專利名稱：慢病毒載體的半穩(wěn)定生產的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于基因治療的慢病毒載體(LV)的生產。更具體地講，本發(fā)明涉及半穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系以及使用雜合桿狀-腺伴隨病毒(baculo-Adeno associated virus(AAV))載體而制備包裝細胞系的方法，用于慢病毒結構蛋白和調控蛋白的穩(wěn)定整合。直量
自從2001年針對AIDS的首次LV I期臨床試驗之后，研究基于HIV的LV作為基因遞送載體的38個1-1I期和2個I1-1II期試驗已經經過當局的審查；它們中的3個仍然處于審查中。最大數量的試驗包括單基因病，其中的一些具有高發(fā)病率，例如庫利氏貧血(Cooley’ s anemia) β -重型地中海貧血(4個試驗)。其次是癌癥和感染性疾病,主要是HIV-1感染。通常，Ι/II期試驗中招募的患者數量是有限的，但在III期中則不是。因此迫切需要第2代(基于LTR)和第3代(基于SIN) LV的穩(wěn)定包裝細胞系，以應付LV大規(guī)模生產的需要，大量用于未來有希望的III期試驗?；谒矔r方案的LV生產在全局應用的安全性、成本和再現性的觀點來看確實是不現實的。越來越多的證據顯示，新近開發(fā)的用于基因治療的病毒整合載體LV具有廣泛應用性，可轉導終末分化的或處于周期中的細胞，對維持長期轉基因表達是理想的并且比先前畏懼的更安全。在過去20年里對莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV) Y-逆轉錄病毒載體(YRV)積累的經驗指導了 LV遞送系統(tǒng)的快速發(fā)展，其開發(fā)起源于克服逆轉錄病毒不能轉導非分裂細胞(non diving cell)的需要。具體地講，自失活(SIN)轉移載體的產生使得在人類臨床試驗中大量使用LV的前景更可行\(zhòng)只要發(fā)展和優(yōu)化同樣有效的制備方法。然而，與通過若干人類和鼠的市售包裝細胞系就可制備的Y RV相反，不僅用于研究級、而且用于GMP級的目前的LV生產幾乎都通過瞬時轉染。該技術昂貴，難以標準化和規(guī)模化并且需要大量下游驗證試驗。此外，與穩(wěn)定生產相比，在瞬時生產期間可能通過包裝和轉移載體構建體中病毒序列間的重組而產生的復制型慢病毒(RCL)的風險，是雖罕見但可能性較高的事件。用于LV的與逆轉錄病毒等效的穩(wěn)定包裝細胞系的開發(fā)變得更緩慢和更困難，因為，與Y逆轉錄病毒相反，慢病毒蛋白例如env、蛋白酶和某些輔助蛋白的表達對于人體細胞而言是有毒的。為了克服該問題，在包裝細胞的很早期形式中存在的輔助基因，之后在最新一代中被去掉。第一代基于SIV和HIV的LV包裝細胞系得自猴Vero，或人C0S、HeLa和293的貼壁細胞2_5，其經工程化具有攜帶極少關鍵性修飾的慢病毒基因組，例如除去了包裝信號。事實上gpl20 env和大部分輔助基因都保留下來。所得LV滴度非常低2_5，而且更重要的是這些載體的可能應用必定限制在⑶4+ T細胞，對于抗AIDS基因治療方法而言。隨后，gpl20 env被來源于皰疹性口炎病毒的糖蛋白(VSV-G)取代并且去掉了所有輔助基因，因為已經證明對于有效LV制備而言是可有可無的。為了避免對VSV-G也描述過的毒性，通過各種不同系統(tǒng)，例如Tet、脫皮素、Rev以及Tet和cumate的組合,有條件地誘導其表達
6。同樣，為了在克隆選擇期間降低病毒蛋白酶的毒性效應，已經描述了經Tet以及強力霉素和cumate藥物組合誘導的gag-pol基因的有條件的表達6。在所有這些系統(tǒng)中,通過質粒DNA瞬時轉染而整合gag-pol基因、rev基因和env基因,然后藥物選擇和細胞克隆。為了實現真實的穩(wěn)定包裝細胞系的一個關鍵性問題就是選擇最好的病毒基因遞送載體。大部分研究人員通過質粒DNA瞬時轉染而整合gag-pol基因、rev基因和env基因，然后藥物選擇和細胞克隆2Λ已知該技術隨時間推移而遭受基因沉默和基因損失1(|，這二者均可危害包裝克隆的長期穩(wěn)定性。已經公開了替代的基因遞送載體，尤其是在STAR11和在新近開發(fā)的GPRG-TL-2012包裝細胞系中，其中通過MLV-穿梭載體將gag基因、pol基因和rev基因整合到HEK293T細胞中。2拷貝重新編碼的gag-pol基因穩(wěn)定地整合在STAR中，而對于GPRG-TL-20則沒有這類信息12。與轉染env基因的STAR相反，在GPRG-TL-20中所有殘留病毒基因都通過SIN-MLV而引入。存在若干系統(tǒng)，允許外源基因組穩(wěn)定整合到宿主細胞中。Palombo等，199813公開了雜合桿狀病毒-AAV載體，用于專門整合到宿主細胞中。這樣的載體看來非常有效，如果它在同一雜合桿狀病毒-AVV載體中包含r印基因的話。該文獻中未提到本發(fā)明的構建體，更別說提出使用這類系統(tǒng)用于LV生產了。在過去的大約20年里，進行了若干嘗試以產生穩(wěn)定的LV包裝細胞系。盡管公開了不同技術，但目前在臨床試驗中都未使用這些包裝細胞系，也沒有上市。因此需要用于大規(guī)模生產LV的新系統(tǒng)，其是產能有效的并且是安全、成本效果劃算和可重復的。發(fā)明概沭
