用于鑒定誘使人皮膚致敏的試劑的分析方法和陣列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于鑒定能夠誘使人皮膚致敏的試劑的體外方法，以及用于該方法中的陣列和分析試劑盒。特別地，該方法包括測量暴露于測試試劑的MUTZ-3細胞中表3A和/或3B中所列生物標記的表達。
【專利說明】用于鑒定誘使人皮膚致敏的試劑的分析方法和陣列
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于鑒定能夠誘使人皮膚致敏的試劑的體外方法，以及用于該方法中的陣列和分析試劑盒。
[0002]背景
[0003]過敏性接觸性皮炎是影響很大一部分人群的炎性皮膚病。其通常是由針對化學半抗原的免疫應答引起的，給社會造成了相當大的經(jīng)濟負擔。目前用于致敏化學品的測試依賴于動物實驗。對例如藥物和化妝品工業(yè)內(nèi)化學品的注冊和使用的新法律已經(jīng)刺激了相當大的研究努力來研發(fā)可替換的用于致敏預測的基于人細胞的試驗。目的在于用呈現(xiàn)出更高預測力的體外測試替代動物實驗。
[0004]過敏性接觸性皮炎(ACD)是常見的炎性皮膚病，其特征在于濕疹和反復的瘙癢發(fā)作[I]。該疾病影響了相當大部分的人群，在歐洲有7.2%至18.6%的流行率[2，3]，并且由于重復暴露于致敏化學品，發(fā)病率日益增加。A⑶是IV型延遲型超敏性應答，主要在之前暴露的并且免疫上致敏的個體中與小的化學半抗原接觸的部位由反應性T輔助I(Thl)和干擾素(IFN) Y產(chǎn)生CD8+T細胞引起[4]。表皮中的樹突細胞(DC)通過應答結(jié)合自體-分子的半抗原和激活T細胞-介導的免疫性而啟動免疫反應。
[0005]REACH (Registration, Evaluation, and Authorisation of Chemicals (化學品的注冊、評估和和許可))條例要求歐盟內(nèi)的所有新的和現(xiàn)有的化學品，涉及大約30000種化學品，應當測試其危險作用[5]。因為潛在致敏劑的鑒定目前需要動物測試，REACH立法將對測試需要的動物數(shù)量產(chǎn)生巨大的影響。此外，Cosmetics Directive (化妝品規(guī)范)的第7次修改(76/768/EEC)提出了對`用于人使用的大部分化妝品成分的動物測試的禁令，在2009年生效，除了一些測試`到2013年生效。因此，用于測定化學品致敏能力的實驗動物的可靠體外替代方法的研發(fā)是迫切需要的。迄今為止，沒有非動物替代可用于鑒定皮膚致敏化學品，替代地，優(yōu)選的試驗是小鼠局部淋巴結(jié)試驗(LLNA) [6]，接著是豚鼠最大化測試(GPMT) [7]。這些動物模型的體外替代方法將優(yōu)選呈現(xiàn)出提高的可靠性、準確性，并且重要地，與人反應性相關(guān)。
[0006]通過在先天免疫和獲得性免疫之間架起重要的連接，樹突細胞(DC)在免疫應答中起著關(guān)鍵作用。在引發(fā)時，它們可以快速地產(chǎn)生大量介質(zhì)，其通過經(jīng)由抗原遞呈微調(diào)細胞應答，影響炎性部位的其他細胞的移動和活化，并且選擇性地應答各種病原體和環(huán)境因子。因此，研發(fā)和利用致敏劑刺激過程中DC的免疫判定可以用作預測致敏的有效測試策略。
[0007]然而，不同DC亞群的多層面表型和專門化的功能，及其廣泛且不足的分布，是一個復雜的因素，這阻礙了初級DC用作測試平臺。因此，對建立準確且可靠的，并且還繞過了與獲得DC的可變性和困難相關(guān)問題的體外試驗存在真實的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]因此，基于DC功能可預測性的試驗研發(fā)應當優(yōu)先依賴于體內(nèi)DC的可替換細胞類型或模擬物。為此，具有DC特征的細胞系將是有利的，因為其構(gòu)成穩(wěn)定的、可再生產(chǎn)的和無限的細胞供應。就DC模擬物而言，分化的骨髓單核細胞MUTZ-3細胞是目前為止優(yōu)選的候選物[8]。MUTZ-3作為CD34+DC祖代的無限來源，并且在細胞因子刺激時可以獲得與未成熟DC或朗格漢斯-樣DC相似的表型[9]，通過⑶Id、I和II類MHC遞呈抗原，并且誘使特異性T-細胞增殖[8]。用炎性介質(zhì)刺激時，MUTZ-3還呈現(xiàn)出成熟的轉(zhuǎn)錄和表型特征[10]。
[0009]本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)研發(fā)了一種用于預測皮膚致敏劑的新測試原理。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了使用DC祖細胞(如MUTZ-3細胞)可以準確地鑒定/預測皮膚致敏劑，而在過程中不需要進一步的分化，由此用一組致敏化學品、非致敏化學品和/或其他對照物(例如，只包含稀釋劑的載體對照，如DMSO和/或蒸餾水)刺激細胞。發(fā)現(xiàn)這很大程度上簡化和提高了程序的再現(xiàn)性。
[0010]用全基因組概括分析(genome-wide profiling)測定了對化學刺激的轉(zhuǎn)錄應答。從數(shù)據(jù)分析，鑒定了 200個轉(zhuǎn)錄物的生物標記信號，其完全分離了由致敏化學品相比于非致敏化學品和載體對照誘發(fā)的轉(zhuǎn)錄應答。此外，使用SVM和ROC曲線分析，說明了有效的信號預測力。生物標記信號包括相關(guān)生物途徑(如DC成熟和細胞因子應答)中涉及的轉(zhuǎn)錄物，其可以闡明致敏過程中涉及的分子相互作用。總之，已經(jīng)鑒定了具有有效預測力的生物標記信號，其表示用于鑒定人致敏化學品的體外試驗的令人信服的讀出結(jié)果。
[0011]因此，本發(fā)明的第一個方面提供了用于鑒定能夠誘使哺乳動物皮膚致敏的試劑的體外方法，該方法包括以下步驟或由以下步驟組成:
[0012]a)將樹突細胞群或樹突樣細胞群暴露于測試試劑；和
[0013]b)測量細胞中一種或多種選自表3中限定的生物標記的表達，
[0014]其中步驟(b)中測量的細胞中的一種或多種生物標記的表達表示了測試試劑的致敏作用。
[0015]“能夠誘使哺乳動物皮膚致敏的試劑”意思是能夠誘使和引發(fā)哺乳動物中IV型延遲型超敏反應的任何試劑。優(yōu)選，IV型延遲型超敏反應是DC-介導的。
[0016]在一個實施方案中，“能夠誘使哺乳動物皮膚致敏的試劑”是能夠在哺乳動物表皮接觸部位誘使和引發(fā)IV型延遲型超敏反應的試劑。
[0017]哺乳動物可以是任何馴養(yǎng)或農(nóng)場動物。優(yōu)選，哺乳動物是大鼠、小鼠、豚鼠、貓、狗、馬或靈長類動物。最優(yōu)選，哺乳動物是人。如以上所討論的，測定致敏的體內(nèi)方法是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選的方法是局部淋巴結(jié)試驗(對于詳細內(nèi)容，參見Basketter，D.A.等，Local lymph node assay-validation, conduct and use in practice.FoodChem Toxicol, 2002.40(5):p.593-8)。再一個合適的但不太優(yōu)選的方法是豚鼠最大化測試(對于詳細內(nèi)容，參見 Magnusson, B.和 A.M.Kligman, The identification of contactallergens by animal assay.The guinea pig maximization test.J Invest Dermatol，1969.52(3):p.268076)。
[0018]“樹突樣細胞”意思是呈現(xiàn)出樹突細胞特異性的功能和表型特征的非樹突細胞，所述特征如形態(tài)特征、共同刺激分子和II類MHC分子的表達，以及胞飲大分子和激活靜息T細胞的能力。
[0019]在一個實施方案中，樹突樣細胞是⑶34+樹突細胞祖先。任選，⑶34+樹突細胞祖先在細胞因子刺激時可以獲得通過⑶ld、I和II類MHC遞呈抗原的表型，誘使特異性T-細胞增殖和/或用炎性介質(zhì)刺激時呈現(xiàn)出成熟的轉(zhuǎn)錄和表型特征(即，與未成熟樹突細胞或朗格漢斯-樣樹突細胞相似的表型)。
[0020]可以通過功能、通過表型和/或通過基因表達模式，特別是通過細胞表面表型，來識別樹突細胞。這些細胞的特征在于其與眾不同的形態(tài)、高水平的表面II類MHC表達以及將抗原遞呈至⑶4+和/或⑶8+T細胞的能力，特別是遞呈至原始(na_i_vc) T細胞(Steinman等，(1991), Ann.Rev.1mmunol.9:271)。
[0021]樹突細胞的細胞表面是特殊的，具有特征性的面罩樣突出物，并且其特征在于細胞表面標記CDllc和II類MHC的表達。大部分DC對于其他白細胞世系的標記是陰性的，所述其他白細胞世系包括T細胞、B細胞、單核細胞/巨噬細胞和粒細胞。樹突細胞的亞群還可以表達其他標記，包括 33D1、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CDla-d、CD4、CD5、CD8 α、CD9、CDllb、CD24、CD40、CD48、CD54、CD58、CD80、CD83、CD86、CD91、CD117、CD123 (IL3Ra)、CD134、CD137、CD150、CD153、CD162、CXCR1、CXCR2、CXCR4、DCIR、DC-LAMP、DC-SIGN、DEC205、E-鈣粘蛋白、Langerin、甘露糖受體、MARCO、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9 和幾種凝集素。
[0022]這些細胞表面標記的表達模式可以隨著樹突細胞的成熟、組織來源和/或物種來源而改變。未成熟的樹突細胞表達低水平的II類MHC，但能夠內(nèi)吞抗原蛋白質(zhì)并將它們加工呈現(xiàn)為與II類MHC分子的復合物。激活的樹突細胞表達高水平的11類MHC、ICAM-1和CD86，并且能夠刺激原始異源T細胞的增殖，例如，在混合白細胞反應(MLR)中。
[0023]在功能上，通過用于測定抗原遞呈的任何方便的試驗來鑒定樹突細胞或樹突樣細胞。這樣的試驗包括測試通過測試抗原遞呈刺激抗原引發(fā)的和/或原始T細胞的能力，接著測定T細胞增殖，IL-2的釋放等等。
[0024]“表達”意思是基因產(chǎn)物(如，mRNA或蛋白質(zhì))的水平或含量。
[0025]檢測和/或測量蛋白質(zhì)和/或核酸濃度的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，參見，例如，Sambrook 和 Russ ell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press。
