěn)定維持于彼等小鼠之細(xì)胞中?；诒说葍?yōu)點，乃使TC(hCF14)與Hu-Mab小鼠交配以產(chǎn)生穩(wěn)定攜帶hCF14與IgK-YAC之小鼠(商品名:KM小鼠)，其能達(dá)成與正常小鼠相同之雜交瘤產(chǎn)生效率及對抗原之相同抗體親合力。
[0194]再者，為了更全面復(fù)制與人類相同之多樣性抗體譜，可能產(chǎn)生進一步修飾以具有λ L鏈基因之產(chǎn)生人類抗體之動物。此類動物可如上述相同方式，利用產(chǎn)生經(jīng)修飾以具有攜帶XL鏈基因之人類染色體22或其片段(TC(hCF22))之TC小鼠，然后使此小鼠與上述雙重TC/K0小鼠或KM小鼠交配；或替代地，可利用建構(gòu)包括例如H鏈與λ L鏈基因座之人類人工染色體(HAC)，然后將HAC引入小鼠細(xì)胞中而獲得(Nat.Biotechnol.，18:1086-1090, 2000)。
[0195](iv)使用噬菌體顯現(xiàn)人類抗體庫之完全人類抗體之制備
[0196]另一制備完全人類抗體之方法系根據(jù)噬菌體顯現(xiàn)技術(shù)。于此方法中，PCR誘發(fā)之突變有時可能被引入⑶R以外之區(qū)域內(nèi)，因此于臨床試驗中，有少數(shù)HAHA產(chǎn)生之報導(dǎo)。另一方面，此方法之優(yōu)點在于無宿主動物產(chǎn)生之跨物種病毒感染之風(fēng)險，及抗體特異性不受限制(抗禁忌殖株、糖鏈等之抗體亦可容易制備)等。
[0197]噬菌體顯現(xiàn)人類抗體庫之制備技術(shù)包括但不限于下文所述。
[0198]雖然任何噬菌體均可使用，惟通常優(yōu)先使用絲狀噬菌體(Ff噬菌體)。欲于噬菌體表面顯現(xiàn)外來蛋白質(zhì)，舉例而言，可利用該外來蛋白質(zhì)與任何外套蛋白質(zhì)(g3p及g6p至g9p)融合(常與g3p或g8p之N末端融合)后表達(dá)及顯現(xiàn)。噬菌體顯現(xiàn)載體之實例包括:I)供引入融合于噬菌體基因體內(nèi)之外套蛋白質(zhì)基因狀態(tài)之外來基因，從而呈與外來蛋白質(zhì)之融合蛋白質(zhì)，于噬菌體表面顯現(xiàn)全部外套蛋白質(zhì)者；以及2)供插入與野生型外套蛋白質(zhì)基因分開之融合蛋白質(zhì)編碼基因，從而同時表達(dá)融合蛋白質(zhì)與野生型外套蛋白質(zhì)者；及3)經(jīng)設(shè)計使以具有野生型外套蛋白質(zhì)基因之輔助噬菌體，感染具有攜帶融合蛋白質(zhì)編碼基因之噬菌質(zhì)粒載體之大腸桿菌細(xì)胞，以產(chǎn)生同時表達(dá)融合蛋白質(zhì)及野生型外套蛋白質(zhì)之噬菌體顆粒者。然而，由于融合大的外來蛋白質(zhì)時，I)型噬菌體顯現(xiàn)載體失去其感染能力，因此使用2)或3)型噬菌體顯現(xiàn)載體制備抗體庫。
[0199]特定載體之實例，可提出見述于Holt等(Curr.0pin.Biotechnol., 11:445-449，2000)者;例如，pCESl (參見 J.Biol.Chem.，274:18218-18230, 1999)為于單一乳糖啟動子控制下，包含g3p訊息肽K L鏈恒定區(qū)下游之編碼DNA及g3p訊息肽Ch3下游之編碼DNA、His-標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、琥珀終止密碼子(TAG)、隨后為g3p編碼序列之表達(dá)Fab之噬菌質(zhì)粒載體。于引入具有琥珀突變之大腸桿菌細(xì)胞中時，此載體于g3p外套蛋白質(zhì)上顯現(xiàn)Fab，而于HB2151或無琥珀突變之其他菌株中表達(dá)時，則產(chǎn)生可溶性Fab抗體。至于表達(dá)scFv之噬菌質(zhì)粒載體，舉例而言，可使用pHENl(J.Mol.Biol.,222:581-597，1991)或類似物。
[0200]另一方面，輔助噬菌體之實例包括Μ13-Κ07、VCSMl3等。
[0201]噬菌體顯現(xiàn)載體之其他實例包括經(jīng)設(shè)計使包括半胱氨酸密碼子之編碼序列黏接于抗體基因之各3’ -末端及外套蛋白質(zhì)基因之5’ -末端，以同時獨立地表達(dá)彼等二基因(不為融合蛋白質(zhì))，因此抗體可經(jīng)由所引入半胱氨酸殘基間之S-S鍵結(jié)，顯現(xiàn)于噬菌體表面之外套蛋白質(zhì)上者(CysDisplay? technique, Morphosys)。
[0202]人類抗體庫可為任何類型，包括天然/非免疫抗體庫、合成抗體庫、免疫抗體庫