本發(fā)明涉及LV生產領域。若干基因治療的臨床試驗正在進行中，使用LV作為基因遞送載體。在所有這些試驗中，LV的生產仍然基于瞬時方案。本發(fā)明提供了產生基于Hiv-1的包裝細胞系的新策略。這樣的策略是基于使用:雜合載體，其包含含有 側翼為AAV反向末端重復序列(ITR)的整合盒的桿狀病毒骨架，即所謂的baculo-AAV雜合系統(tǒng)；以及編碼rep蛋白的質粒。該系統(tǒng)允許獲得HIV-1結構蛋白和調控蛋白gag/pol和rev的穩(wěn)定整合。本發(fā)明的系統(tǒng)包括a) baculo-AAV雜合載體，其特征在于它含有2個表達盒，一個編碼慢病毒gag基因和pol基因，另一個編碼慢病毒rev基因和選擇標記，和b)編碼rep蛋白的質粒。所提出的系統(tǒng)代表遞送HIV結構蛋白和調控蛋白的一種新的有利方式，以便用慢病毒結構蛋白穩(wěn)定而有效地改造宿主細胞。使用該系統(tǒng)，獲得僅包含HIV結構蛋白和調控蛋白gag/pol和rev的第一中間體,用于半穩(wěn)定LV生產，或作為起點，以得到任選包含調控蛋白(Tat)和目標包膜蛋白的第2代和第3代包裝細胞系，以及也包含轉移載體的生產用細胞系。第一中間體攜帶以三-順反子構型表達Hiv-1 gag-pol基因和rev基因的2拷貝重組baculo-AAV包裝構建體。這樣的中間體被稱為PK-7并在實施例中稱為PK-7。已知是ITR-介導的AAV載體整合所必需的AAV Rep78蛋白的瞬時表達促進了 baculo-AAV包裝載體的基因組整合14。這樣的第一中間體對于I年培養(yǎng)物而言顯示出具有令人吃驚的遺傳穩(wěn)定性，證明在殘留遺傳元件的瞬時轉染之后的功能性LV的連續(xù)生產。另外，在這類細胞中未觀察到沉默現象。此外，通過對非編碼的基因間轉錄活性區(qū)中的2個串聯整合的包裝AAV載體的整合位點的精確作圖，我們提供了針對可能的危險基因激活的安全性理由，所述危險基因的mRNA可結合到LV中并最終結合到宿主靶細胞中。已開發(fā)的基于使用雜合baculo-AAV載體而用于慢病毒gag-pol和rev穩(wěn)定表達的包裝系統(tǒng)被稱為“MolPack”。本發(fā)明所用的表達系統(tǒng)有利地允許僅在一輪轉染和克隆中穩(wěn)定而安全地引入HIV的結構蛋白(gag/pol)和調控蛋白(rev)。目前用于臨床試驗的LV生產仍然是基于所有所需蛋白的瞬時轉染。相比之下，用本發(fā)明表達系統(tǒng)得到的中間體是穩(wěn)定的，不表現出沉默現象，允許開發(fā)LV的半穩(wěn)定生產并具有經濟上的強大優(yōu)勢。事實上，半穩(wěn)定生產需要減少數量的所轉染的構建體，就可獲得終產物。另外，也引人注目地發(fā)現，使用本發(fā)明的半穩(wěn)定生產，僅用瞬時轉染生產中所用DNA量的三分之一就足以得到具有與瞬時產生LV的滴度類似的滴度的LV。此外，減少數量的所轉染的構建體，減少了 RCL形成的重組事件的可能性，因此使慢病毒顆粒生產更安全。因此，本發(fā)明的表達系統(tǒng)、半穩(wěn)定包裝細胞系和生產方法對于目前用于臨床試驗的工具和方法而言非常有利。發(fā)明敘述
依照本發(fā)明的第一方面，提供用于慢病毒結構蛋白和調控蛋白的穩(wěn)定表達的系統(tǒng)，其由以下組成:1.雜合載體，其包含含有側翼為AAVITR并包含2個表達盒的整合盒的桿狀病毒骨架，其中第一表達盒編碼慢病毒gag 基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記，和
i1.含有處于啟動子控制之下的AAVrep可讀框(ORF)的表達質粒。優(yōu)選所述雜合載體的2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅動，優(yōu)選所述啟動子選自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV，更優(yōu)選所述啟動子是CMV IE啟動子。優(yōu)選所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因，更優(yōu)選所述選擇標記是潮霉素抗性基因。更優(yōu)選所述選擇標記是克隆在內部核糖體進入位點(IRES)下游。依照本發(fā)明另一方面,提供由穩(wěn)定表達慢病毒gag、pol和rev的細胞組成的半穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系，其特征在于這類細胞含有穩(wěn)定整合到其基因組中的側翼為AAV ITR并包含2個表達盒的至少一個拷貝的整合盒，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記。優(yōu)選所述細胞是優(yōu)選選自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080 或 HeLa的人細胞系，更優(yōu)選所述細胞系是HEK293-T。優(yōu)選所述2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅動；優(yōu)選所述啟動子選自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV，更優(yōu)選所述組成型啟動子是CMV IE啟動子。優(yōu)選所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因；更優(yōu)選所述選擇標記是潮霉素抗性基因。更優(yōu)選所述選擇標記是克隆在IRES下游。優(yōu)選所述AAV rep蛋白選自rep78或rep68。更優(yōu)選rep蛋白是rep78。依照另一方面，提供產生慢病毒載體的方法，其包括:1.培養(yǎng)由穩(wěn)定表達慢病毒gag、pol和rev的細胞組成的半穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系，其特征在于這類細胞含有穩(wěn)定整合到其基因組中的側翼為AAV ITR并包含2個表達盒的至少一個拷貝的整合盒，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記，i1.在所述半穩(wěn)定包裝細胞系中插入env基因，
ii1.在所述半穩(wěn)定包裝細胞系中插入轉移載體。優(yōu)選所述2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅動；優(yōu)選所述啟動子選自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV，更優(yōu)選所述組成型啟動子是CMV IE啟動子。優(yōu)選所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因；更優(yōu)選所述選擇標記是潮霉素抗性基因。更優(yōu)選所述選擇標記是克隆在IRES下游?？墒褂肁AV載體、逆轉錄病毒載體、穩(wěn)定質粒整合或同源重組，將包膜蛋白插入到宿主細胞中。優(yōu)選使用質粒，通過瞬時轉染而插入env基因。優(yōu)選所述env基因選自VSV-G env、MLV 4070 env、RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114pro、桿狀病毒GP64 env或GALV env或其衍生物，更優(yōu)選所述env基因是編碼RD114-TR的基因。優(yōu)選用SIN慢 病毒載體插入所述轉移載體。發(fā)明詳沭