[0026]用于檢測和/或測量蛋白質(zhì)的優(yōu)選方法包括Western印跡、North-Western印跡、免疫吸附試驗(ELISA)、抗體微陣列、組織微陣列(TMA)、免疫沉淀、原位雜交和其他免疫組織化學技術(shù)、放射性免疫試驗(RIA)、免疫放射性測量試驗(IRMA)和免疫酶試驗(IEMA)，包括使用單克隆和/或多克隆抗體的夾層試驗。示例性夾層試驗由David等描述于US專利N0.4，376，110和4，486，530中，在此將其引入作為參考。如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，載波片上的細胞的抗體染色可以用于細胞學實驗診斷測試中公知的方法中。
[0027]通常，ELISA涉及使用產(chǎn)生有色反應產(chǎn)物的酶，通常在固相試驗中。如辣根過氧化物酶和磷酸酶這樣的酶已經(jīng)被廣泛使用。擴增磷酸酶反應的一種方法是使用NADP作為底物來產(chǎn)生NAD，其立刻作為用于第二個酶系統(tǒng)的輔酶。來自大腸桿菌(Escherichia coli)的焦磷酸酶提供了良好的綴合物，因為該酶不存在于組織中，是穩(wěn)定的，并且產(chǎn)生良好的反應顏色。也可以使用基于酶(如熒光素酶)的化學發(fā)光系統(tǒng)。
[0028]常常使用與維生素生物素的綴合，因為這可以容易地通過以高特異性和親和性與其結(jié)合的酶聯(lián)抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈霉素的反應而得到檢測。
[0029]用于檢測和/或測量核酸(例如,mRNA)的優(yōu)選方法包括southern印跡、northern印跡、聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)、定量實時PCR(qRT-PCR)、納陣列、微陣列、大陣列、放射自顯影法和原位雜交。[0030]在一個實施方案中，該方法包括將另一群樹突細胞或樹突樣細胞群暴露于不使人類皮膚致敏的陰性對照劑，并且測量細胞中步驟(b)中測量的一種或多種生物標記的表達。因此，步驟(b)中測量的一種或多種生物標記在細胞群中的表達不同于陰性對照樣品中的表達表示了事件中的測試試劑的致敏作用。
[0031]在一個實施方案中，陰性對照劑是與本發(fā)明的測試或?qū)φ談┮黄鹗褂玫娜軇?。因此，陰性對照可以是DMSO和/或蒸餾水。
[0032]在另一個實施方案中，將測試試劑暴露之前樹突細胞或樹突樣細胞中步驟(b)中測量的一種或多種生物標記的表達用作陰性對照。
[0033]再一個實施方案包括將另一群樹突細胞或樹突樣細胞群暴露于使人類皮膚致敏的陽性對照劑并且測量細胞中步驟(b)中測量的一種或多種生物標記的表達。因此，步驟(b)中測量的一種或多種生物標記在細胞群中的表達與陽性對照樣品中的表達相似或相同表示了事件中的測試 試劑的致敏作用。
[0034]優(yōu)選，該方法包括，在步驟(b)中，測量至少一種選自以下的生物標記的表達:
[0035]i)味覺受體，2型，成員5 (TAS2R5)，
[0036]ii)角化細胞生長因子樣蛋白1/2/假設蛋白FLJ20444(KGFLPl/2/FLJ20444)，
[0037]iii)跨膜前后轉(zhuǎn)化蛋白I (TAPTl)，
[0038]iv) sprouty 同系物 2 (SPRY2)，
[0039]V)脂肪酸合成酶(FASN)，
[0040]Vi) B-細胞 CLL/ 淋巴瘤 7A (BCL7A)，
[0041]vii)溶質(zhì)載體家族 25，成員 32(SLC25A32)，
[0042]viii)鐵蛋白，重多肽假基因I (FTHPl)，
[0043]ix) ATPase, H+ 運輸，溶酶體 50/57kDa，Vl 亞基 H(ATP6V1H)，
[0044]X)角鯊烯環(huán)氧酶(SQLE),和
[0045]xi)組蛋白簇 1，Hle(HISTlHlE)。
[0046]因此，在一個實施方案中，在步驟(b)中測量味覺受體，2型，成員5(TAS2R5)的表達。在進一步的實施方案中，在步驟(b)中，測量了角化細胞生長因子樣蛋白1/2/假設蛋白FLJ20444(KGFLP1/2/FLJ20444)的表達。該方法可以包括在步驟(b)中測量跨膜前后轉(zhuǎn)化蛋白I(TAPTl)的表達。在一個實施方案中，該方法包括在步驟(b)中測量sprouty同系物2(SPRY2)的表達。然而，再一個實施方案，方法包括在步驟(b)中測量脂肪酸合成酶(FASN)的表達。該方法可以包括在步驟(b)中測量B-細胞CLL/淋巴瘤7A(BCL7A)的表達。還可以包括在步驟(b)中測量溶質(zhì)載體家族25，成員32(SLC25A32)的表達。另外可以包括在步驟(b)中測量鐵蛋白，重多肽假基因I(FTHPl)的表達。再一個實施方案包括在步驟(b)中測量八了?&86，!1+運輸、溶酶體50/571^&，￥1亞基!1(4了?6￥1?)的表達。在另一個實施方案中，步驟(b)包括測量角鯊烯環(huán)氧酶(SQLE)的表達。再另一個實施方案中，在步驟(b)中測量了組蛋白簇1，Hle(HISTlHlE)的表達。
[0047]該方法可以包括在步驟(b)中測量至少2種來自表3A的生物標記的表達，或該方法可以由在步驟(b)中測量至少2種來自表3A的生物標記的表達組成，例如，至少3、4、5、
6、7、8、9、10或11種來自表3A的生物標記。在優(yōu)選的實施方案中，該方法包括在步驟(b)中測量脂肪酸合成酶(FASN)和角鯊烯環(huán)氧酶(SQLE)的表達，或該方法由在步驟(b)中測量脂肪酸合成酶(FASN)和角鯊烯環(huán)氧酶(SQLE)的表達組成。
[0048]該方法可以另外或替換地包括在步驟(b)中測量至少2種來自表3B的生物標記的表達，或該方法另外或替換地由在步驟(b)中測量至少2種來自表3B的生物標記的表達組成，例如，至少 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、
51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、
76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、I10、I11、I12、I13、I14、I15、I16、I17、I18、I19、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188，或至少 189 種來自表 3B 的生物標記。
[0049]因此，可以在步驟(b)中測量表3A中的全部生物標記和/或表3B中的全部生物標記的表達。
[0050]在優(yōu)選的實施方案中，步驟(b)包括測量編碼一種或多種生物標記的核酸分子的表達或步驟(b)由測量編碼一種或多種生物標記的核酸分子的表達組成。核酸分子可以是cDNA分子或mRNA分子。優(yōu)選，核酸分子是mRNA分子。
[0051]在一個實施方案中，使用選自Southern雜交、Northern雜交、聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)、定量實時PCR(qRT-PCR)、納陣列、微陣列、大陣列、放射自顯影法和原位雜交的方法進行步驟(b)中一種或多種生物標記的表達。優(yōu)選，使用DNA微陣列測量一種或多種生物標記的表達。
[0052]該方法可以包括使用一種或多種結(jié)合部分測量步驟(b)中一種或多種生物標記的表達，每個結(jié)合部分能夠選擇性地結(jié)合編碼表3中鑒定的生物標記之一的核酸分子。在一個實施方案中，一種或多種結(jié)合部分各自包含核酸分子或由核酸分子組成。在進一步的實施方案中，一種或多種結(jié)合部分各自包含DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA或ΡΜ0，或由DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA或PMO組成。在一個實施方案中，一種或多種結(jié)合部分各自包含DNA或由DNA組成。在一個實施方案中，一種或多種結(jié)合部分是5至100個核苷酸長。然而，在可替換的實施方案中，它們是15至35個核苷酸長。
[0053]如以下所討論的，可以基于結(jié)合給定的核酸、蛋白質(zhì)或氨基酸基序的能力，從文庫中選擇或篩選合適的結(jié)合劑(也稱為結(jié)合分子)。
[0054]在優(yōu)選的實施方案中，結(jié)合部分包含可檢測部分。
[0055]“可檢測部分”包括直接或間接允許檢測其存在和/或相對量和/或位置(例如，在陣列上的位置)的部分。
[0056]合適的可檢測部分是本領(lǐng)域公知的。
[0057]例如，可檢測部分可以是熒光和/或發(fā)光和/或化學發(fā)光部分，其暴露于特定條件時，可以檢測。這樣的熒光部分需要暴露于特定波長和強度的輻射(即，光)，以引起熒光部分的激發(fā)，由此使其發(fā)出可檢測到的可檢測特定波長熒光。
[0058]或者，可檢測部分可以是能夠?qū)?優(yōu)選不可檢測的)底物轉(zhuǎn)化成視覺和/或檢測可檢測產(chǎn)物的酶。合適的酶的實例將在以下關(guān)于，例如，ELISA試驗有更詳細的討論。
[0059]因此，可檢測部分可以選自:熒光部分；發(fā)光部分；化學發(fā)光部分；放射性部分(例如，放射性原子)；或酶部分。優(yōu)選，可檢測部分包含放射性原子或由放射性原子組成。放射性原子可以選自锝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、碘-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧_17、憐-32、硫_35、氣、氣、鍊-186、鍊-188和乾_90。
[0060]顯然，待測試劑(如，例如，在此所述的測試樣品和/或?qū)φ諛悠分械囊环N或多種生物標記和/或用于檢測選定蛋白中的抗體分子)必須具有充足的合適原子同位素，使得可檢測部分容易被檢測到。
[0061]在可替換的優(yōu)選實施方案中，結(jié)合部分的可檢測部分是熒光部分。
[0062]可以以已知的方式將放射性或其他標記結(jié)合至本發(fā)明方法的樣品中存在的生物標記中和/或本發(fā)明的結(jié)合部分中。例如，如果結(jié)合劑是多肽，可以涉及，例如，氟-19替代氫，將其生物合成或可以使用合適的氨基酸前體通過化學氨基酸合成。如99mTc、1231、186Rh和111In這樣的標記，例如，可以通過結(jié)合部分中的半胱氨酸殘基連接。釔-90可以通過賴氨酸殘基連接。10D0GEN 方法(Fraker 等(1978)Biochem.Biophys.Res.Comm.80,49-57)可以用于結(jié)合 1231。參考文獻(“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”(免疫閃爍掃描法中的單克隆抗體)，J-F Chatal,CRC Press, 1989)詳細描述了其他方法。用于將其他可檢測部分(如，酶、熒光、發(fā)光、化學發(fā)光或放射性部分)綴合蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域公知的。