坐寸ο
[0203]天然/非免疫抗體庫系如下獲得之抗體庫:利用RT-PCR得到正常人類擁有之Vh與 '基因，然后隨機轉(zhuǎn)殖至如上述之噬菌體顯現(xiàn)載體。通常，使用衍生自得自正常人類周邊血液、骨髓、扁桃腺或類似物中之淋巴細(xì)胞之mRNA作為模板。欲避免例如病例史之V基因偏差，僅放大衍生自無因抗原致敏誘發(fā)類型轉(zhuǎn)換之IgM之mRNA，如此制備之抗體庫特稱為天然抗體庫；典型的實例包括CAT Inc.之抗體庫(參見J.Mol.Biol.，222 =581-597, 1991 ；Nat.Biotechnol., 14:309-314, 1996) > MRC Inc.之抗體庫(參見 Annu.Rev.1mmunol., 12:433-455, 1994)、Dyax Inc.之抗體庫(參見 J.Biol.Chem.，1999 (文獻同上)；Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 14:7969-7974, 2000)等。
[0204]合成抗體庫系如下獲得:挑選人類B細(xì)胞中之功能特異性抗體基因，以適當(dāng)大小之隨機氨基酸序列之編碼DNA置換其V基因片段中之抗原結(jié)合區(qū)(例如，CDR3)，以建構(gòu)抗體庫。由于從開始就可用產(chǎn)生功能性scFv與Fab之Vh與 '基因之組合物建構(gòu)抗體庫，因而此類合成抗體庫被認(rèn)為于抗體表達(dá)效率及穩(wěn)定性上極為優(yōu)異；典型的實例包括MorphosysInc.之 HuCAL 抗體庫(參見 J.Mol.Biol.，296:57-86, 2000)、BioInvent Inc.之抗體庫(參見 Nat.Biotechnol., 18:852, 2000)、Crucell Inc.之抗體庫(參見 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 92:3938, 1995 ；J.1mmunol.Methods, 272:219-233, 2003)等。
[0205]免疫抗體庫系如下獲得:以如上述天然/非免疫抗體庫之相同方式，從取自對抗血液中標(biāo)靶抗原具增加抗體效價之人類(例如癌癥病患、自體免疫疾病、感染等及接受疫苗接種之實驗對象)之淋巴細(xì)胞，或從如上述利用活體外免疫，以標(biāo)靶抗原人工免疫之人類淋巴細(xì)胞制備mRNAs，及利用RT-PCR技術(shù)放大Vh與' 基因，以建構(gòu)抗體庫。該抗體庫于開始時即含有所需抗體基因，因此可能從相當(dāng)小尺寸之抗體庫中獲得所需抗體。
[0206]雖然抗體庫具更廣泛多樣性更佳，惟按照下述淘選(panning)操作中能操縱之噬菌體數(shù)(1011至IO13個噬菌體)，及通常淘選中分離及擴增所需噬菌體數(shù)(100至1，000個噬菌體/殖株)，約IO8至IO11個殖株即適合實際用途。約IO8個殖株之抗體庫通常得以篩選Kd值為10_9級數(shù)之抗體。
[0207]利用噬菌體顯現(xiàn)技術(shù)篩選對抗標(biāo)靶抗原之抗體之程序稱為淘選。更具體而言，例如，將抗原固定化之載體與噬菌體庫互相接觸，洗掉未結(jié)合之噬菌體，然后從載體釋出結(jié)合之噬菌體，感染至大腸桿菌細(xì)胞中以增殖彼等噬菌體。此系列操作重復(fù)約3至5次，以增加顯現(xiàn)抗原特異性抗體之噬菌體。用于抗原固定化之載體實例包括一般用于抗原抗體反應(yīng)或親和層析法之各種載體，例如不溶性多醣(例如，洋菜糖、聚葡萄醣、纖維素)、合成樹脂(例如，聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚硅氧)、微量板、試管、薄膜、管柱及由玻璃、金屬等制成之珠粒，以及表面電漿子共 振(SPR)之感測晶片等?？乖潭ɑ衫靡话阌靡圆蝗芑蚬潭ɑ鞍踪|(zhì)或酶等之物理吸附或化學(xué)鍵結(jié)法達(dá)成。舉例而言，優(yōu)先使用生物素_(鏈霉)抗生物素蛋白系統(tǒng)或類似物。若作為標(biāo)靶抗原用之內(nèi)源配體系如肽之小分子，則應(yīng)特別留意以防止作為抗原決定基用之區(qū)域因與該載體接合而被掩蓋。關(guān)于洗滌未結(jié)合噬菌體，可連續(xù)使用封阻液例如BSA溶液(一或二次)及含表面活性劑(例如，Tween)之PBS (3至5次)。亦有報告指出，較佳為使用檸檬酸鹽緩沖液(PH5)或類似物。欲釋出特異性噬菌體，通常使用酸(例如，0.1M鹽酸)，雖然亦可能利用以特異蛋白酶切割(例如，可將胰蛋白酶切割部位之編碼基因序列引入至抗體基因與外套蛋白質(zhì)基因間之接合處；于此情形下，由于野生型外套蛋白質(zhì)顯現(xiàn)于釋出噬菌體之表面，即使外套蛋白質(zhì)全系顯融合蛋白質(zhì)表達(dá)，該噬菌體可感染也可于大腸桿菌細(xì)胞中增殖)、以可溶性抗原競爭性釋出、或還原S-S鍵(例如，于上述CysDisplay?中，淘選后使用適當(dāng)還原劑，將抗體分子從外套蛋白質(zhì)解離，從而可收集抗原特異性噬菌體)釋出噬菌體。以酸釋出時，使用Tris等中和釋出之噬菌體，然后感染大腸桿菌細(xì)胞；培養(yǎng)后，以例行方式收集噬菌體。