將以非限制性實施例的方式描述本發(fā)明優(yōu)選特征和實施方案的詳細描述。除非另有說明，否則本領域技術人員可使用化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規(guī)技術將本發(fā)明付諸實施。所有這些技術都是已發(fā)表的文獻中公開的和解釋過的。參見例如J.Sambrook, E.F.Fritsct^PIT.Maniatis, 1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,第 1-3 部,Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Ausubel, F.M.等(1995 和定期增刊；Current Protocols in Molecular Biology,第 9，13和 16章，John Wiley & Sons, New York, N.Y.) ；Current Protocols in Immunology,第 12章，John Wiley & Sons, New York, N.Y.) ；B.Roe, J.Crabtree和A.Kahn, 1996,DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons ；J.M.Polak和 James 0’D.McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice ；Oxford University Press ；M.J.Gait (編著)，1984, Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach, IrI Press;以及，D.M.J.Lilley 和 J.E.Dahlberg, 1992,Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis ofDNA Methods in Enzymology, Academic Press。所有這些出版物都通過引用而結合。Baculo-AAV 雜合系統(tǒng)
本發(fā)明提供用于產生基于HIV-1的包裝細胞系的新策略。LV生產系統(tǒng)的優(yōu)化是基于LV技術的基因治療藥物開發(fā)所需要解決的一個關鍵性問題。盡管越來越多的臨床試驗使用該技術，但是在這些試驗中LV仍然是使用瞬時轉染方案而產生的。按此方式，LV的生產仍然非常昂貴，不能令更大量患者滿意。為此，進行了大量努力以開發(fā)用于LV的穩(wěn)定包裝細胞系。在穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系開發(fā)中的一個關鍵性問題就是選擇正確的載體，用于改造宿主細胞。在很多情況下，用質粒來改造宿主細胞，但在這種情況下，還觀察到基因組不穩(wěn)定和基因沉默現象。在另外兩種情況下，逆轉錄病毒載體用于穩(wěn)定整合gag/pol基因和rev基因。迄今為止所開發(fā)的穩(wěn)定包裝細胞系都未用于臨床。本發(fā)明的策略是基于使用穩(wěn)定表達慢病毒的HIV結構蛋白和調控蛋白的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)由以下組成:雜合載體，其包含含有側翼為AAV ITR并包含2個表達盒的整合盒的桿狀病毒骨架，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記；以及含有處于啟動子控制之下的AAV rep ORF的表達質粒。桿狀病毒骨架的存在允許攜帶大而復雜的整合盒，所述整合盒包含編碼若干不同蛋白的2個表達盒。所得baculo-AAV包裝載體允許僅通過一次感染事件就用穩(wěn)定而有效產生LV所需的病毒蛋白來改造宿主細胞。通過AAV rep蛋白的瞬時表達而獲得baculo-AAV包裝載體的基因組整合。該系統(tǒng)允許獲得在非編碼的基因間轉錄活性區(qū)中的AAV載體的整合，因此排除了危險基因的激活，所述危險基因的mRNA可結合到LV中并最終結合到宿主靶細胞中。所提出的系統(tǒng)代表用慢病毒結構蛋白和調控蛋白穩(wěn)定而有效地改造宿主細胞的一種新的有利方式。在一個優(yōu)選的實施方案中，baculo-AAV包裝構建體中包含的2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅動，優(yōu)選所述啟動子選自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV，更優(yōu)選所述啟動子是CMV IE啟動子。依照本發(fā)明的優(yōu)選方面，AAV包裝載體中包含的選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因；優(yōu)選所述標記是潮霉素抗性基因；更優(yōu)選所述選擇標記是克隆在IRES下游。通過AAV Rep蛋白的瞬時表達而獲得baculo-AAV包裝載體的基因組整合,用于ITR-介導的AAV載體整合。在一個優(yōu)選的實施方案中，r印蛋白選自r印78和r印68，更優(yōu)選所述蛋白是rep78。使用該系統(tǒng),可獲得經改造而穩(wěn)定表達HIV-1蛋白gag/pol和rev的細胞,這類細胞稱為半穩(wěn)定包裝細胞系。具體地講，本發(fā)明公開并要求保護這樣的經改造的細胞以及它們在半穩(wěn)定LV生產中的用途。半穩(wěn)定包裝細胞系