[0063]本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到待測試樣品中的生物標記可以用與測定所述蛋白質(zhì)的存在、含量和/或位置間·接相關(guān)的部分來標記。因此，該部分可以構(gòu)成多組分可檢測部分的一個組分。例如，待測試樣品中的生物標記可以用生物素標記，這使得隨后可以使用融合或另外結(jié)合可檢測標記的抗生物素蛋白鏈菌素來檢測。
[0064]在本發(fā)明的第一個方面的另一個實施方案中，步驟(b)包括測定一種或多種生物標記的蛋白質(zhì)的表達。該方法可以包括使用一種或多種各自能夠選擇性地結(jié)合表3中鑒定的生物標記之一的結(jié)合部分在步驟(b)中測量一種或多種生物標記的表達。一種或多種結(jié)合部分可以包含抗體或其抗原結(jié)合片段(如單克隆抗體或其片段)，或可以由抗體或其抗原結(jié)合片段(如單克隆抗體或其片段)組成。
[0065]術(shù)語“抗體”包括任何合成的抗體、重組抗體或抗體混合物，如但不限于，通過免疫球蛋白輕鏈和/或重鏈可變和/或恒定區(qū)的噬菌體展示產(chǎn)生的單鏈抗體分子，或在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的免疫試驗形式中能夠結(jié)合抗原的其他免疫相互作用分子。
[0066]我們還包括使用抗體樣結(jié)合劑，如親和體(affibodies)和適配子(aptamer)。
[0067]涉及保持其特異性結(jié)合位點的抗體片段合成的技術(shù)的概述可以在ffinter&Milstein (1991) Nature349, 293-299 中找到。
[0068]另外，或可替換地，一種或多種第一個結(jié)合分子可以是適配子(參見Collett等，2005，Methods37:4-15)。
[0069]分子文庫，如抗體文庫(Clackson等，1991, Nature352,624-628 ;Marks 等，1991，JMol Biol222 (3):581-97)、肽文庫(Smith, 1985, Science228 (4705): 1315-7)、表達的 cDNA文庫(Santi等，(2000) J Mol Biol296 (2):497-508)、抗體框架以外的其他支架上的文庫，如親和體(Gunneriusson 等，1999, Appl Environ Microbiol65 (9):4134-40)或基于適配子的文庫(Kenan等，1999, Methods Mol Biolll8, 217-31)可以用作從其選擇對給定基序特異性的結(jié)合分子的來源，用于本發(fā)明的方法中。
[0070]可以在原核細胞(Clackson等，1991，前面引用的；Marks等，1991，前面引用的)或真核細胞(Kieke 等，1999, Proc Natl Acad Sci USA, 96 (10): 5651-6)中在體內(nèi)表達分子文庫，或可以不涉及細胞在體外表達(Hanes&Pluckthun, 1997, Proc Natl Acad SciUSA94(10):4937-42 ;He&Taussig，1997，Nucleic Acids Res25(24) ;Nemoto 等，1997，F(xiàn)EBSLett,414(2):405-8)。
[0071]在使用基于蛋白質(zhì)的文庫時的情況中，編碼潛在結(jié)合分子文庫的基因常常包裝在病毒中，并且潛在結(jié)合分子展示在病毒表面上(Clackson等，1991，上文；Marks等，1991，上文;Smith，1985，上文)。
[0072]可能最常用的展示系統(tǒng)是在其表面上展示抗體片段的絲狀噬菌體，抗體片段作為與噬菌體的次要外殼蛋白的融合體表達(Clackson等，1991，上文；Marks等，1991，上文)。然而，用于展示的其他合適系統(tǒng)包括使用其他病毒(EP39578)、細菌(Gunneriusson等，1999,上文;Daugherty 等，1998, Protein Engll (9): 825-32 ;Daugherty 等，1999, ProteinEngl2 (7):613-21)，和酵母(Shusta 等，1999，J Mol Biol292 (5): 949-56)。
[0073]此外，已經(jīng)利用在所謂的核糖體展示系統(tǒng)中的多肽產(chǎn)物與其編碼mRNA的連接研發(fā)了展不系統(tǒng)(Hanes&Pluckthun, 1997,上文；He&Taussig, 1997,上文；Nemoto 等，1997，上文)，或可替換地，多肽產(chǎn)物與編碼DNA的連接(參見US專利N0.5，856，090和W098/37186)。
[0074]抗體的可變重鏈(Vh)和可變輕鏈結(jié)構(gòu)域涉及抗原識別，這是通過早期蛋白酶消化實驗第一個認可的論據(jù)。通過嚙齒動物抗體的“人源化”發(fā)現(xiàn)了更多的證據(jù)。嚙齒動物來源的可變結(jié)構(gòu)域可以與人來源 的恒定結(jié)構(gòu)域融合，使得所得到的抗體保持嚙齒動物親本抗體的抗原特異性(Morrison 等(1984) Proc.Natl.Acad, Sc1.USA81,6851-6855)。
[0075]通過可變結(jié)構(gòu)域給予了抗原特異性，并且從涉及抗體片段的細菌表達的實驗知道與恒定結(jié)構(gòu)域無關(guān)，所有抗體片段含有一個或多個可變結(jié)構(gòu)域。這些分子包括Fab-樣分子(Better 等(1988) Science240,1041) ;Fv 分子(Skerra 等(1988) Science240,1038)；單鏈Fv(ScFv)分子，其中Vlj伴侶結(jié)構(gòu)域通過可變形的寡肽連接(Bird等(1988)Science242，423 ；Huston 等(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85, 5879)和包含分離的 V 結(jié)構(gòu)域的單結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs) (Ward等(1989) Nature341, 544)。涉及保持其特異性結(jié)合位點的抗體片段合成的技術(shù)的概述可以在Winter&Milstein (1991) Nature349，293-299中找到。
[0076]抗體或抗體結(jié)合片段可以選自完整的抗體、Fv片段(例如，單鏈Fv和二硫化物鍵合的Fv)、Fab_樣片段(例如，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)ab’片段和F(ab)2片段)、單可變結(jié)構(gòu)域(例如，Vh和\結(jié)構(gòu)域)和結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs,包括單和雙形式[即，dAb-連接物_dAb])。優(yōu)選,抗體或抗原結(jié)合片段是單鏈Fv (scFv)。
[0077]一種或多種結(jié)合部分可以替換地包含抗體樣結(jié)合劑或由抗體樣結(jié)合劑組成，例如，親和體或適配子。
[0078]“scFv分子”意思是其中Vh和\伴侶結(jié)構(gòu)域是通過可變形寡肽連接的分子。
[0079]使用抗體片段而不是完整抗體的優(yōu)點有幾個方面。較小尺寸的片段可以導致提高的藥物特性，如更好的實質(zhì)組織的滲透。除去了完整抗體的效應物作用，如補體結(jié)合。Fab、Fv, ScFv和dAb抗體片段全部可以在大腸桿菌中表達并從大腸桿菌分泌出來，因此使得可以容易地產(chǎn)生大量的所述片段。
[0080]完整抗體和F(ab’)2片段是“二價的”?！岸r”意思是所述抗體和F(ab’)2片段具有兩個抗原結(jié)合位點。相反，F(xiàn)ab、Fv、ScFv和dAb片段是單價的,只具有一個抗原結(jié)合位點。
[0081]抗體可以單克隆或多克隆的。合適的單克隆抗體可以通過已知技術(shù)來制備，例如，“Monoclonal Antibodies:A manual of techniques”(單克隆抗體:技術(shù)手冊)，H Zola(CRC Press,1988)和“Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques andapplications”(單克隆雜交瘤抗體:技術(shù)與應用)，J G R Hurrell (CRC Press, 1982)中公開的哪些，在此將兩篇文獻都引入作為參考。
[0082]當潛在的結(jié)合分子選自文庫時，通常使用具有限定基序的一種或多種選擇肽。在用于選擇肽的基序的設計中，可以使用提供結(jié)構(gòu)，降低肽可變性或帶電荷的、極性或疏水性側(cè)鏈使其與結(jié)合分子相互作用的氨基酸殘基。例如:
[0083]⑴脯氨酸可以穩(wěn)定肽結(jié)構(gòu)，因為其側(cè)鏈同時結(jié)合α碳以及氮；
[0084](ii)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸具有芳香族側(cè)鏈并且是高度疏水的，而亮氨酸和異亮氨酸具有脂肪族側(cè)鏈，并且也是疏水的；
[0085](iii)賴氨酸、精氨酸和組氨酸具有堿性側(cè)鏈并且在中性pH下帶有正電荷，同時天冬氨酸鹽和谷氨酸鹽具有酸性側(cè)鏈，并且在中性PH下帶有負電荷；
[0086](iv)天冬酰胺和谷氨酰胺在中性pH下是中性的，但含有酰胺基團，其可以參與氫鍵；
`[0087](V)絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸側(cè)鏈含有羥基，其可以參與氫鍵。
[0088]通常，結(jié)合分子的選擇涉及使用陣列技術(shù)和系統(tǒng)來分析與對應于結(jié)合分子類型的斑點的結(jié)合。
[0089]一種或多種蛋白結(jié)合部分可以包含可檢測部分?？蓹z測部分可以選自熒光部分、發(fā)光部分、化學發(fā)光部分、放射性部分和酶部分。
[0090]在本發(fā)明方法的進一步的實施方案中，可以使用包括能夠結(jié)合一種或多種蛋白質(zhì)的第二種結(jié)合劑的試驗來進行步驟(b)，第二種結(jié)合劑也包含可檢測部分。合適的第二種結(jié)合劑如以上關(guān)于第一種結(jié)合劑詳細描述的。
[0091]因此，首先使用第一種結(jié)合劑分離和/或固定待測試樣品中的目標蛋白質(zhì)，此后可以使用第二種結(jié)合劑測定所述生物標記的存在和/或相對含量。
[0092]在一個實施方案中，第二種結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段；通常是重組抗體或其片段。方便地，抗體或其片段選自:scFV;Fab;免疫球蛋白分子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。合以上詳細描述了適的抗體和片段，及其制備方法。
[0093]或者，第二種結(jié)合劑可以是抗體樣結(jié)合劑，如親和體或適配子。