[0208]一旦經(jīng)由淘選增加顯現(xiàn)抗原特異性抗體之噬菌體后，使彼等噬菌體感染入大腸桿菌細(xì)胞中，然后接種于培養(yǎng)板上進行轉(zhuǎn)殖。再收集噬菌體，利用上述抗體效價測定技術(shù)(例如，ELISA、RIA、FIA)或利用根據(jù)FACS或SPR之技術(shù)，確定其抗原結(jié)合活性。
[0209]欲從挑選之顯現(xiàn)抗原特異性抗體之噬菌體殖株單離及純化抗體分子，舉例而言，若所用噬菌體顯現(xiàn)載體為攜帶于抗體基因及外套蛋白質(zhì)基因間接合處引入之琥珀終止密碼子之載體，則當(dāng)該噬菌體感染不具琥珀突變之大腸桿菌(例如，HB2151株)時，即產(chǎn)生可溶性抗體分子并分泌至周質(zhì)或培養(yǎng)基中；因此以溶菌酶溶解細(xì)胞壁收集細(xì)胞外級分，然后以上述相同方法予以純化。當(dāng)載體已經(jīng)修飾成為攜帶His-標(biāo)簽或c-myc標(biāo)簽時，則使用IMAC或抗c-myc抗體管柱即可容易地純化抗體分子。替代地，若于淘選時使用特定蛋白酶切割，則以此蛋白酶處理后，可將抗體分子從噬菌體表面分離，使利用進行相同純化操作即可純化所需抗體分子。
[0210]使用產(chǎn)生人類抗體之動物及噬菌體顯現(xiàn)人類抗體庫之制備完全人類抗體之技術(shù)亦可調(diào)整以制備其他動物物種之單克隆抗體，其實例為被廣泛養(yǎng)殖為家畜(家禽)之動物，包括乳牛、豬、綿羊、山羊與雞，以及包括狗與貓之寵物動物。于非人類動物中使用免疫抗體庫更為實際，因存在較少有關(guān)以標(biāo)靶抗原人工免疫處理之倫理問題。
[0211]包含本發(fā)明單克隆抗體之預(yù)防及/或治療劑具低毒性，且可為溶液或為任何適當(dāng)劑量型之醫(yī)藥組成物，利用非經(jīng)腸或經(jīng)口路徑直接施用人類或哺乳動物(例如，大鼠、兔、綿羊、豬、乳牛、貓、狗、猴)。
[0212]本發(fā)明單克隆抗體可單獨或以適當(dāng)醫(yī)藥組成物施用。用于施用之此等醫(yī)藥組成物可包含本發(fā)明單克隆抗體或其鹽，及藥理學(xué)上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。此等醫(yī)藥組成物系以適于經(jīng)口或非經(jīng)腸施用之任何劑量型提供。
[0213]供非經(jīng)腸施用時，舉例而言，系使用例如注射劑及栓劑等組成物，注射劑可涵蓋例如靜脈內(nèi)注射劑、皮下注射劑、皮內(nèi)注射劑、肌內(nèi)注射劑、點滴輸液等劑量型。
[0214]此類注射劑可以已知方法制備。制備注射劑時，舉例而言，可使上述本發(fā)明單克隆抗體或其鹽于注射常用之無菌水性或油性基質(zhì)溶液中溶解、懸浮或乳化。供此目的之注射用水溶液之實例包括生理食鹽液、含葡萄糖及其他輔助劑之等張溶液等，其可與適當(dāng)增溶劑如醇類(例如，乙醇)、多醇類(例如，聚丙二醇、聚乙二醇)、非離子性表面活性劑[例如，聚山梨糖醇酯80、HC0-50(氫化蓖麻油之聚氧乙烯(50mol)加合物)]等組合使用。供此目的之油性基質(zhì)溶液之實例包括芝麻油、黃豆油等，其可與增溶劑例如芐酸芐酯、芐醇等組合使用。所制備之注射液較佳為裝于適當(dāng)安瓿中。供直腸內(nèi)施用用之栓劑可使上述單克隆抗體或其鹽與通常用于栓劑之基底混合而制備。
[0215]經(jīng)口施用用組成物包括固體或液體劑量型，更具體而言為錠劑(包括糖衣錠劑與膜衣錠劑)、丸劑、粒劑、粉劑、膠囊(包括軟膠囊)、糖漿、乳劑、懸浮劑等。此類組成物可以已知方法制備及可包含一般用于調(diào)配劑領(lǐng)域之載劑、稀釋劑或賦形劑。用于錠劑之載劑及賦形劑之實例包括乳糖、淀粉、蔗糖、與硬脂酸鎂。