本發(fā)明的半穩(wěn)定包裝細胞系由攜帶表達HIV-1 gag-pol基因和rev基因的至少一個拷貝的重組baculo-AAV包裝構建體的宿主細胞組成。通過AAV rep蛋白的瞬時表達而得到baculo-AAV包裝載體的基因組整合，以獲得ITR-介導的AAV載體整合。優(yōu)選所述2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅動,優(yōu)選所述啟動子選自CMV、CMVIE、PGK、SV40、eFl α、SFFV和RSV。更優(yōu)選所述組成型啟動子是CMV IE啟動子。依照本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因；優(yōu)選所述選擇標記是潮霉素抗性基因。更優(yōu)選所述選擇標記是克隆在IRES下游。優(yōu)選所述AAV rep蛋白選自rep78和rep68。更優(yōu)選rep蛋白是rep78?？山浉脑於玫桨敕€(wěn)定包裝細胞系的宿主細胞系是選自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080或HeLa的人細胞系，更優(yōu)選所述細胞系是HEK293-T。這樣的半穩(wěn)定包裝細胞系適合于利用半穩(wěn)定生產系統(tǒng)中的不同env和不同轉移載體輸出可能的多種LV。因此，它代表了更有效的LV生產的極大優(yōu)勢，因為它允許降低成本，它無需使用編碼gag-pol和rev的GMP級的質粒DNA,并且降低了瞬時轉染期間質粒間重組事件所致的RCL形成的風 險。半穩(wěn)定包裝細胞系是一種通用工具，并且與目前用于臨床試驗的其它工具相比，用于LV生產更安全而經濟。本發(fā)明的半穩(wěn)定包裝細胞系對于I年培養(yǎng)物而言顯示出具有令人吃驚的遺傳穩(wěn)定性，證明在殘留遺傳元件的瞬時轉染之后的功能性LV的連續(xù)生產。另外，事實上未觀察到沉默現象，用該中間體而得到的LV的滴度和感染性在I年之后仍然未受影響。在選擇壓力存在或不存在的情況下都證實了這樣的數據。值得注意的是，對于AAV-1TR介導的盒的整合穩(wěn)定性而言，文獻中沒有可用的類似數據。唯一相關的信息是感染了野生型AAV血清型2 (AVV-2)的人骨髓衍生的成纖維細胞樣細胞系(Ruddle’s Detroit 6細胞)以潛伏狀態(tài)保持病毒序列達至少47和118代。正如實施例所示，本發(fā)明的半穩(wěn)定包裝細胞系存活至少102代。因此，本發(fā)明提供LV的生產方法，其包括:1.如上所述地培養(yǎng)半穩(wěn)定包裝細胞系，
i1.在所述半穩(wěn)定包裝細胞系中插入env基因，
ii1.在所述半穩(wěn)定包裝細胞系中插入轉移載體?？墒褂肁AV載體、逆轉錄病毒載體、穩(wěn)定質粒整合或同源重組，將包膜蛋白插入到宿主細胞中。優(yōu)選使用質粒，通過瞬時轉染而插入env基因。優(yōu)選所述env基因選自VSV-G env、MLV 4070 env、RDl 14 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114pro、桿狀病毒GP64 env或GALV env或其衍生物。更優(yōu)選本發(fā)明使用嵌合包膜蛋白RD114-TR env，其中RD114的胞質尾已被MLV包膜的胞質尾替代。優(yōu)選用SIN-LV插入所述轉移載體。本發(fā)明的半穩(wěn)定包裝細胞系能夠生產LV，按照感染性來說其在“質量上”等同于通過瞬時轉染而產生的那些。在LV半穩(wěn)定生產應用中要考慮的一個非常重要的問題是半穩(wěn)定包裝細胞系不丟失容易轉染的能力。事實上，以親代細胞系HEK293T的同樣水平，轉染PK-7細胞。該特征在用包裝構建體對HEK293細胞進行遺傳修飾和克隆之后經常丟失。相比之下，在本發(fā)明中用于gag/pol和rev穩(wěn)定整合的表達系統(tǒng)對于半穩(wěn)定包裝細胞系轉染性而言不導致任何問 題。此外，半穩(wěn)定包裝細胞系及其在LV生產方法中的用途對于生產成本而言具有重要優(yōu)勢。具體地講，對于第2代LV生產而言，僅需要3個額外構建體，例如質粒(各自編碼tat、env和轉移載體)，或者對于第3代LV生產而言，僅需要2個構建體(各自編碼env和轉移載體)。相比之下，目前用于臨床試驗的GMP方法除了用于本發(fā)明半穩(wěn)定包裝細胞系的那些之外，還需要使用2個額外構建體,分別編碼gag/pol和rev。此外，減少數量的用本發(fā)明方法和工具轉染的構建體，也代表了額外優(yōu)勢，對于LV的安全性而言，如上所述。此外，還顯而易見地發(fā)現，使用本發(fā)明的半穩(wěn)定生產，僅用瞬時轉染生產中所用DNA總量的三分之一就足以得到具有與瞬時產生慢病毒滴度類似的滴度的慢病毒。因此，本發(fā)明的表達系統(tǒng)、半穩(wěn)定包裝細胞系和生產方法對于目前用于臨床的工具和方法而言非常有利。附圖描沭


圖1.RD-MolPack的開發(fā)流程。(a)用于該研究的DNA質粒示意圖。pPolh,多角體蛋白啟動子；attBl，連接B1;ITR，反向末端重復序列；CMV，巨細胞病毒啟動子；In，內含子；RRE，rev應答元件；A，多聚A序列；IRES，內部核糖體進入位點；SD，剪接供體；SA,剪接受體；Ψ，包裝信號；WPRE，土撥鼠肝炎轉錄后調節(jié)元件；cPPT，中央聚嘌呤序列(central polypurine tract) ；hPGK,人磷酸甘油激酶啟動子。(b) AAV-GPR載體的R印78-介導的基因組整合的圖。AAV Rep78促進了側翼為ITR的AAV-GPR盒的切除并有利于其整合到人染色體中。(c)半穩(wěn)定包裝細胞系的生產流程圖。G0I，目標基因。圖2.PK克隆的表征。(a) AAV-GPR載體整合的DNA印跡分析。為了確定盒的拷貝數和完整性，將來自PK克隆的基因組DNA (10 μ g)分別用2種不同限制酶漢3M1I和5^BI消化。(b)從GPR盒產生的病毒蛋白的蛋白印跡分析。左圖，將得自PK克隆的細胞提取物(50 μ g/道)與識別HIV-1蛋白的抗HIV人血清雜交。然后將膜與抗rev特異性Ab雜交。