[0094]或者，在待測試樣品中的蛋白質(zhì)上的可檢測部分包含特定結(jié)合對(例如，生物素)或由特定結(jié)合對(例如，生物素)組成的情況中，第二種結(jié)合劑可以包含特定結(jié)合對的complimentary成員(例如,抗生物素蛋白鏈菌素)或由特定結(jié)合對的complimentary成員(例如，抗生物素蛋白鏈菌素)組成。[0095]在使用檢測試驗的情況中，優(yōu)選可檢測部分選自:熒光部分；發(fā)光部分；化學發(fā)光部分；放射性部分；酶部分。以上描述了用于本發(fā)明方法中的合適的可檢測部分的實例。
[0096]用于檢測血清或血漿蛋白的優(yōu)選試驗包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、放射性免疫試驗(RIA)、免疫放射性測量試驗(IRMA)和免疫酶試驗(IEMA)，包括使用單克隆和/或多克隆抗體的夾層試驗。示例性夾層試驗由David等描述于US專利N0.4，376，110和4，486，530中，在此將其引入作為參考。如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，載波片上的細胞的抗體染色可以用于細胞學實驗診斷測試中公知的方法中。
[0097]因此，在一個實施方案中，試驗是ELISA (酶聯(lián)免疫吸附試驗)，其通常涉及使用產(chǎn)生有色反應產(chǎn)物的酶，通常在固相試驗中。如辣根過氧化物酶和磷酸酶這樣的酶已經(jīng)被廣泛使用。擴增磷酸酶反應的一種方法是使用NADP作為底物來產(chǎn)生NAD，其立刻作為用于第二個酶系統(tǒng)的輔酶。來自大腸桿菌的焦磷酸酶提供了良好的綴合物，因為該酶不存在于組織中，是穩(wěn)定的，并且產(chǎn)生良好的反應顏色。也可以使用基于酶(如熒光素酶)的化學發(fā)光系統(tǒng)。
[0098]常常使用與維生素生物素的綴合，因為這可以容易地通過以高特異性和親和性與其結(jié)合的酶聯(lián)抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈霉素的反應而得到檢測。
[0099]在可替換的實施方案中，用于蛋白質(zhì)檢測的試驗方便地是熒光試驗。因此，第二種結(jié)合劑的可檢測部分可以是熒光部分，如Alexa熒光團(例如，Alexa-647)。
[0100]優(yōu)選，使用陣列進行步驟(b)。陣列可以是基于珠子的陣列或基于表面的陣列。陣列可以選自:大陣列；微陣列；納陣列。
[0101]在一個實施方案中，該方法是用于鑒定能夠誘使人皮膚超敏反應的試劑。優(yōu)選，超敏反應是細胞介導的超敏反應，例如，IV型超敏反應。優(yōu)選,該方法用于鑒定能夠誘發(fā)過敏性接觸性皮炎(ACD)的試劑(即， 超敏反應是ACD)。
[0102]在一個實施方案中，樹突細胞群或樹突樣細胞群是樹突細胞群。優(yōu)選，樹突細胞是初級樹突細胞。優(yōu)選，樹突細胞是骨髓樹突細胞。
[0103]樹突細胞或樹突樣細胞群優(yōu)選是哺乳動物來源的。優(yōu)選，哺乳動物是大鼠、小鼠、豚鼠、貓、狗、馬或靈長類動物。最優(yōu)選，哺乳動物是人。
[0104]在一個實施方案中，樹突細胞群或樹突樣細胞群是樹突樣細胞群，優(yōu)選骨髓樹突樣細胞群。
[0105]在一個實施方案中，樹突樣細胞表達至少一種選自⑶54、⑶86、⑶80、HLA-DR、⑶14、⑶34和⑶Ia的標記，例如，2、3、4、5、6或7種標記。在進一步的實施方案中，樹突樣細胞表達標記 CD54、CD86、CD80、HLA-DR、CD14、CD34 和 CDla。
[0106]在進一步的實施方案中，樹突樣細胞可以源自骨髓樹突細胞。優(yōu)選，樹突樣細胞是骨髓白血病衍生的細胞。優(yōu)選，骨髓白血病衍生的細胞選自KG-1、THP-1、U-937、HL-60、Monomac-6、AML-193和MUTZ-3。最優(yōu)選，樹突樣細胞是MUTZ-3細胞。MUTZ-3細胞是人急性骨髓單核細胞白血病細胞，其于1995年5月15日保藏在Deutsche Sammlung fiirMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ),(Inhoffenstraβe7B,Braunschweig,德國)(www.dsma.de ;保藏號 ACC295)。
[0107]在一個實施方案中，樹突樣細胞，用細胞因子刺激后，通過⑶Id、I和II類MHC遞呈抗原和/或誘使特異性T細胞增殖。[0108]在一個實施方案中，陰性對照劑選自1-丁醇、4-氨基苯甲酸、苯甲醛、氯苯、酞酸二乙酯、二甲基甲酰胺、乙基香蘭素、甘油、異丙醇、乳酸、水楊酸甲酯、辛酸、丙二醇、苯酚、P-羥基苯甲酸、高錳酸鉀、水楊酸、十二烷基硫酸鈉、吐溫80和硫酸鋅。
[0109]該方法包括使用至少2種陰性對照劑(即，非致敏劑)，例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或至少 20 種陰性對照劑。
[0110]在另一個實施方案中，陽性對照劑選自2，4-二硝基氯苯、嘴唑酮、重鉻酸鉀、Kathon CH(MC/MC1)、甲醛、2-氨基酚、2-硝基-1，4-苯二胺、p-苯二胺、己基肉桂醛、2-羥乙基丙烯酸酯、2-巰基苯并噻唑、乙二醛、肉桂醛、異丁子香酚、乙二胺、間苯二酚、肉桂醇、丁子香酚、青霉素G或香葉醇。
[0111]該方法可以包括使用至少2種陽性對照(B卩，致敏劑)，例如，至少3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或至少 20 種陽性對照劑。
[0112]在一個實施方案中，該方法表示測試試劑是否是致敏劑。在可替換的或另外的實施方案中，該方法表示待測試樣品的致敏效力。
[0113]在一個實施方案中，該方法表不待測試樣品的致敏效力的局部淋巴結(jié)試驗(LLNA)類別。對于 LLNA 的詳細描述，參見 Basketter, D.A.等，Local lymph nodeassay-validation, conduct and use in practice (局部淋巴結(jié)試驗-實踐中的驗證、進行和使用).Food Chem Toxicol, 2002.40(5):p.593-8，在此將其引入作為參考。
[0114]在可替換的實施方案中，該方法表示待測試樣品的致敏效力的豚鼠最大化分類。對于豚鼠最大化測試的詳細描述，參見Magnusson,B.和A.M.Kligman,The identificationof contact allergens by animal assay.The guinea pig maximization test.(通過動物試驗鑒定接觸性過敏。豚鼠最大化測試)，J Invest Dermatol, 1969.52(3):ρ.268-76,在此將其引入作為參考。
[0115]因此，在一個實施方案中，該方法表示測試試劑是非致敏劑、弱致敏劑、中度致敏齊U、強致敏劑或極端致敏劑。PCA中的判定值和距離與致敏劑效力相關(guān)。
[0116]通常，用至少0.55的ROC AUC來確定皮膚致敏劑，例如，用至少0.60,0.65,0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99 或用 1.00 的 ROC AUC。優(yōu)選，用至少
0.85的ROC AUC確定皮膚致敏劑，并且最優(yōu)選使用I的ROC AUC。
[0117]通常，使用支持向量機(SVM)來鑒定能夠誘使致敏的試劑，如從http://cran.r-pro iect.0rg/web/packages/el071/index, html (例如，e 10711.5—24)可獲得的那些。然而,也可以使用任何其他合適的方式。
[0118]支持向量機(SVMs)是一套用于分類和回歸的相關(guān)監(jiān)督學習方法。給定一套訓練實例，每個標記為屬于兩個類別中的一個，SVM訓練算法構(gòu)建了一個模型，該模型預測一個新的實例是否落入一個類別或另一個。直觀地，SVM模型是實例作為空間點的表示，作圖使得分開類別的實例通過盡可能寬的明顯間隙分開。然后將新的實例作圖于相同的空間中，并基于它們落入間隙的哪一側(cè)來預測屬于哪個類別。
[0119]更正式地 ，支持向量機在高的或無限的三維空間中構(gòu)建了一個超平面或一組朝平面，其可以用于分類、回歸或其他任務。直觀地，通過與任何類別最近的訓練數(shù)據(jù)點具有最大距離(稱為函數(shù)間隔(functional margin))的超平面獲得了良好的分離，因為通常間隔越大，分類器產(chǎn)生的誤差越低。對于SVM的更多信息，參見，例如，Burges，1998，Data Miningand Knowledge Discovery (數(shù)據(jù)挖掘和知識發(fā)現(xiàn))，2:121-167。
[0120]在本發(fā)明的一個實施方案中，在進行本發(fā)明的方法前，使用已知試劑的生物標記特征(即，已知的致敏或非致敏劑)“訓練” SVM。通過運行這些訓練樣品，SVM能夠知道什么生物標記特征與能夠誘使致敏的試劑相關(guān)。一旦完成訓練過程，那么SVM能夠確定測試的生物標記樣本是否來自致敏劑或非致敏劑。
[0121]這使得可以將測試試劑歸類為致敏或非致敏的。此外，通過用已知效力的致敏劑(即，非致敏、弱、中度、強或極端致敏劑)訓練SVM，還可以比較地鑒定出測試試劑的效力。
[0122]然而，通過用必需的訓練參數(shù)將SVM預先編程，可以繞過這種訓練程序。例如，基于表3(A)和I(B)中列出的所有生物標記的測量，使用表5中詳細描述的SVM算法，根據(jù)已知的SVM參數(shù)，來鑒定能夠誘使致敏的試劑。
[0123]本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到通過用合適選擇的數(shù)據(jù)(即，來自暴露于已知致敏和/或非致敏劑的細胞的生物標記測量)訓練SVM機，可以確定表3所列生物標記的任何組合的合適SVM參數(shù)。
[0124]優(yōu)選，本發(fā)明的方法具有至少73%的準確率，例如，74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的準確率。
[0125]優(yōu)選，本發(fā)明的方法具有至少73%的靈敏度，例如，74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的靈敏度。
[0126]優(yōu)選，本發(fā)明的方法具有至少68%的特異性，例如，69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99 % 或 100% 的特異性。
[0127]“準確率”意思是方法的正確結(jié)果的比例，“靈敏度”意思是正確歸類為陽性的所有陽性化學品的比例，而“特異性”意思是正確歸類為陰性的所有陰性化學品的比例。