[0216]彼等非經(jīng)腸或經(jīng)口醫(yī)藥組成物系有利地調(diào)配為適合活性成分劑量之單位劑量型。此等單位劑量型之實例包括錠劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、與栓劑。單克隆抗體含量通常為約每單位劑量型5至500mg。特別是，上述單克隆抗體含量以于注射劑中約5至IOOmg及于其他劑量型中約10至250mg為較佳。
[0217]應(yīng)注意的是，上述各組成物可包含其他活性成分，只要彼等與上述單克隆抗體組合時不引起有害之相互作用即可。
[0218]含本發(fā)明單克隆抗體 之預(yù)防、治療或診斷劑(醫(yī)藥品)之劑量將取決于施用目標(biāo)、欲治療或診斷之疾病、癥狀、施用路徑等。舉例而言，用于治療成人子宮頸癌時，本發(fā)明單克隆抗體系有利地以通常約0.01至20mg/kg體重,較佳為約0.1至10mg/kg體重,更佳為約0.1至5mg/kg體重之單一劑量，每天約一至五次，較佳為約一至三次，經(jīng)由靜脈內(nèi)路徑施用。用于非經(jīng)腸施用之其他情形(例如，皮下施用)及經(jīng)口施用時，可施用相同劑量。若癥狀特別嚴(yán)重，則可視癥狀而增加劑量。[0219]本發(fā)明醫(yī)藥品可以試劑盒形式提供。此類試劑盒可包含本發(fā)明醫(yī)藥品，以及附加活性成分、附加醫(yī)藥品、使用說明書、容器等。(6)包含本發(fā)明單克隆抗體之診斷HPV感染用試劑
[0220]本發(fā)明單克隆抗體可作為診斷HPV感染用試劑。欲使用本發(fā)明單克隆抗體檢測HPV感染，舉例而言，首先使樣品(例如，刮取之子宮頸細(xì)胞樣品)中之蛋白質(zhì)固定于多孔板(例如，96孔或384孔板)孔底表面或于膜上，然后供使用本發(fā)明單克隆抗體檢測樣品中之HPV用。于彼等技術(shù)中，使用多孔板(例如，96孔或384孔板)者通常稱為固相酶免疫測定法(ELISA)或放射性免疫測定法(RIA)。另一方面，以固定于膜上為基礎(chǔ)之技術(shù)包括，于聚丙烯酰胺電泳(西方印跡法)后，使樣品中之蛋白質(zhì)移轉(zhuǎn)至膜者，或使樣品或其稀釋物直接浸潰于膜中者，亦即，所謂圓點印跡或狹縫印跡法。
實施例
[0221]茲經(jīng)由下文實施例進一步更具細(xì)節(jié)地說明本發(fā)明，彼等實施例僅供詳細(xì)敘述本發(fā)明具體實例之說明用途，而不擬于任何意識上限制本發(fā)明或其說明用具體實例之范圍及意義。同樣地，本發(fā)明范圍亦不受限于本文敘述之特定具體實例。除了本說明書中之?dāng)⑹鐾?，針對本發(fā)明之各種修飾，本領(lǐng)域技術(shù)人員從說明書、權(quán)利要求及附圖將明顯可見。
[0222]本文所引用的所有參考文獻，包括專利、專利申請及期刊論文，其全部內(nèi)容均并入本文以資參考。
[0223]1.制備識別人類乳突病毒第16型(HPV16)L2蛋白質(zhì)的單克隆抗體
[0224]使人工合成肽[HPV16L2蛋白質(zhì)的氨基酸56至75:P56/75(SEQ ID NO:1)]與鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)經(jīng)由半胱氨酸接合，以制備抗原(KLH-P56/75)。將此抗原(50 μ g/動物)與弗氏完全佐劑(FCA) —起，皮內(nèi)接種于三只Balb/c小鼠中。在2、4及6周后，以相同方式追加小鼠免疫處理。第一次免疫處理7周后，使ΚΙ?-Ρ56/75(25μ8/動物)與FCA一起靜脈內(nèi)注射。最后一次免疫處理6天后，收集小鼠脾臟細(xì)胞，以6:1的比率與P3U1骨髓瘤細(xì)胞混合，隨后使用50%聚乙二醇(PEG)進行細(xì)胞融合。于補充次黃嘌呤、氨基喋呤(aminopterin)與胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)中挑選融合細(xì)胞，并繁殖該細(xì)胞。使用HPV16L1/L2-殼體作為抗原，以ELISA篩選分泌抗HPV16L2抗體的細(xì)胞株。結(jié)果，獲得分別產(chǎn)生單克隆抗體13B及24B的兩株細(xì)胞株。該產(chǎn)生抗體13B的細(xì)胞及產(chǎn)生抗體24B的細(xì)胞分別稱為“小鼠-小鼠雜交瘤13B”及“小鼠-小鼠雜交瘤24B”，由本申請案的 申請人:依布達(dá)佩斯條約于2010年10月15日國際保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(Central6, Ι-1-lHigashi，Tsukuba, Ibaraki, Japan zip code:305-8566),國際保藏號分別為FERM BP-11304及FERM BP-11305。彼等13B-及24B-產(chǎn)生細(xì)胞各自經(jīng)腹膜內(nèi)接種入5只Balb/c小鼠中，以制備富含各自的單克隆抗體的小鼠腹水樣品。