右圖，與細胞提取物相同地，對產自PK克隆的病毒樣顆粒(VLP)的30 ng p24gag-等同物(equivalent)進行處理。(C)通過LM-PCR技術對GPR-盒整合進行示意性作圖，該技術鑒定2號染色體長臂在2q32.1位置上的DNA斷裂點。(d) AAV-GPR盒和人Hox4基因共定位到2號染色體中。進行PK-7中期染色體原位雜交，分別使用gag-特異性(紅色)探針和Hox4-特異性(綠色)探針。(e)在PK-7克隆中的2個GPR整合盒的重排和它們的尾-頭方向的示意圖。圖3.關于baculo-AAV-GPR和Rep78的可能整合的對照實驗。(a)重組桿狀病毒-AAV DNA的DNA印跡分析。從桿狀病毒顆粒中提取DNA，用限制酶消化過夜，印跡之后，用11-kb GPR盒特異性探針來探測。將Entry-GPR質粒(I pg)和桿狀病毒空DNA (100ng)上樣，分別作為陽性和陰性對照。(b)檢測整合到PK-7細胞中的推定的殘余r印78質粒DNA。進行R印78特異性PCR，使用PK-7基因組DNA作為樣品模板，使用CMV_r印78 (IPg)質粒作為陽性對照。
實施例實施例1:通用方法 質粒
通達Mlul/Narl和Mlu/Not\消化，分別從pCG719_pKLgagpol質粒(以下簡稱CMV-GPR)(圖1a,圖例9)和pCG720_pKrev質粒(CMV-Rev)(圖1a,圖例5)切下野生型HIV-1 gag基因、pol基 因和rev基因25。在2個不同的表達盒中以尾-尾的方向將病毒基因插入到 Gateway pENTR 4 穿梭載體(Invitrogen, C0., Carlsbad, CA)中，每個盒都由CMV IE啟動子驅動并攜帶多聚A序列。第一盒表達gag基因和pol基因，而第二盒表達rev基因和選擇標記潮霉素抗性(hygro)基因；hygro是克隆在IRES下游，以允許雙-順反子翻譯。將2個表達單元引入攜帶有感染性AAV基因組的重組pSUB201質粒的ZhI位點中 1 。再切下所得 5’ ITR-CMV-gagpol-polyA-polyA-hygro-1RES-rev-CMV_ITR3’盒并插入到 Gateway pENTR 4 穿梭載體(Invitrogen, C0., Carlsbad, CA)中。通過含有 2 個盒的pENTR 4穿梭進入載體和BaculoDirect Linear DNA (BaculoDirect 桿狀病毒表達系統(tǒng)，Invitrogen, C0.)之間的曬菌體λ位點-特異性重組系統(tǒng),獲得重組雜合baculo-AAV包裝載體(baculo-AAV-GPR)(圖la，圖例I)。在同源重組期間，桿狀病毒DNA的多角體蛋白基因因此被GPR雙盒取代。如Recchia等，200418所述，通過克隆處于表達載體pABS.43的CMV IE啟動子之下的AAV-r印78 0RF,得到pABCMV-r印78表達質粒(CMV_AAV_r印78)(圖la，圖例4)。pMD.G質粒(CMV-VSV-G)19編碼皰疹性口炎包膜糖蛋白(VSV-G)(圖1a,圖例 6)。第 3 代轉移載體 pCCLsin.PPT.hPGK.eGFP.WPRE.Amp (SIN-eGFP)2° 表達處在組成型啟動子hPGK之下的eGFP基因(圖la，圖例2)。表達抗HIV-1 Chim3轉基因的第2代？八^(31加3轉移載體描述于？01^^111111等，2009 & 201021’22 (圖1a,圖例3)。PCMV-RD114-TR (CMV-RD114-TR)(圖1a,圖例7)質粒編碼嵌合RD114-TR包膜，其由貓科內源逆轉錄病毒RD114包膜的胞外和跨膜結構域以及A-MLVenv 4070A的胞質尾(TR)構成23O第2代包裝PCMV- Δ R8.74 (CMV-GPRT)構建體(圖1a,圖例8)編碼HIV-1 gag基因、pol基因、rev基因和tat基因19。細胞
在27°C,在不存在CO2的條件下,將草地貪夜蛾{Spodoptera frugiperda, Sf9)昆蟲細胞(Invitrogen, C0.)懸浮培養(yǎng)在補充有10% FCS (EuroClone Ltd, UK)和青霉素-鏈霉素和谷氨酰胺組合(PSG)的TC-100培養(yǎng)基(Invitrogen，C0.)中。將人胚腎293T(HEK293T)細胞及其衍生克隆(PK-7)在補充有10% FCS和PSG的Dulbecco氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中繁殖。將CEM A3.01和SupTl T類淋巴母細胞在補充有10% FCS和PSG的RPMI 1640 中培養(yǎng)。從在 Ficoll-Hypaque 梯度(Lymphoprep, Nycomed Pharma AS, Oslo,Norway)上離心的臍帶血(UCB)中純化⑶34+造血干細胞(HSC)和新生兒白細胞。經梯度分離之后，從收集的UCB單核細胞環(huán)中通過陽性選擇，使用⑶34 MicroBeads試劑盒和MiniMACS Separator 柱(Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA),分離 CD34+ HSC。通過 FACS分析(FACSCalibur BD Bioscience, San Jose, CA)和 FlowJo 軟件(Tree Star, Inc.,Ashland, OR),使用抗CD34-PE Ab (BD Pharmingen , San Diego, CA),測定 CD34+細胞純度(>92%)。在含有人干細胞因子(h-SCF) 100 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN)、h_Flt3L 100 ng/ml (Peprotech, Rocky Hill, NJ)、h_IL_6 20ng/ml (R&D Systems)和人血小板生成素(h_Tpo) 20 ng/ml (Peprotech)的20%血清Iscove氏改良Dulbecco氏培養(yǎng)基(IMDM)中，對CD34+細胞預刺激24小時，并在轉導期間維持在同一培養(yǎng)基中。用可溶性抗人 CD3 (30 ng/ml) (Orthoclone OKT3, Janssen-Cilag, UK)和重組人 IL-2 (rhIL-2)50 U/ml (Chiron, Emeryville, CA)的RPMI對新生兒白細胞刺激48小時，然后將其保持在補充有10% FCS、PSG和rhIL-2的RPMI中。HEK293T細胞的桿狀病毒生產和桿狀-GPR感染