[0128]本發(fā)明的第二個方面提供了用于本發(fā)明的第一個方面的方法(或其任一個實施方案或?qū)嵤┓桨傅慕M合)中的陣列，陣列包含如上所限定的一種或多種結(jié)合部分。在一個實施方案中，結(jié)合部分(總地)能夠結(jié)合表3A中限定的所有生物標記。在進一步的實施方案中，結(jié)合部分(總地)能夠結(jié)合表3B中限定的所有生物標記。優(yōu)選，結(jié)合部分(總地)能夠結(jié)合表3A和表3B中限定的所有生物標記。
[0129]結(jié)合部分可以是固定的。
[0130]陣列本身在本領(lǐng)域是公知的。通常，它們由在固體支持物表面上形成的具有間隔部件(即，分開)區(qū)域(“斑點”)的線性或二維結(jié)構(gòu)構(gòu)成，每個區(qū)域具有有限的范圍。陣列還可以是珠子結(jié)構(gòu)，其中通過分子編碼或顏色編碼鑒定或在連續(xù)流中鑒定每個珠子。分析還可以連續(xù)進行，其中將樣品通過一系列斑點，每個斑點從溶液中吸附一類分子。固體支持物通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固體支持物可以是管狀、珠子、盤狀、硅片、微型板、聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜、硝基纖維素膜、尼龍膜、其他多孔膜、非多孔膜(例如，其中包括塑料、聚合物、珀思配克斯有機玻璃、硅)、多個聚合釘或多個微滴定孔，或任何其他適用于固定蛋白質(zhì)、聚核苷酸和其他合適分子和/或進行免疫試驗的表面的形式。結(jié)合方法是本領(lǐng)域公知的并且通常由將蛋白質(zhì)分子、聚核苷酸交聯(lián)共價結(jié)合或物理吸附至固體支持物等組成。或者，可以使用通過親和性標記物或相似構(gòu)建體的探針的親和性耦合。通過使用公知技術(shù)，如接觸或非接觸打印、遮蓋或照相平版印刷術(shù)，可以限定每個斑點的位置。對于綜述，參見Jenkins，R.E.，Pennington, S.R.(2001, Proteomics,2,13-29)和 Lai 等(2002, Drug Discov Todayl5 ；7(18 增補):S143-9)。
[0131]通常，陣列是微陣列。“微陣列”包括具有至少約100/cm2分開區(qū)域密度的區(qū)域陣列的意思，并且優(yōu)選至少約1000/cm2。微陣列中的區(qū)域具有典型的尺寸，例如，直徑，約10-250 μ m，并且以大致相同的距離與陣列中的其他區(qū)域分開。陣列可以替換地是大陣列或納陣列。
[0132]一旦鑒定和分離合適的結(jié)合分子(以上討論的)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用分子生物領(lǐng)域公知的方法制造陣列；參見以下的實施例。
[0133]本發(fā)明的第三個方面提供了一種或多種(優(yōu)選兩種或多種)選自表3A和/或表3B中限定的生物標記結(jié) 合用于鑒定超敏反應致敏劑的用途。優(yōu)選，表3A和表3B中限定的所有生物標記共同用于鑒定超敏反應致敏劑。優(yōu)選，該用途與本發(fā)明第一個方面和在此所述的實施方案中所述的方法相一致。
[0134]本發(fā)明的第四個方面提供了用于根據(jù)本發(fā)明第一個方面的方法中的分析試劑盒，其包含以下物質(zhì)或由以下物質(zhì)組成:
[0135]A)根據(jù)本發(fā)明第二個方面的陣列；和
[0136]B)用于進行根據(jù)本發(fā)明第一個方面的方法的說明書(任選)。
[0137]分析試劑盒可以包含一種或多種對照劑。優(yōu)選，分析試劑盒包含以上特征，或由以上特征組成，并與一種或多種陰性對照劑和/或一種或多種陽性對照劑一起。
[0138]優(yōu)選，現(xiàn)在將參照以下附圖，來描述具體表現(xiàn)本發(fā)明特定方面的非限制性實例。
[0139]圖1.用致敏和非致敏化學品刺激之前的MUTZ-3表型
[0140]⑶14、⑶la、⑶34、⑶54，⑶80、⑶86和HLA-DR的細胞表面表達水平用流式細胞術(shù)
測定。設定門控來排除碎片和死細胞，并且通過與相關(guān)同種型對照相比來建立象限。結(jié)果顯示六個代表性實驗中的一個。
[0141]圖2.用致敏和非致敏化學品刺激后⑶86表達的變化
[0142]用化學品刺激24h后，監(jiān)控⑶86的細胞表面表達水平。A)⑶86受化學品誘導的上調(diào)用流式細胞術(shù)來確定，以陽性細胞率的變化來表示，用經(jīng)2-氨基酚刺激的細胞(右側(cè)點圖)和未刺激的對照(左側(cè)點圖)的比較來舉例說明。結(jié)果顯示三個代表性實驗中的一個。設定門控來排除碎片和死細胞，并且通過與相關(guān)同種型對照相比來確定象限。B)刺激24h后CD86陽性細胞率的比較。統(tǒng)計學分析用配對Student’ s檢驗進行。*p〈0.05，#p〈0.01。NA,未分析。
[0143]圖3.化學刺激后差異化表達的轉(zhuǎn)錄物的主成分分析
[0144]MUTZ-3細胞經(jīng)20種致敏化學品和20種非致敏化學品刺激24h后的mRNA水平，用轉(zhuǎn)錄組(transcritomics)和Affymetrix Human Genel.0ST陣列測定。結(jié)構(gòu)和基因表達數(shù)據(jù)集內(nèi)相似性用軟件Qluc0re中的主成分分析(PCA)來研究。A)與非致敏化學品(綠色)相比，用致敏化學品(紅色)刺激的細胞中差異化表達的基因的PCA(用單向ANOVA鑒定了1010個基因)。B)與非致敏化學品相比，用致敏化學品刺激的細胞中差異化表達的基因的PCAdOlO個基因)，但現(xiàn)在用刺激時使用的化合物將樣品著色。C)用雙向ANOVA比較不同刺激時差異化表達的基因的PCA (1137個基因)。按照致敏(紅色)和非致敏(綠色)化學品將樣品著色。D)用雙向ANOVA比較不同刺激時差異化表達的基因的PCA(1137個基因)，但現(xiàn)在用刺激時使用的化合物將樣品著色。P，ANOVA的P-值。Q，為多重假設測試而校準的P-值。
[0145]圖4.“預測信號(Predication Signature) ” 的鑒定和 PCA 分析
[0146]A)用致敏化學品刺激的細胞相比于用非致敏化學品刺激的細胞而言差異化表達顯著的基因的數(shù)目(1010個基因)用后向消除法(Backward Elimination)減少。在消除810個分析物后觀察到了最低的KLD，稱為斷點(Breakpoint)。剩余的200個基因被視為該數(shù)據(jù)集內(nèi)的頂尖預測劑，稱為“預測信號”。B)通過“預測信號”的PCA，觀察到了致敏劑(紅色)和非致敏劑(綠色)之間的徹底分離。C)與B中相同的PCA，現(xiàn)在使用按LLNA效力著色的樣品。
[0147]圖5.“預測信號”選擇程序的確認
[0148]創(chuàng)建“預測信號”的方法通過從所述數(shù)據(jù)集隨機選出70%進行重復來確認。用剩余的30%數(shù)據(jù)作為信號確認的測試集。A) PCA證實“測試基因信號(Test Gene Signature)”可以分出致敏劑和非致敏劑。用僅僅70%訓練集的樣品(呈現(xiàn)出亮色)架構(gòu)由頭三種主成分組成的空間?；凇皽y試基因信號”中的分析物的表達水平，將呈現(xiàn)出暗色的測試集樣品標示于該空間中。B)基于70%訓練集來訓練SVM，用30%測試集予以驗證。ROC曲線1.0以下的面積證明，對測試集中所有樣品的組歸屬的預測是正確的，這說明“測試基因信號”是很有力度的，也說明關(guān)聯(lián)后 我們的“預測信號”是很有力度的。
[0149]圖6.“預測信號”的相互作用組(interactome)
[0150]200個分子(橙色)與按IPA證據(jù)連接各個點(theses)的分子的相互作用組。直接相互作用顯示為實線，間接相互作用顯示為點線。
實施例
[0151]過敏性接觸性皮炎是影響很大一部分人群的炎性皮膚病。其通常是由針對化學半抗原的免疫應答引起的，給社會造成了相當大的經(jīng)濟負擔。目前用于致敏化學品的測試依賴于動物實驗。有關(guān)藥物和化妝品等行業(yè)內(nèi)化學品的注冊和使用的新立法刺激了顯著的研究熱情，來研發(fā)可替換的基于人類細胞的試驗進行致敏性的預測。其目的在于用呈現(xiàn)出更高預測力的體外測試替代動物實驗。
[0152]我們研發(fā)了用于預測致敏化學品的新的基于細胞的試驗。通過分析用20種不同的致敏化學品、20種非致敏化學品和載體對照刺激24h后人細胞系MUTZ-3的轉(zhuǎn)錄組(trasncriptome)，我們已經(jīng)鑒定出具有有效辨別能力的200個基因的生物標記信號。使用用于監(jiān)督分類的支持向量機(Support Vector Machine),試驗的預測性能揭示了 100%的準確率、100%的靈敏度和100%的特異性。此外，按LLNA試驗對化學品進行分類，該基因信號也可以預測效力。所鑒定的這些標記涉及多個具有免疫相關(guān)功能的生物途徑，這有助于了解人類致敏的過程。
[0153]用體外人細胞系預測致敏性的基因信號已研發(fā)出來。這種簡便且強效的基于細胞的試驗可以完全替代或大大減少現(xiàn)有的使用實驗動物的測試系統(tǒng)?；谌祟惿飳W，該試驗被認為對于預測人的致敏性比傳統(tǒng)的基于動物的測試更相關(guān)且更準確。
[0154]結(jié)果
[0155]體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的細胞學原理(cellular rational)
[0156]作為先天免疫和獲得性免疫之間的連接，DC是免疫系統(tǒng)基本的免疫調(diào)節(jié)細胞。它們特有的識別抗原以啟動T細胞應答的特性，以及它們在偏移免疫應答方面的強力調(diào)節(jié)功能，使得它們成為試驗研發(fā)的目標。然而，初級DC構(gòu)成不適于篩選的異源小細胞群。使用有多個相比于初級DC的特征的細胞系作為預測性測試的基礎，明顯的優(yōu)勢是細胞的穩(wěn)定性、繁殖能力和無限制的供應。迄今為止，尚無具有明顯DC樣特性的白血病的報道，可能是由于這類細胞的特征由僅見于細胞分裂之后的復雜末端分化過程來決定[11]，并且因此，DC-樣細胞系的產(chǎn)生依賴于可獲得的髓系白血病細胞系。MUTZ-3是人類急性骨髓單核細胞白血病細胞系，具有分化成DC、呈遞抗原以及誘導特異性T-細胞增殖的潛力。在現(xiàn)有多個髓系人細胞系中，MUTZ-3是到目前為止的優(yōu)選候選者。與未成熟的初級DC相似，MUTZ-3祖先表達⑶la、HLA-DR和⑶54，以及低水平的⑶80和⑶86 (圖1)。MUTZ-3群還包含三個亞群:CD14+、⑶34+和雙陰性細胞，之前報道是從增殖性⑶34+祖先向非增殖性⑶14+DC祖先過渡的分化步驟[9]。因此，我們利用了組成型分化的祖先MUTZ-3細胞作為測試系統(tǒng)的基礎。
