專(zhuān)利名稱(chēng)：體細(xì)胞至誘導(dǎo)的重編程神經(jīng)干細(xì)胞(irNSC)的轉(zhuǎn)化的制作方法
體細(xì)胞至誘導(dǎo)的重編程神經(jīng)干細(xì)胞(irNSC)的轉(zhuǎn)化本申請(qǐng)涉及用于將體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)的方法。另外，本申請(qǐng)涉及基于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和化學(xué)上定義的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的關(guān)聯(lián)步驟，將人成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞或脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法。長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)普遍認(rèn)可了充分分化的體細(xì)胞具有絕對(duì)不可逆特性的學(xué)說(shuō)。當(dāng)一系列的先驅(qū)實(shí)驗(yàn)顯示可以通過(guò)不同對(duì)的細(xì)胞類(lèi)型融合完全再激活沉默的基因表達(dá)譜時(shí)，這種觀點(diǎn)開(kāi)始變化(BIau, H. M. How fixed is the differentiated state Lessonsfrom heterokaryons (分化狀態(tài)有多固定？來(lái)自異核體的教導(dǎo))· Trends Genet. 5,268-272(1989))。最近顯示，從一個(gè)體細(xì)胞類(lèi)型轉(zhuǎn)移核至去核卵細(xì)胞可能導(dǎo)致體細(xì)胞的基因表達(dá)譜完全回復(fù)并且導(dǎo)致能夠產(chǎn)生新的完整動(dòng)物的多潛能細(xì)胞狀態(tài)形成(參見(jiàn)例如 Gurdon, J. B.和 Melton, D. A. Nuclear reprogramming in cells (細(xì)胞中的核重編程)· Science322,1811-1815 (2008))。Yamanaka 和同事(Takahashi, K.和 Yamanaka,S.1nduction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblastcultures by defined factors (通過(guò)定義的因子從小鼠胚胎和成體成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞).Celll26，663-676 (2006))展示，可以通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)4種定義的因子(Sox2、0ct4、Klf4、c-Myc)，將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞(iPSCs)。已經(jīng)將不同類(lèi)型的體細(xì)胞(包括成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和脂肪細(xì)胞)重編程為iPSC多潛能狀態(tài)。在過(guò)去數(shù)年期間，出現(xiàn)以下問(wèn)題特定體細(xì)胞類(lèi)型是否可以轉(zhuǎn)分化成完全不同的體細(xì)胞類(lèi)型，如神經(jīng)元。Wernig和同事解決了這個(gè)問(wèn)題,顯示通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)3種關(guān)鍵基因Mashl、Brn2和MytlI,將小鼠成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為功能性神經(jīng)元(Wernig等人，Direct conversionof fibroblasts to functional neurons by defined factors (通過(guò)定義的因子將成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為功能性神經(jīng)元).Nature25 ; 463 (7284) :1035-41 (2010)。然而，所獲得的神經(jīng)元是根據(jù)定義不能夠增殖和無(wú)法承受冷凍和融化過(guò)程的有絲分裂期后細(xì)胞。US2010/0021437公開(kāi)了一種從 成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞并且誘導(dǎo)這些細(xì)胞以分化成神經(jīng)表型的方法。然而，迄今仍未描述將分化的體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化成神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞是多能干細(xì)胞并且據(jù)報(bào)道在特定條件下增殖。它們需要化學(xué)上定義的培養(yǎng)基，例如N2B27培養(yǎng)基(N2B27 是補(bǔ)充有 N2 和 B27( 二者均來(lái)自 Gibco))的 DMEM/F12 (Gibco, Paisley, UK)的1:1混合物，其補(bǔ)充有FGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2)和EGF(表皮生長(zhǎng)因子)。它們可以生長(zhǎng)為單層貼壁培養(yǎng)物，例如，在聚鳥(niǎo)氨酸/層粘連蛋白包被的板上，或在非貼壁細(xì)胞培養(yǎng)板中生長(zhǎng)為懸浮的神經(jīng)球。已經(jīng)報(bào)道兩種類(lèi)型的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)物(神經(jīng)球、貼壁培養(yǎng)物)是完全相互可轉(zhuǎn)化的。