[0225]2.單克隆抗體13B及24B的抗原決定部位圖譜定位(mapping)
[0226]于ELISA中，使用包含自N或C端有數(shù)個氨基酸刪除或數(shù)個氨基酸的丙氨酸置換的P56/75的突變肽作為抗原(與KLH接合)，利用分析彼等與其氨基酸被丙氨酸部分置換的P56/75突變肽的結(jié)合，決定各單克隆抗體結(jié)合的必須氨基酸(圖2雙下劃線處)，及與各單克隆抗體結(jié)合的有關(guān)氨 基酸(圖2下劃線處)，從而預(yù)測單克隆抗體13B及24B的抗原決定部位。所用抗原肽及ELISA結(jié)果示于圖1。彼等結(jié)果顯示，13B及24B識別的區(qū)域分別涵蓋HPV16L2蛋白質(zhì)的氨基酸67至72及56至58。
[0227]以此方式預(yù)測的單克隆抗體13B及24B于P56/75中的抗原決定部位與高危險型HPV間的保守氨基酸序列區(qū)一起表示于圖2。
[0228]同樣地，以如上述的相同方法，使用包含自N或C端有數(shù)個氨基酸刪除或數(shù)個氨基酸端丙氨酸取代的P56/75的其他變異肽作為抗原(與BSA接合)，以決定各單克隆抗體的抗原決定部位。所用抗原肽及ELISA結(jié)果表于圖8。
[0229]討論結(jié)果，認(rèn)為13B識別的抗原決定部位系位于HPV16L2蛋白質(zhì)中的氨基酸64至73區(qū)域，而24B識別的抗原決定部位系位于HPV16L2蛋白質(zhì)中的氨基酸58至67區(qū)域(圖9下劃線處)。
[0230]圖9顯示以此方式預(yù)測的單克隆抗體13B及24B于P56/75中的抗原決定部位與高危險型HPV間的保守氨基酸序列區(qū)。
[0231]3.測定交叉中和抗體效價的方法
[0232]分析抗體13B及24B的對抗HPV假病毒感染的交叉抑制能力及其對HPV L1/L2-殼體的交叉結(jié)合能力。從測定其干擾抗體13B或24B與HPV16L2抗原結(jié)合的能力，推論測試血清中的交叉中和抗體效價。
[0233](測試方法I)測定單克隆抗體對抗HPV16、18、31、33、35、51、52與58假病毒(PsV)的中和活性
[0234](I)使HPV16或HPV58L1及L2表達(dá)質(zhì)粒與分泌性堿性磷酸酶(SEAP)表達(dá)質(zhì)?；旌希瑢⑵滢D(zhuǎn)染入293FT細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染2天后，使細(xì)胞懸浮于清潔劑緩沖液[0.35%Brij58Uu IRNase (Ambion#2286)的 D-PBS 溶液(0.9mM CaCl2UOmM MgCl2)]，于 37°C培養(yǎng)隔夜。令其于冰上靜置5分鐘后，于4°C，10, OOOg,使細(xì)胞離心10分鐘，收集上清液。將收集的上清液覆蓋于27%、33%、39%碘克沙醇(以0.8M NaCl的PBS溶液制備)上，于16°C，以50，OOOrpm超離心3.5小時。超離心后，收集含HPV16或HPV58假病毒(PsV)的級分，供進行中和實驗用。
[0235]使以酚紅無細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋的PsV與含有抗體腹水(13B、24B或其混合物)混合，于4V反應(yīng)I小時，然后感染已培養(yǎng)于96孔板中的293FT細(xì)胞。3天后，收集40 μ I培養(yǎng)上清液，使其與20 μ 10.05%CHAPS溶液及200 μ I基質(zhì)溶液[添加I錠4-硝基苯磷酸二鈉鹽六水合物(Sigma N9389)至20ml含9.5M 二乙醇胺、ImM MgCl2與0.5mM ZnCl2的溶液中]混合。生色后，測定450nm的吸光度。針對與各抗體混合時的PsV感染度及與小鼠血清(免疫前，1:50稀釋)混合時的PsV感染度(負(fù)對照組)進行比較。
[0236](結(jié)果)
[0237]發(fā)現(xiàn)13B及24B均具有對抗HPV16與HPV58假病毒的中和活性，抗體13B與24B的混合物比單獨抗體13B或24B顯現(xiàn)更強的中和活性(圖3)。