按照 BaculoDirect 方法，使用 Gateway adapted 桿狀病毒 DNA 系統(tǒng)(Invitrogen,C0.)，產生攜帶重組雜合baculo-AAV-GPR DNA基因組的桿狀病毒。通過噬斑測定評價重組桿狀病毒滴度，病毒在Sf9細胞中擴增3代之后相當于I X IO11 pfu/ml。通過用4 μ g AAV-r印78表達質粒轉染1.5 X IO6 HEK293T細胞并在24小時之后用重組baculo-AAV-GPR以1，000的MOI感染而得到PK-7克隆。在沒有潮霉素時將細胞維持4天，然后在潮霉素(100 μ g/ml)存在下，以系列稀釋濃度，將5 X IO5細胞接種在22個10_cm皿中。通過ELISA對22個皿篩選p24gag的產生。僅有以3.7 X IO4細胞/皿接種細胞的一個皿在上清液中釋放出足夠的p24gag。該皿含有40個集落，將其全部挑取出來并篩選。它們中的3個記為p24gag產生陽性，對其進行進一步表征。慢病毒載體(LV)的產生和測定
通過以下質粒的瞬時共轉染，獲得從HEK293T細胞產生的假型LV:包裝構建體CMV-GPR(第3代)[或CMV-GPRT (第2代)],VSV-G或RDl 14-TR包膜構建體和第3代SIN-eGFP24或第2代PAN-Chim3轉移載體21。包裝:包膜:轉移載體比例為6.5:3.5:10 μ g DNA,除非另有說明。通過表達env的質粒和轉移載體的共轉染，從PK-7克隆產生LV。用標準Ca++-磷酸鹽方法或Fugene 6系統(tǒng),按照制造商的說明(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis, IN)進行瞬時轉染，得到類似結果。轉染后48小時收獲上清液并通過
0.45-μ m濾器過濾。根據實驗類型，對SupT1、CEM A3.01、原代活化外周血單核細胞(PBMC)和臍帶血衍生的CD34+ HSC計算滴度。簡而言之，通過由過夜靜止階段分開的2次循環(huán)的離心接種(I, 240 X g , I 小時)，在 polybrene (8 μ g/ml) (Sigma-Aldrich, St Louis,MO)存在下，轉導SupTl和活化的原代單核細胞；將⑶34+ HSC在不含polybrene的包被retronectin 的板(Takara Bio, Otsu, Japan)上轉導 24 小時。通過 eGFP表達(SIN-eGFP)或 ALNFGR 表達(P Δ N-Chim3)的流式細胞術分析(FACS Calibur BD Bioscience, SanJose, CA)監(jiān)測轉導效率，如Porcellini 等，2009 & 201021’22所述，使用 FlowJo 軟件(TreeStar, Inc., Ashland, OR)。僅范圍5-20%陽性細胞的轉導值用于計算每種LV制備物的滴度，按照以下公式:TU =[細胞數X (% GFP/100) ]/上清液體積(以ml計)。DNA印跡測定
通過QIAamp Mini試劑盒(QIAGEN GmbH, Germany),按照制造商的說明，分離基因組DNA (gDNA)。通過QIAamp DNA micro試劑盒(QIAGEN)從病毒顆粒中提取桿狀病毒DNA。用指定限制酶消化過夜之后，將10 Ug gDNA在0.8%瓊脂糖凝膠上運行，通過DNA印跡毛細管轉移到尼龍膜(Duralon, Stratagene, TX, USA)上，然后雜交到 I X IO6 dpm/ml 32P-隨機引物標記的600-bp CMV或11-kb GPR盒。分析性PCR分析
對300 ng基因組gDNA進行PCR分析，用于篩選殘余整合到PK-7細胞中的AAV_Rep78質粒，使用一組引物:AAV-Rep78 正向:5，-CGG GCT GCT GGC CCA CCA GG-3，；AAV-Rep78反向:5’ -ATG CCG GGG TT T TAC GAG ATT GTG-3’ 和以下 PCR 條件:98°C 7 分鐘，30 個循環(huán)的 94°C 30 秒，66°C 30 秒，和 72°C1.5 分鐘。為了確定2個GPR盒的方向，對300 ng gDNA進行PCR擴增，使用一組引物:rev正向:5’ - CTT GAG GAG GTC TTC GTC GC-3’ ；β-球蛋白反向:5’ - CCC TGT TAC TTCTCC CCT TCC -3’ ；rev 正向巢式:5’ - TGT CTC CGC TTC TTC CTG CC-3’ ；β-球蛋白巢式反向:5’ - TTA ACC ATA GAA AAG AAG GGG-3’和以下條件:94°C 2分鐘，35個循環(huán)的940C 30 秒，52。。30 秒，和 72°C1.5 分鐘。p24gag ELISA
使用 Alliance HIV-1 p24 抗原 ELISA 試劑盒(Perkin Elmer Life and AnalyticalSciences, Inc.Waltham, MA)，按照制造商的說明，在培養(yǎng)上清液中測量實際的LV生產，假定I Pg p24gag相當于I X IO4實際的顆粒。蛋白印跡分析
如前所述A22，制備來自PK-7細胞的全細胞提取物和核提取物以及來自分離的無細胞VLP或LV的病毒蛋白。通過SDS-PAGE將蛋白按大小分級，并且電印跡到Hybond ECL硝基纖維素膜(GE Healthcare, Life Sciences, UK Ltd, UK)。將膜在5%低脂奶粉中封閉，然后與合適的第一 Ab—起溫育。使用得自AIDS患者的1: 2，000稀釋度的抗HIV血清；1:200稀釋度的 HIV-1 rev MoAb (Rev-6, sc-69730 S.Cruz Biotechnology, Inc., S.Cruz,CA)。通過增強化學發(fā)光系統(tǒng)ECL (ECL, Amersham),按照制造商的說明，顯示Ab結合。