[0157]應答致敏劑刺激的CD86表面表達:CD86是迄今為止在細胞系統(tǒng)中得到最廣泛研究的用于致敏的生物標記，所述細胞系統(tǒng)如單核細胞衍生的樹突細胞(MoDCs)或樹突細胞樣人類細胞系及其祖先，如THP-1、U-937和KG-1。因此，作為參照，⑶86的細胞表面表達用流式細胞術(shù)進行了測量，這是在用20種致敏劑和20種非致敏劑以及用載體對照(表I)刺激24h后。⑶86在用以下物質(zhì)刺激的細胞表面顯著上調(diào):2_氨基酚、KathonCG,2-硝基-1，4-苯二胺、2，4-二硝基氯 苯、2-輕乙基丙烯酸酯、肉桂醒(cinnamic aldehyde)、p-苯二胺、間苯二酚和2-巰基苯并噻唑。這樣一來，基于單種生物標記(如CD86)測量的試驗將獲得47%的靈敏度和100%的特異性。結(jié)果是，使用基于細胞(如MUTZ-3)的系統(tǒng)，CD86不能將皮膚致敏劑分類。
[0158]化學刺激的MUTZ-3細胞中轉(zhuǎn)錄譜的分析:使用基因組表達陣列來測試20種致敏劑(一式三份)、20種非致敏劑(一式三份)、以及載體對照(如DMSO和蒸餾水，一式十二份)?？傊?44個樣本產(chǎn)生了數(shù)據(jù)集。對樣品進行RMA標準化和質(zhì)量控制發(fā)現(xiàn)，嗔唑酮和肉桂醛樣品是明顯的異常值(outlier)，必須去除，否則它們在數(shù)據(jù)集中占優(yōu)勢，妨礙生物標記的鑒定(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，高錳酸鉀重復中的一個因陣列有誤而必須除去。留下了由137個樣本組成的數(shù)據(jù)集，每個具有來自33，297個轉(zhuǎn)錄物的測量的數(shù)據(jù)。為了采集數(shù)據(jù)集中關(guān)于致敏劑相比于非致敏劑的專門信息，使用了軟件Qlucore Omics Explore2.1,其能夠進行實時主成分分析(PCA)，同時基于ANOVA P-值選擇，將輸入的基因分揀至所需標準(例如，致敏劑和非致敏劑)后。圖3A和3B顯示了基于1010個轉(zhuǎn)錄物的PCAs，其ANOVA分析的P值< 2.0X 10_6，是致敏相比于非致敏化學品的比較。如圖3A所示，兩組之間有明顯區(qū)別，非致敏劑在圖的較低部分形成密集云團(綠色)，致敏劑以各種方向向上伸展(紅色)。然而，在該顯著性水平下，兩組之間未實現(xiàn)完全分離。圖3B根據(jù)刺激進行著色，可看出，乙二醛、丁子香酚、己基肉桂醛、異丁子香酚、間苯二酚、青霉素G和乙二胺組中的一個或多個重復與對照組在一起。此外，非致敏劑吐溫80、辛酸和苯酚的一個或多個重復趨于與致敏劑在一組。圖3C和3D顯示了基于1137個基因的PCA圖，當比較不同刺激時，全部都具有<7.0X 10_21的P值。在該顯著水平鑒定如此大量基因，充分說明該數(shù)據(jù)集的能力強大。在圖3D中，清楚看到多個重復集合在一起，表明是高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。重鉻酸鉀的三個重復樣本具有離散的圖譜，表明與非致敏劑相比對細胞的實質(zhì)性影響。此外，2-羥乙基丙烯酸酯、2-氨基酚、Kathon CG、甲醛、2-硝基-1，4-苯二胺、2，4- 二硝基氯苯甲酸、p_苯二胺、2-巰基苯并噻唑、肉桂醇和間苯二酚具有集合在一起、與陰性組分開的重復。如圖3C和3A所示，用1010和1137個基因的基因信號分別都未實現(xiàn)完全分離。
[0159]后向消除法鑒定出最有辨別力的基因:即使數(shù)據(jù)集含有P-值低至1X10_17的基因，降低P-值截留值仍不能實現(xiàn)致敏劑和非致敏劑之間的完全分離。全部基于P-值選出的基因信號未能提供最可能的預測力，因為低P-值不保證基因提供任何其他信息。為了進一步降低用于預測性生物標記信號的轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量，我們使用了后向消除算法(圖4A)。該算法一個一個地除去基因，同時不僅考慮基因單獨的影響，還考慮它們怎樣與全部的選定基因信號共同發(fā)揮作用。對于每個被消除的基因，降低Kullback-Leibler離散(Kullback-Leibler divergence, KLD)值,直至達到斷點,在該點,還剩余200個基因。在該點繼續(xù)消除基因，導致KLD再次升高，表明信息正在丟失(圖4A)。因此，選擇具有最低KLD值的200個基因用于進一步分析。200個分析物的PCA揭示，它們具有完全分離致敏劑和非致敏劑的能力，表明這些轉(zhuǎn)錄物可以用作未知樣品的致敏特性的預測劑(圖4B)。重要的是，將PCA中的多個樣本根據(jù)LLNA按其效力進行著色，表明可以用這些基因預測效力(圖4C)。將這200個基因稱為“預測信號”，它們的特性列于表3中。
[0160]用于鑒定預測信號的分析方法的確認:為了確認我們的信號的預測力，我們使用了稱為支持向量機(SVM)的監(jiān)督學習法[12]，其將來自訓練集的數(shù)據(jù)在空間中作圖，以便使致敏化學品和非致敏化學品所致基因表達的分離最大化。作為訓練集，隨機選擇數(shù)據(jù)集的70%，并重復整·個選擇過程(如上所述)。從29，141個轉(zhuǎn)錄物開始，使用ANOVA過濾和后向消除，將信號減少至200個轉(zhuǎn)錄物，稱為“測試基因信號”。用數(shù)據(jù)集的剩余30%測試所得信號。以分層次的隨機方式，將數(shù)據(jù)集分成子集:70%訓練數(shù)據(jù)集和30%測試數(shù)據(jù)集，這意味著，兩個子集中都保留有該完整數(shù)據(jù)集中的致敏劑和非致敏劑部分，但兩個子集任一個中包括的樣本是隨機選擇的。此后，用“測試基因信號”訓練含訓練集的SVM模型，用測試集評估該模型的預測力。圖5A顯示了基于“測試基因信號”和測試集樣本的PCA圖。顯然，致敏劑(紅色)和非致敏劑(綠色)之間的分離情形與圖4B中“預測信號”的觀察結(jié)果相似。在圖5A的PCA中，測試集的致敏和非致敏化學品樣本已分別著深紅色和深綠色，表示它們不能為繪圖的主成分出力，而僅僅是基于選定的“測試基因信號”的表達值來作圖。如所看到的，來自測試集的致敏劑與來自訓練集的致敏劑集合在一起，而來自測試集的非致敏劑與來自訓練集的非致敏劑集合在一起。這是非常直觀的預測了測試集中樣本的組歸屬方式，只需要使用眼睛進行模式識別。SVM訓練和確認的結(jié)果可見于圖5B，其中數(shù)值I的ROC曲線下面積證實了“測試基因信號”預測測試集中的樣本屬于哪一組的能力。該試驗的預測性能顯示出96%的準確率、100%的靈敏度和92%的特異性。盡管該實驗沒有證實“預測信號”本身的預測力，但確實證實了選出“預測信號”所用的方法，支持了 “預測信號”能夠準確預測未知樣本的致敏特性的主張。
[0161]“預測信號”的分子功能和規(guī)范途徑[0162]使用Ingenuity Pathways Analysis (IPA, Ingenuity Systems Inc.),表征了所述信號中200個分子之184個的功能和已知(規(guī)范)途徑。剩余的16個分子未能作圖至任何IPA入口(entries)。所鑒定的優(yōu)勢功能是小分子生物化學(38個分子)、細胞死亡(33)、月旨質(zhì)代謝(24)、血液系統(tǒng)發(fā)育(19)、細胞生長和增殖(16)、分子轉(zhuǎn)運(15)、細胞周期(15)和碳水化合物代謝(15)，詳見表4。184個分子中的67個涉及所列功能。在剩余的117個分子中，30個已知來自各種人類疾病和分子功能，如所述的生物標記(SCARB2、RFC2、VPS37A和BCL7A)和藥物靶(ABAT)。這些分子中的大部分是代謝標記。在作為整體的信號中，存在幾個藥物靶，如 HMGCR、HMOXl、ABAT、RXRA、CD33、MAP2K1、MAPK13 和 CD86。兩個描述為用于皮膚疾病:⑶86 (牛皮癬)和RXRA (濕疹)。該信號還包含皮膚發(fā)育標記(DHCR24)和樹突細胞標記(MAP2K1、NLRP12 和 RFC2)。
[0163]可能被所述信號中多個分子引發(fā)的途徑也用IPA進行了研究。最密集的是:NRF2介導的氧化應答(10)、異型生物質(zhì)(xenobiotic)代謝信號傳導(8)、LPS/IL-1介導的對RXR功能的抑制(6)、芳烴受體信號傳導(6)和蛋白激酶A信號傳導(6)。這些途徑中五個最高等級的途徑全部已知參與由外源物質(zhì)，異型生物質(zhì)引起的反應。異型生物質(zhì)是相對于人體而言外源的天然或合成的化學化合物。
[0164]結(jié)論
[0165]過敏性接觸性皮炎(ACD)是由對過敏原失調(diào)的獲得性免疫應答引起的炎性皮膚病[13]。小分子量化學品，稱為半抗原，可以結(jié)合皮膚中的自體蛋白，其能夠通過皮膚樹突細胞(DC)將蛋白質(zhì)結(jié)合的過致敏學品內(nèi)在化。DC，在局部微環(huán)境的影響下，加工蛋白質(zhì)-半抗原復合物，移動至局部淋巴結(jié)并激活幼稚T細胞。過敏原特異性應答的啟動和發(fā)展，主要是效應物CD8+T細胞和Thl細胞，以及免疫調(diào)節(jié)蛋白的產(chǎn)生，是ACD中觀察到的免疫活動的特點。這種T-細胞介導的IV型超敏反應的特征在于諸如皮疹、水泡和瘙癢之類的癥狀。ACD是人體中觀察到的免疫毒性的最常見表現(xiàn)[13]，上百種化學品已經(jīng)顯示出引起皮膚致敏[14]。即使已經(jīng)進行了密集的`研究嘗試來鑒定針對過致敏學品的免疫應答，但致敏中涉及的驅(qū)動因子和分子機理仍然是未知的。REACH立法要求所有超過I噸/年生產(chǎn)的化學品要測試其有害特性，如毒性和致過敏性[5]，這增加了對用于預測力的準確試驗的需求。目前，潛在的人致敏劑的鑒定依賴于動物實驗，特別是小鼠局部淋巴結(jié)試驗(LLNA) [6]。LLNA是基于化學暴露后小鼠的引流淋巴結(jié)中誘發(fā)的增殖的測量[15]。如果與對照相比，它們引起增殖三倍的增加，則將化學品限定為致敏劑，并且該增加所需的化學品含量為EC3值。因此，基于致敏效力，LLNA還可以用于將化學品歸類。然而，LLNA在許多方面不是最佳的。除了明顯的倫理原因以外，該試驗還是費時和昂貴的。人類致敏數(shù)據(jù)常常源于人類最大化測試(HMT) [16]和人類斑貼測試(HPT) ο 在來自 Interagency Coordinating Committee onthe Validation of Alternative Methods (ICCVAM)的大量報告中，將 LLNA 的性能特征與其他可用的基于動物的方法和人致敏數(shù)據(jù)(HMT和HPT)相比較[17]。與人數(shù)據(jù)(74個測定值)相比，LLNA性能顯示出72%的準確率、72%的靈敏度和67%的特異性。準確率定義為一種方法的正確結(jié)果的比例，“靈敏度”是所有陽性化學品中正確歸類為陽性的比例，而“特異性”是所有陰性化學品中正確歸類為陰性的比例。因此，存在明顯的需求來研發(fā)更可靠的用于致敏的測試方法。此外，Cosmetics Directive (化妝品規(guī)范)的第7次修改(76/768/EEC)提出了當科學的可靠方法可用時，使用用于化妝品成分的動物測試的全面禁令在2013年生效。因此，行業(yè)內(nèi)對基于人細胞的可靠預測測試方法存在很大的需求。涉及致敏的各種人細胞系和初級細胞已作為預測測試系統(tǒng)進行了評價，如上皮細胞、樹突細胞和T細胞，然而目前沒有經(jīng)證實的測試試驗可用。