[0238](2)再者，除了 HPV16與HPV58的外，亦以如上文(I)所示相同方法，分析抗體13B及24B對抗HPV18、31、33、35、51與52假病毒的中和活性。于此分析中，使用抗FLAG單克隆抗體M2 (50 μ g/ml)作為負(fù)對照組，從小鼠腹水純化的單克隆抗體(50yg/ml)作為抗體13B及24B。使抗體溶液(抗FLAG抗體M2、13B、24B或13B與24B的混合物)與PsV懸浮液混合以產(chǎn)生25 μ g/mL的抗體濃度。此外，針對與各抗體混合時的PsV感染度及與負(fù)對照組(抗FLAG抗體M2)混合時的PsV感染度進行比較，隨后利用t_試驗測定各抗體中和活性存在與否。[0239](結(jié)果)
[0240]發(fā)現(xiàn)13B 中和 HPV16、18、31、33、51 與 58，而 24B 中和 HPV16、18、31、33、35、51、52與58。亦即，于所測試的假病毒中，13B中和除了 HPV35與HPV52外所有類型的假病毒；24B中和經(jīng)測試的所有類型假病毒。再者，抗體13B與24B的混合物比單獨者顯現(xiàn)更強的中和活性(圖10)。
[0241](測試方法2)測定單克隆抗體對高危險型L1/L2-殼體的結(jié)合活性(I)將各類型HPV的LI及L2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293FT細(xì)胞中。以如用于PsV的相同方法進行從轉(zhuǎn)染細(xì)胞的L1/L2-殼體的抽出與純化(參見測試方法I)。
[0242]于96孔ELISA培養(yǎng)板的各孔中，添加容量50 μ I的以PBS稀釋的L1/L2-殼體(0.5 μ g/ml)，令其于4°C靜置隔夜。室溫下，以封阻液(含有5%脫脂牛乳與0.l%Tween20的PBS)封阻2小時以制備抗原固定化培養(yǎng)板。
[0243]含各單克隆抗體的腹水以封阻液進行1:100的稀釋，令其與固定于ELISA培養(yǎng)板的L1/L2-殼體反應(yīng)。以PBST洗滌后，于各孔添加已以封阻液進行1:2000稀釋的辣根過氧化酶(HRP)-標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(Santa Cruz:sc-2031)，于室溫反應(yīng)I小時。以PBST洗滌后，于各孔添加基質(zhì)溶液(2mg/ml鄰苯二胺與0.0065%過氧化氫水溶液的0.1M檸檬酸三鈉溶液，PH4.8)，于室溫反應(yīng)。生色后，測定450nm的吸光度。
[0244](結(jié)果)
[0245]如ELISA的分析，13B及24B分別結(jié)合于第16、31、33、51與58型的L1/L2-殼體及第16、31、33、35、51、52與58型的L1/L2-殼體。亦即，13B結(jié)合于除了第35與52型外的所有測試抗原；24B結(jié)合于所有測試抗原。
[0246]21A(于實例I雜交瘤挑選時結(jié)合于具涵蓋HPV16型L2蛋白質(zhì)的氨基酸56至75序列的肽，惟對HPV16假病毒無中和活性的抗體)與測試抗原均未結(jié)合(圖4)。
[0247](2)再者，除了上述測試的16、31、33、35、51、52與58型L1/L2-殼體外，亦以如上文(I)所示的相同方法，分析13B及24B與18型L1/L2-殼體的結(jié)合。同樣地，制備僅由LI構(gòu)成的殼體，以如上文(I)所示相同方法，分析各抗體與此殼體的結(jié)合。自小鼠腹水純化的各單克隆抗體，使用前以封阻液稀釋至250ng/孔。
[0248](結(jié)果)
[0249]13B及24B亦結(jié)合于第18型L1/L2-殼體。亦即，13B結(jié)合于除了第35與52型外的所有測試抗原；24B結(jié)合于所有測試抗原。此外，無抗體結(jié)合于僅由LI構(gòu)成的殼體，表示彼等抗體系特異性地結(jié)合于各類型的L2蛋白質(zhì)(圖11)。
[0250](測試方法3)測定血清中交叉中和抗體效價
[0251 ] 以HPV16L1-及L2-表達(dá)的桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞(Sf9)，制備作為抗原的HPV16L1/L2-殼體。病毒感染3天后，使細(xì)胞懸浮于含有0.5%NP-40的PBS中，以分離其細(xì)胞核。使細(xì)胞核懸浮于含有氯化銫(1.28g/ml)的PBS中，以超聲波處理使其均質(zhì)化。均質(zhì)物于20°C，以34，OOOrpm離心20小時，以收集含L1/L2-殼體的級分。于含有0.5M氯化鈉的PBS中透析該級分隔夜。于超離心管中，從頂部依序覆蓋含5%及60%蔗糖的PBS溶液，于其上進一步覆蓋經(jīng)透析的級分，隨后于4°C，以31，OOOrpm離心2小時。