通過實時TaqMan PCR對LV DNA拷貝數進行定量測定
通過定量 TaqMan PCR,使用 ABI Prism 7, 900 FAST 儀器(Applied Biosystems,Foster City, CA)確定整合GPR載體的拷貝數，并通過SDS 2.3軟件(AppliedBiosystems)進行分析。擴增基因組DNA (gDNA),使用以下引物和來源于gag基因的探針:正向:5，-ACA TCA AGC AGC CAT GCA AAT-3，;反向:5，-ATC TGG CCT GGT GCA ATAGG-3，；探針:FAM 5，-CAT CAA TGA GGA AGC TGC AGA ATG GGA TAG A_3，TAMRA。PCR 條件如下:50°C 2分鐘，95°C 5分鐘，接著是40個循環(huán)的95°C 15秒和60 V 15秒，增量為0.rc/循環(huán)。連接-介導的(LM) -PCR
通過QIAamp DNA Mini試劑盒(QIAGEN)，按照制造商的說明，從PK-7細胞中提取基因組DNA并用Bgl 11和BamHl在37 °C消化過夜。在標準條件下，對與5 ’ -GATC-3 ’粘性末端相容的人工接頭76-bp寡核苷酸接頭進行連接。進行LM-PCR，使用以下一對巢式引物:ITR正向:16s: 5’ -GTA GCA TGG CGG GTT AAT CA-3’，和 17s/長巢式:5’ -TTA ACT ACAAGG AAC CCC TAG TGA TGG-3，;接頭反向引物:接頭-1: 5，-GTA ATA CGA CTC ACT ATAGGG C-3’和接頭-2 巢式:5’-AGG GCT CCG CTT AAG GGA C-3’。接頭序列對應于 5’-GATCGT CCC TTA AGC GGA GCC CTA TAG TGA GTC GTA TTA CCA GGG AAT TCG CCT CGG GATATC ACT CAG CAT AAT G-3’。進行 2 輪 LM-PCR，使用 AmpliTaq Gold DNA 聚合酶(AppliedBiosystems)，每輪包括30個循環(huán)(95°C 30秒，52°C 30秒，72°C 2分鐘)?？寺CR擴增子，使用Τ0Ρ0 克隆試劑盒(Invitrogen, C0.)并選擇攜帶大約100-200-bp插入序列的質粒集落，用于測序。通過BLAST搜索(NCBI)鑒定序列同源性。熒光原位雜交(FISH)
用秋水仙素(10 μ g/ml) (Sigma # C9754)在37°C處理PK-7細胞2小時，得到中期染色體。經磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌之后，將細胞在低滲溶液(75 mM KCl)中在室溫下(RT)保持6分鐘，用甲醇/乙酸(3:1)洗滌4次而固定，然后鋪在干凈載玻片上。將細胞遺傳學樣品在70%甲酰胺溶液中在72°C變性2分鐘，經冷的70%、85%和95%乙醇連續(xù)洗滌而脫水，然后風干。特異性探針制備如下:將含有13-kb質粒DNA的GPR盒做上標記，使用隨機引物DNA標記試劑盒(Roche Applied Science, Indianapolis, IN),用 SpectrumOrange -dUTP(Vysis, Inc., Downers Grove, IL),同時將含有人基因的對照30_kb粘粒DNA做上標記，使用 FISHSrigAi 核酸標記試劑盒(Kreatech Biotechnology, Amsterdam, TheNetherlands)。通過將5 ng/μ I的各種探針在250 μ I 50%甲酰胺，2 X SSC和10%硫酸葡聚糖和50 ng/μ I的人CtlT-1 DNA雜交緩沖液(Invitrogen)中溫育而進行雜交。將樣品在75°C用變性探針包被10分鐘，覆蓋Parafilm M，并在37°C在濕室內溫育過夜。將樣品在0.4 X SSC (pH=7)中在72°C洗滌一次，達2分鐘，在含有0.0025%吐溫-20的4 XSSC (pH=7)中在室溫下洗滌一次，達30秒，然后在PBS I X中在室溫下洗滌2次，每次達I分鐘。將玻片用0.02 μ g/ μ I 49，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) (Sigma)進行復染色。用Nikon 80i正置顯微鏡(Nikon Instruments S.p.A., Italy)觀察并拍攝圖像，使用綠色(FITC)和光譜橙色(spectrum orange)濾光片照明。圖像用Genikon軟件(Nikon)處理。實施例11:第一中間體PK-7克降的產牛為了得到RD-MolPack包裝細胞系用于第2代或第3代LV的連續(xù)生產，獲得若干HEK293T-衍生的中間體克隆。第一個稱為PK-7，是通過重組雜合baculo-AAV載體(rhBacuΙο-AAV-GPR)的方式，通過HIV-1 gag基因、pol基因和rev基因的穩(wěn)定整合而獲得(圖la，圖例I)。該遞送系統(tǒng)利用瞬時提供的AAV-rep78蛋白整合酶活性，切取側翼為AAVITR的整合盒并將其整合到人染色體中(圖lb)。通過BaculoDirect Linear DNA和含有側翼為ITR的GPR盒的Gateway pENTR 4進入質粒之間的同源重組而產生rh-baculo-AAV載體(圖la，圖例I)。重組桿狀病毒在Sf9昆蟲細胞中擴增3輪(p3)之后，分別通過噬斑測定和病毒基因組DNA的DNA印跡檢查雜合baculo-AAV DNA的滴度和潛在重組事件。在P3的滴度相當于6 X 101° pfu/ml，DNA印跡分析顯示一條清晰條帶，表明在病毒擴增過程中沒有重組事件(圖3)。然后，仔細限定AAV_Rep78質粒轉染和rh-baculo-AAV感染的劑量和時間，以及感染的HEK293T細胞的克隆條件(圖lc)。事實上，對這些實驗設定的選擇證明是至關重要的。因此，在測試寬范圍的條件之后，最終確定在rh-baculo-AAV以1，000的MOI感染之前24小時，單劑量AAV-rep78質粒DNA轉染相當于最佳實驗設計。