已經(jīng)表明各種單個生物標記在用致敏化學品刺激時上調(diào)，如 CD40、CD80、CXCL8、IL-1 β、MIP-1 β、p38MAPK，如[18]中概述的，然而，其中沒有一個在單獨時具有區(qū)分致敏和非致敏化學品的預測力。⑶86是這些標記中得到最廣泛研究的；然而，在我們的試驗中對該標記表達水平的測定只是相關(guān)，但不足以作為用于致敏的讀數(shù)(圖2)。19種致敏化學品中只有9種誘使了⑶86的顯著上調(diào)。替代地，我們堅信多個生物標記信號的分析優(yōu)于任何單個生物標記。我們因此利用完整基因組轉(zhuǎn)錄組學的力量，篩選了由一大組成分明確的化學品和對照品誘導的基因調(diào)控。在MUTZ-3細胞中，經(jīng)ANOVA鑒定出，用致敏化學品刺激相比于用非致敏對照有差異化表達的大量基因(圖3)，這表明MUTZ-3真正具有區(qū)分這兩組的能力，因此是用于致敏的體外試驗的合適細胞系統(tǒng)。已有多項努力旨在在諸如CD34+祖先細胞衍生的DC等多種細胞系統(tǒng)中形成基于全基因組分析的試驗[19-21]。盡管這樣的試驗可能提供了類似體內(nèi)的環(huán)境，但仍會有人認為，初級細胞不是非常適于這種高商業(yè)興趣的試驗。此外，在這樣的系統(tǒng)中需要考慮倫理方面。此外，之前依賴于全基因組分析的用于致敏的體外試驗研發(fā)使用了非常有限組的測試化合物。迄今為止，本研究是在該領(lǐng)域內(nèi)進行的最大研究，利用了 20種陽性和20種陰性的訓練化合物。我們嘗試將這些訓練化合 物分成兩組，分別用于訓練和測試。盡管這些實驗導致了成功的預測(數(shù)據(jù)未顯示)，但我們的經(jīng)驗是，致敏化合物在它們誘導的基因表達譜方面有很大不同，見圖3D。從這方面看，當鑒定我們的“預測信號”時，我們希望包括盡可能多的訓練化合物。因此，我們沒有將任何化合物排除在驗證之外。反而是，我們通過將樣本進一步隨機細分成訓練集和測試集，用未見過的數(shù)據(jù)進行證實，驗證了鑒定出“預測信號”的這種方法，見圖5。通過包括具備廣泛多種反應機制和致敏效力的所有致敏化合物，我們主張，我們已經(jīng)鑒定出非常適于預測未知樣本的致敏特性的預測信號。值得注意的是，我們的“預測信號”能夠預測致敏化合物(如經(jīng)LLNA確定的那些)的效力，可參見圖4C。然而，LLNA的預測效力與我們的分類法的并非對所有樣本都匹配。尤其，中度致敏劑2-羥乙基丙烯酸酯顯示出在基因表達譜方面與強致敏劑和極端致敏劑的強烈相似性。同樣，中度致敏劑乙二胺、己基肉桂醛和乙二醛與弱致敏劑歸在一組。這些發(fā)現(xiàn)強烈暗示:致敏效力的定義可能需要修正。我們主張，我們的“預測信號”可以用于這樣的分類。
[0166]總之，我們提供了一種體外試驗，其基于具有經(jīng)鑒定的由200個基因組成的“預測信號”的MUTZ-3細胞系統(tǒng)，能將樣本正確地歸類為致敏劑或非致敏劑。此外，該試驗可以預測致敏化合物的效力，并且可以用于修正這樣的分類。
[0167]材料和方法
[0168]化學品
[0169]使用了由20種致敏劑和20種非致敏劑組成的一組化學品用于細胞刺激。致敏
劑是2，4-二氯甲苯、肉桂醛、間苯二酚、嘴唑酮、乙二醛、2-巰基苯并噻唑、丁子香酚、異丁
子香酚、肉桂醇和P-苯二胺、甲醛、乙二胺、2-羥乙基丙烯酸酯、己基肉桂醛、重鉻酸鉀、青霉素G、Katchon CG(MCI/MI)、2_氨基酚、香葉醇和2-硝基-1，4-苯二胺(表I)。非致敏劑是十二烷基硫酸鈉、水楊酸、苯酚、甘油、乳酸、氯苯、P-氫苯甲酸、苯甲醛、酞酸二乙酯和辛酸、硫酸鋅、4-氨基苯甲酸、水楊酸甲酯、乙基香蘭素、異丙醇、二甲基甲酰胺、1-丁醇、高錳酸鉀、丙二醇和吐溫80 (表I)。所有化學品來自Sigma-Aldrich，St.Louis, MO, USA。將化合物溶解于二甲亞砜(DMSO)或蒸餾水中。在刺激之前，用碘化丙啶(PI)按說明書(BDBiosciences, San Diego7CA)監(jiān)控所有化合物的細胞毒性。受刺激的細胞的相對活力如下計算
【權(quán)利要求】
1.鑒定能誘導哺乳動物皮膚致敏的試劑的體外方法，該方法包括以下步驟或由以下步驟組成: a)將樹突細胞群或樹突樣細胞群暴露于測試試劑；和 b)測量所述細胞中一種或多種選自表3的生物標記的表達； 其中，步驟(b)中測量的一種或多種生物標記在所述細胞中的表達指示待測試樣品的致敏作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進一步包括將另一群樹突細胞或樹突樣細胞暴露于不使人類皮膚致敏的陰性對照劑、并測量一種或多種在步驟(b)中測量的生物標記在這些細胞中的表達。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進一步包括將另一群樹突細胞或樹突樣細胞群暴露于使人類皮膚致敏的陽性對照劑、并測量一種或多種在步驟(b)中測量的生物標記在這些細胞中的表達。
4.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量至少一種選自以下的生物標記的表達: i)味覺受體，2型，成員5 (TAS2R5), ?)角化細胞生長因子樣蛋白1/2/假設蛋白FLJ20444(KGFLPl/2/FLJ20444)， iii)跨膜前后轉(zhuǎn)化蛋白I(TAPTl)，
iv)sprouty 同系物 2 (SPRY2)， V)脂肪酸合成酶(FASN)， vi)B-細胞 CLL/ 淋巴瘤 7A(BCL7A)， vii)溶質(zhì)載體家族25，成員32(SLC25A32)， viii)鐵蛋白，重多肽假基因I(FTHPl)， ix)ATPase, H+ 運輸，溶酶體 50/57kDa，Vl 亞基 H(ATP6V1H)， X)角鯊烯環(huán)氧酶(SQLE)JP xi)組蛋白簇 1，Hle(HISTlHlE)。
5.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量味覺受體，2型，成員5 (TAS2R5)的表達。
6.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量角化細胞生長因子樣蛋白1/2/假設蛋白 FLJ20444(KGFLPl/2/FLJ20444)的表達。
7.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量跨膜前后轉(zhuǎn)化蛋白I (TAPTl)的表達。
8.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量sprouty同系物2(SPRY2)的表達。
9.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量脂肪酸合成酶(FASN)的表達。
10.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量B-細胞CLL/淋巴瘤7A (BCL7A)的表達。
11.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量溶質(zhì)載體家族25，成員.32 (SLC25A32)的表達。
12.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量鐵蛋白，重多肽假基因I (FTHPl)的表達。
13.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量ATPase，H+運輸，溶酶體50/57kDa, Vl 亞基 H(ATP6V1H)的表達。
14.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量角鯊烯環(huán)氧酶(SQLE)的表達。
15.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量組蛋白簇1，Hle(HISTlHlE)的表達。
16.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量至少兩種來自表3A的生物標記的表達或步驟(b)由測量至少兩種來自表3A的生物標記的表達組成，例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10或11種來自表3A的生物標記。
17.根據(jù) 之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量至少兩種來自表3B的生物標記的表達或步驟(b)由測量至少兩種來自表3B的生物標記的表達組成，例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188，或至少 189 種來自表 3B 的生物標記。
18.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量表3A中的所有生物標記的表達或步驟(b)由測量表3A中的所有生物標記的表達組成。
19.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量表3B中的所有生物標記的表達或步驟(b)由測量表3B中的所有生物標記的表達組成。
20.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量表3A和表3B中的所有生物標記的表達或步驟(b)由測量表3A和表3B中的所有生物標記的表達組成。
21.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)包括測量編碼一種或多種生物標記的核酸分子的表達。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中核酸分子是cDNA分子或mRNA分子。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中核酸分子是mRNA分子。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23的方法,其中使用選自Southern雜交、Northern雜交、聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)、定量實時PCR(qRT-PCR)、納陣列、微陣列、大陣列、放射自顯影法和原位雜交的方法進行步驟(b)中一種或多種生物標記表達的測量。
25.根據(jù)權(quán)利要求22-24任一項的方法，其中使用DNA微陣列測定了步驟(b)中一種或多種生物標記表達的測量。