使含有L1/L2-殼體的級分于含0.5M氯化鈉的PBS中透析隔夜，及作為抗原用。[0252]于96孔ELISA培養(yǎng)板的各孔添加容量50 μ I的以PBS稀釋的HPV16L1/L2-殼體(5 μ g/ml)，令其于4°C靜置隔夜。室溫下，以含有5%脫脂牛乳的PBST (含有0.l%Tween-20的PBS)封阻培養(yǎng)板2小時，以制備抗原固定化的培養(yǎng)板。[0253]各自添加以1/10至1/6250，5倍增量系列稀釋的封阻液制備的系列稀釋的測試血清，例如兔子抗P56/75血清及對照組血清，至抗原固定化培養(yǎng)板的孔中，于室溫反應(yīng)2小時。所用測試血清系以KLH-P53/69 [經(jīng)由半胱氨酸與KLH接合的具P53/69氨基酸序列(SEQ ID NO:23)的肽]、KLH-P56/75、KLH_P18/38 (W02009/001867)或 16L1-430 (56/75)嵌
合殼體(W02009/001867)免疫處理的兔血清。所用KLH為“丨川.丨C'CW) mcKLH(于PBS緩沖液中)”(Thermo Scientific Pierce)。以PBST洗滌后，使培養(yǎng)板與分別以封阻液進行1:100000及1:3000稀釋的13B及24B的小鼠腹水于室溫反應(yīng)2小時。以PBST洗滌后，添加以封阻液進行1:2000稀釋的辣根過氧化酶(HRP)-標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(Santa Cruz:sc-2031)至各孔，于室溫反應(yīng)I小時。以PBST洗滌后，添加基質(zhì)溶液(2mg/ml鄰苯二胺與0.0065%過氧化氫水溶液的0.1M檸檬酸三鈉溶液，pH4.8)，于室溫反應(yīng)。生色后，測定450nm的吸光度。利用平行線分析，使用各測試血清于1/50、1/250與1/1250稀釋所得吸光度數(shù)據(jù)，定量各血清的交叉中和抗體效價。
[0254](結(jié)果)
[0255]發(fā)現(xiàn)以KLH-P56/75及16L1-430 (56/75)嵌合殼體免疫處理的兔血清含有抑制單克隆抗體13B結(jié)合的抗體；以KLH-P53/69、KLH-P56/75及16L1-430 (56/75)免疫處理的兔血清含有抑制單克隆抗體24B結(jié)合的抗體；作為負(fù)對照組所用的以KLH-P18/38免疫處理的兔血清不含抑制彼等單克隆抗體結(jié)合的抗體(第5及6圖)。
[0256]根據(jù)圖6ELISA的結(jié)果，定量抗體效價。以經(jīng)KLH-P56/75免疫處理的兔血清作為標(biāo)準(zhǔn)血清，利用平行線分析，從1/50、1/250及1/1250稀釋所獲得的OD值，定量各兔血清的交叉中和抗體效價。所得結(jié)果表示于下文表中。
[0257][表 I]
[0258]表1:利用平行線定量法對交叉中和抗體效價進行定量
[0259]抑制13B結(jié)合的抗體的抗體效價
[0260]
【權(quán)利要求】
1.一種單克隆抗體，其識別人類乳突病毒L2蛋白質(zhì)的共同抗原決定部位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中，人類乳突病毒L2蛋白質(zhì)的共同抗原決定部位由 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:24 或 SEQ ID NO:25 所示的氨基酸序列組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中，人類乳突病毒L2蛋白質(zhì)的共同抗原決定部位由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其包含SEQID NO:11(⑶RHl)、SEQ ID NO:12(CDRH2)、SEQ ID NO:13(CDRH3)、SEQ ID NO:14 (CDRLl)、SEQ ID NO:15(CDRL2)及 SEQID N0:16(CDRL3)所示的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其包含SEQID NO:17(⑶RHl)、SEQ ID NO:18 (CDRH2)、SEQ ID NO:19(CDRH3)、SEQ ID NO:20 (CDRLl)、SEQ ID NO:21 (CDRL2)及 SEQID