此外，觀察到在22個90_mm-培養(yǎng)皿中接種總共5 X IO5細胞 ，每皿接種不同濃度并且在接種后4天添加潮霉素100 μ g/ml，是收集最大數量細胞克隆的最佳條件。在360個已計數的克隆中僅有3個，PK-7、PK-17和ΡΚ-18,表達p24gag超過100 pg/ml的設定閾值?？寺〉腄NA印跡分析顯示出每個克隆含有2拷貝的大小正確的載體(圖2a)。為了排除殘留AAV-rep78質粒DNA的可能整合，對PK-7 gDNA進行rep78特異性PCR，檢測無陽性信號(圖3b)。通過釋放在培養(yǎng)基中的3個PK克隆及其匹配病毒樣顆粒(VLP)的蛋白印跡，監(jiān)測源自GPR盒的HIV-1蛋白表達模式。所有病毒蛋白都經過適當處理，大小正確并按正確的相對比例(圖2b)。選擇未來工作用PK克隆，即通過計算從這3個克隆中產生的LV對SupTl細胞的效力，在用VSV-G質粒和第3代轉移載體SIN-eGFP共轉染之后(表I)。值得注意的是，盡管經瞬時轉染而產生的對照HEK293T LV的滴度是PK-7和PK-18的LV滴度的5倍，但其感染性卻與PK LV的幾乎相同，表明就“質量”觀點來看，PK克隆產生的LV相當于經常規(guī)方法產生的那些(表I)。盡管PK-7和PK-18的LV的效力相似，但選擇PK-7克隆用于進一步遺傳操作，因為它的形態(tài)學、生長、存活率和p24gag生產值評分優(yōu)于PK-18克隆(表I)。表1.從PK克隆中產生的VSV-G假型LV的效力
權利要求
1.一種用于慢病毒結構蛋白和調控蛋白的穩(wěn)定表達的系統(tǒng)，其由以下組成: i.雜合載體，其包含含有側翼為AAVITR并包含2個表達盒的整合盒的桿狀病毒骨架，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記，和 i1.含有處于啟動子控制之下的AAV rep可讀框(ORF)的表達質粒。
2.權利要求1的系統(tǒng)，其中所述雜合載體的2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅動。
3.權利要求1或2的系統(tǒng)，其中所述啟動子選自CMV、CMVIE、PGK、SV40、eFl a、SFFV和 RSV。
4.權利要求1-3中任一項的系統(tǒng)，其中所述啟動子是CMVIE啟動子。
5.前述權利要求中任一項的系統(tǒng)，其中所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因。
6.權利要求5的系統(tǒng)，其中所述選擇標記是潮霉素抗性基因。
7.前述權利要求中任一項的系統(tǒng)，其中所述選擇標記是克隆在內部核糖體進入位點(IRES)下游。
8.前述權利要求中任一項的系統(tǒng)，其中所述rep蛋白是rep78。
9.一種由穩(wěn)定表達慢病毒gag、pol和rev的細胞組成的半穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系，其特征在于這類細胞含有穩(wěn)定整合到其基因組中的側翼為AAV ITR并包含2個表達盒的至少一個拷貝的整合盒，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記。
10.權利要求9的半穩(wěn)定慢病毒 包裝細胞系，其中所述細胞是選自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080 或 HeLa 的人細胞系。
11.權利要求9或10中任一項的半穩(wěn)定慢病毒包裝細胞系，其中所述2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅動。
12.權利要求9或11中任一項的半穩(wěn)定包裝細胞系，其中所述啟動子選自CMV、CMVIE、PGK、SV40、eFl α、SFFV 和 RSV。
13.權利要求12的半穩(wěn)定包裝細胞系，其中所述啟動子是CMVIE啟動子。
14.權利要求9-13中任一項的半穩(wěn)定包裝細胞系，其中所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因。
15.權利要求14的半穩(wěn)定包裝細胞系，其中所述選擇標記是潮霉素抗性基因。
16.權利要求9-15中任一項的半穩(wěn)定包裝細胞系，其中所述選擇標記是克隆在內部核糖體進入位點(IRES)下游。
17.一種用于產生慢病毒載體的方法，其包括:1.培養(yǎng)權利要求9-16中任一項的半穩(wěn)定包裝細胞系，ii.在所述半穩(wěn)定包裝細胞系中插入env基因， ii1.在所述半穩(wěn)定包裝細胞系中插入轉移載體。
18.權利要求17的方法，其中所述env基因選自VSV-Genv、MLV 4070 env、RDl 14env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114-pro、桿狀病毒GP64 env或GALV env或其衍生物。
19.權利要求17或18的方法，其中所述env基因是編碼嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。
全文摘要
本發(fā)明提供新的半穩(wěn)定包裝細胞系以及使用所述半穩(wěn)定包裝細胞系而產生慢病毒載體(LV)的方法。用baculo-AAV雜合系統(tǒng)產生本發(fā)明的新方法和包裝細胞系，用于慢病毒結構蛋白和調控蛋白的穩(wěn)定表達，所述系統(tǒng)包含含有側翼為AAVITR的整合盒的桿狀病毒骨架，以及編碼rep蛋白的質粒。該系統(tǒng)允許得到HIV-1的結構蛋白和調控蛋白gag/pol和rev的穩(wěn)定整合。所述系統(tǒng)允許得到包含HIV的結構蛋白和調控蛋白gag/pol和rev的細胞系，用于半穩(wěn)定LV生產。
文檔編號C12N15/867GK103080322SQ201180042482
公開日2013年5月1日 申請日期2011年9月1日 優(yōu)先權日2010年9月2日
發(fā)明者C.博沃倫塔, A.斯托爾納約洛, P.里扎爾迪, F.馬維利奧 申請人:莫爾梅德股份有限公司