26.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中使用一種或多種結(jié)合部分進行了步驟(b)中一種或多種生物標記表達的測量，每個結(jié)合部分能夠選擇性地結(jié)合編碼表3中鑒定的生物標記之一的核酸分子。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法,其中一種或多種結(jié)合部分各自包括核酸分子或由核酸分子組成。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中一種或多種結(jié)合部分各自包含DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA 或 PMO 或由 DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA 或 PMO 組成。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28的方法，一種或多種結(jié)合部分各自包含DNA或由DNA組成。
30.根據(jù)權(quán)利要求27-29任一項的方法，其中一種或多種結(jié)合部分是5至100個核苷酸長。
31.根據(jù)權(quán)利要求27-30任一項的方法,其中一種或多種核酸分子是15至35個核苷酸長。
32.根據(jù)權(quán)利要求25-31任一項的方法，其中結(jié)合部分包含可檢測部分。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法,其中可檢測部分選自:突光部分；發(fā)光部分；化學發(fā)光部分；放射性部分(例如，放射性原子)；或酶部分。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中可檢測部分包含放射性原子或由放射性原子組成。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中放射性原子選自锝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、鵬-111、氣-19、碳-13、氣-15、氧-17、憐-32、硫 _35、氣、氣、鍊-186、鍊-188 和?乙-90。
36.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中結(jié)合部分的可檢測部分是熒光部分。
37.根據(jù)權(quán)利要求1至21任一項的方法，其中步驟(b)包括測量一種或多種生物標記的蛋白的表達。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中使用一種或多種結(jié)合部分進行了步驟(b)中一種或多種生物標記表達的測量，各個結(jié)合部分能夠選擇性地結(jié)合表I中鑒定的生物標記之一。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中一種或多種結(jié)合部分包含抗體或其抗原結(jié)合片段或由抗體或其抗原結(jié)合片段組成。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中抗體或其片段是單克隆抗體或其片段。
41.根據(jù)權(quán)利要求39或40的方法，其中抗體或抗原結(jié)合片段選自完整的抗體、Fv片段(例如，單鏈Fv和二硫化物鍵合的Fv)、Fab-樣片段(例如，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)ab’片段和F(ab)2片段)、單可變結(jié)構(gòu)域(例如，Vh和 '結(jié)構(gòu)域)和結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs，包括單和雙形式[即，dAb-連接物-dAb])。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中抗體或抗原結(jié)合片段是單鏈Fv(scFv)。
43.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中一種或多種結(jié)合部分包括抗體樣結(jié)合劑或由抗體樣結(jié)合劑組成，例如親和體或適配子。
44.根據(jù)權(quán)利要求38至43任一項的方法，其中一種或多種結(jié)合部分包含可檢測部分。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法,其中可檢測部分選自突光部分、發(fā)光部分、化學發(fā)光部分、放射性部分和酶部分。
46.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中使用陣列進行了步驟(b)。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中陣列是基于珠子的陣列。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中陣列是基于表面的陣列。
49.根據(jù)權(quán)利要求46至48任一項的方法，其中陣列選自:大陣列；微陣列；納陣列。
50.一種用于根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法中的陣列,該陣列包含如權(quán)利要求26至36和38至45任一項中限定的一種或多種第一種結(jié)合劑。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的陣列，其包含總地能夠結(jié)合表I中的所有生物標記的結(jié)合劑。
52.根據(jù)權(quán)利要求50或51的陣列，其中第一種結(jié)合劑是固定的。
53.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，用于鑒定能夠誘發(fā)人皮膚超敏反應的試劑。
54.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中超敏反應是細胞介導的超敏反應。
55.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中超敏反應是IV型超敏反應。
56.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，用于鑒定能夠誘發(fā)過敏性接觸性皮炎(AOT)的試劑。
57.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中樹突細胞群或樹突樣細胞群是樹突樣細胞群。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其中樹突樣細胞是骨髓樹突樣細胞。
59.根據(jù)權(quán)利要 求58的方法，其中骨髓樹突樣細胞源自骨髓樹突細胞。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中源自骨髓樹突細胞的細胞是骨髓白血病衍生的細胞。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中骨髓白血病衍生的細胞選自KG-1、THP-UU-937、HL-60、Monomac-6、AML-193 和 MUTZ-3。
62.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中樹突樣細胞是MUTZ-3細胞。
63.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(e)中提供的對照非致敏劑選自1-丁醇、4-氨基苯甲酸、苯甲醛、氯苯、酞酸二乙酯、二甲基甲酰胺、乙基香蘭素、甘油、異丙醇、乳酸、水楊酸甲酯、辛酸、丙二醇、苯酚、對羥基苯甲酸、高錳酸鉀、水楊酸、十二烷基硫酸鈉、吐溫80和硫酸鋅。
64.根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中提供至少2種對照非致敏劑，例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至少 20 種對照非致敏劑。
65.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(i)中提供的對照致敏劑選自2，4-二硝基氯苯、jtS唑酮、重鉻酸鉀、Kathon CH(MC/MC1)、甲醛、2-氨基酚、2-硝基-1，4-苯二胺、對苯二胺、己基肉桂醛、2-羥乙基丙烯酸酯、2-巰基苯并噻唑、乙二醛、肉桂醛、異丁子香酚、乙二胺、間苯二酚、肉桂醇、丁子香酚、青霉素G或香葉醇。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中提供至少2種對照致敏劑，例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至少 20 種對照致敏劑。
67.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中該方法表示待測試樣品的致敏效力。
68.根據(jù)權(quán)利要求67的方法，其中該方法指示待測試樣品的致敏效力的局部淋巴結(jié)試驗(LLNA)類別。
69.—種用于根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法中的陣列，該陣列包含一種或多種如權(quán)利要求26至36或38-45中所限定的結(jié)合部分。
70.根據(jù)權(quán)利要求69的陣列，其中結(jié)合部分能夠結(jié)合表3A中的所有生物標記。
71.根據(jù)權(quán)利要求70的陣列，其中結(jié)合部分能夠結(jié)合表3B中的所有生物標記。
72.根據(jù)權(quán)利要求50-52任一項的陣列，其中結(jié)合部分能夠結(jié)合表3A和表3B中的所有生物標記。
73.根據(jù)權(quán)利要求50-52任一項的陣列，其中結(jié)合部分是固定的。
74.兩種或多種選自表3A或表3B中的生物標記結(jié)合用于鑒定超敏反應致敏劑的用途。
75.根據(jù)權(quán)利要求74的用途，其中表3A和表3B中的所有生物標記總地用于鑒定超敏反應致敏劑。
76.一種用于根據(jù)權(quán)利要求1至68任一項的方法中的分析試劑盒，其包含: A)根據(jù)權(quán)利要求69至73任一項的陣列；和 B)用于進行權(quán)利要求1至68任一項中限定的方法的說明書(任選)。
77.根據(jù)權(quán)利要求76的分析試劑盒，進一步包含一種或多種對照樣品。
78.根據(jù)權(quán)利要求77的分析試劑盒，包含一種或多種非致敏劑。
79.根據(jù)權(quán)利要求77或權(quán)利要求78的分析試劑盒，包含一種或多種致敏劑。
80.基本上如本文中所述的方法或用途。
81.基本上如本文中 所述的陣列或試劑盒。
【文檔編號】C12Q1/68GK103429756SQ201180062886
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日:2010年10月26日
【發(fā)明者】M.林德斯泰特, C.A.K.伯萊拜克, H.喬漢森, A-S.阿爾布雷克特 申請人:森扎基因有限責任公司