NO:22(Q)RL3)所不的氣基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)是SEQID NO:7所示的氨基酸序列，而其輕鏈可變區(qū)是SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)是SEQID NO:9所示的氨基酸序列，而其輕鏈可變區(qū)是SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的單克隆抗體，其識別人類乳突病毒L2蛋白質(zhì)，且由保藏號FERM BP-11304的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的單克隆抗體，其識別人類乳突病毒L2蛋白質(zhì)，且由保藏號FERM BP-11305的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。
10.一種測定人類乳突病毒(HPV)的交叉中和抗體的抗體效價的方法，該方法包括下述步驟: (a)使測試樣品與HPV抗原接觸，使該樣品中的抗體與該抗原結(jié)合的步驟；及 (b)添加根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體至步驟(a)的反應(yīng)體系中，測定結(jié)合于該抗原的該單克隆抗體的量的步驟。
11.一種測定人類乳突病毒(HPV)的交叉中和抗體的抗體效價的方法，該方法包括下述步驟: (a)使測試樣品與HPV抗原接觸，使該樣品中的抗體與該抗原結(jié)合的步驟；及 (b)使步驟(a)中未與抗體結(jié)合的剩余的抗原決定部位與權(quán)利要求1所述的單克隆抗體接觸，測定結(jié)合于該抗原決定部位的該單克隆抗體的量。
12.—種測定人類乳突病毒(HPV)的交叉中和抗體的抗體效價的方法，該方法包括下述步驟: (a)使權(quán)利要求1所述的單克隆抗體與測試樣品混合后，與HPV抗原接觸，形成抗體/抗原復(fù)合物 '及 (b)測定步驟(a)所得抗體/抗原復(fù)合物中的、形成了抗體/抗原復(fù)合物的該單克隆抗體的量。
13.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其中，使結(jié)合于抗原的該單克隆抗體或與該抗原決定部位接觸并結(jié)合的單克隆抗體，與識別該單克隆抗體的標(biāo)記第二抗體接觸，通過在測試樣品存在及不存在下測定由該標(biāo)記第二抗體產(chǎn)生的信號的強度，測定該測試樣品中能夠存在的交叉中和抗體的抗體效價。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，使步驟(a)中形成的單克隆抗體與抗原的復(fù)合物與識別該單克隆抗體的標(biāo)記第二抗體接觸，通過測試樣品存在及不存在下的由該標(biāo)記第二抗體產(chǎn)生的信號的強度，測定該測試樣品中能夠存在的交叉中和抗體的抗體效價。
15.根據(jù)權(quán)利要求10至14中任一項所述的方法，其中，該HPV抗原固定于固體支撐物。
16.一種用于測定測試樣品中HPV交叉中和抗體的存在的試劑盒，其包含(a)固定于固體支撐物的HPV抗原，(b)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，及(c)識別權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的標(biāo)記第二抗體。
17.—種HPV感染的診斷試劑，其包含權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
18.一種細(xì)胞株，其產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞株，其保藏號為FERMBP-11304或FERM BP-11305。
20.一種醫(yī)藥品，其包含權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
21.—種HPV治療劑，其包含權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
【文檔編號】C12N15/09GK103582651SQ201180063220
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月27日
【發(fā)明者】森清一郎, 神田忠仁 申請人:公益財團法人日本健康科學(xué)振興財團