神經(jīng)干細(xì)胞可以無(wú)限地生長(zhǎng)并且仍保持真實(shí)多能性。在特定條件下，它們分化成構(gòu)成成體腦的細(xì)胞類(lèi)型，包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。將神經(jīng)干細(xì)胞視為用于治療患有神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病、中風(fēng)和脊髓損傷的患者的可能治療劑。已知可以在體外從胚胎干細(xì)胞(ESC)產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞(Chambers等人，Nature27 ；3(2009))或它們可以從腦樣品直接分離(Reynolds BA, Rietze RL(2005)Nat Methods2 333-336)。然而，迄今已知的這些方法具有許多重大缺點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兓蛘咭鸨姸喔叨让舾械膫惱韺W(xué)顧慮和/或它們需要復(fù)雜和費(fèi)力的技術(shù)，所述技術(shù)遭受?chē)?yán)重的重現(xiàn)性難題困擾。迄今未曾描述其中神經(jīng)干細(xì)胞可以直接源自分化的體細(xì)胞的方法。原則上，神經(jīng)干細(xì)胞可以從已經(jīng)源自分化細(xì)胞的iPSC獲得。然而，這將隱含意味著培養(yǎng)iPSC。已經(jīng)報(bào)道iPSC無(wú)限地?cái)U(kuò)增，但是培養(yǎng)條件復(fù)雜并且需要大量工作。另外，已經(jīng)報(bào)道從多潛能干細(xì)胞衍生神經(jīng)干細(xì)胞因隨機(jī)機(jī)制而不確定。iPSC和ESC的常見(jiàn)障礙是甚至少數(shù)的未分化細(xì)胞可能導(dǎo)致畸胎瘤(包含幾個(gè)細(xì)胞類(lèi)型的生殖細(xì)胞腫瘤)形成，這帶來(lái)不可能忽略的嚴(yán)重污染。體干細(xì)胞(如神經(jīng)干細(xì)胞)不形成畸胎瘤。因此，仍需要容易獲得和可重復(fù)的產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞的技術(shù)。本發(fā)明提供一種用于將體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化成神經(jīng)干細(xì)胞的方法。這種新方法減少獲得iPS細(xì)胞的必要性并且因此消除畸胎瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用，缺少畸胎瘤形成能力的這類(lèi)細(xì)胞是有用和安全的。優(yōu)選地所述體細(xì)胞是哺乳動(dòng)物體細(xì)胞，最優(yōu)選地是人體細(xì)胞。所述的人體細(xì)胞可以從健康個(gè)體或從患者獲得。所述體細(xì)胞優(yōu)選地是成纖維細(xì)胞、月旨肪細(xì)胞或角質(zhì)形成細(xì)胞，最優(yōu)選地是成纖維細(xì)胞。所述成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或角質(zhì)形成細(xì)胞可以容易地和安全地源自患者或健康個(gè)體，例如通過(guò)非侵入性方法如皮膚活組織檢查，或來(lái)自拔除的毛發(fā)。本發(fā)明的方法允許將源自健康或患病個(gè)體的體細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、月旨肪細(xì)胞或角質(zhì)形成細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化成神經(jīng)干細(xì)胞。這些健康個(gè)體或患者的特定神經(jīng)干細(xì)胞可以無(wú)限擴(kuò)增。培養(yǎng)是容易和充分表征的?？梢灾貜?fù)地冷凍和融化健康個(gè)體和患者的特定神經(jīng)干細(xì)胞等分試樣。具體而言，源自患者的神經(jīng)干細(xì)胞代表了研究CNS疾病的病理生理學(xué)的疾病相關(guān)性體外模型。將患者特異的體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞代表了一項(xiàng)產(chǎn)生患者特異的神經(jīng)干細(xì)胞生物樣品庫(kù)(BioBank)的容易獲得和可重復(fù)性技術(shù)。這類(lèi)生物樣品庫(kù)對(duì)于CNS相關(guān)疾病具有巨大相關(guān)性，因?yàn)樵趶纳窠?jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生的3個(gè)細(xì)胞類(lèi)型神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的至少一種中描述了清晰的病變。因此，用本文所述方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞是篩選有效和安全藥物的有價(jià)值疾病模型。多種神經(jīng)變性疾病以神經(jīng)元細(xì)胞喪失為特征。成體腦的再生能力在應(yīng)答于腦損傷和神經(jīng)變性疾病時(shí)相當(dāng)有限。另外，藥理學(xué)介入治療經(jīng)常日益變得更不有效，因?yàn)橐赘行陨窠?jīng)元群體進(jìn)行性喪失。用本文所述方法獲得的神經(jīng)干細(xì)也可以在再生醫(yī)學(xué)用來(lái)治療神經(jīng)變性疾病，如帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS/魯蓋瑞氏癥(ALS/Lou Gehrig' s Dise ase))或脊髓損傷。采用本文所述的創(chuàng)造性方法，現(xiàn)在可能提供足夠量的神經(jīng)元前體細(xì)胞用于細(xì)胞移植療法中。神經(jīng)干細(xì)胞可以從體細(xì)胞獲得，所述體細(xì)胞從健康個(gè)體或從患者分離。對(duì)于自體細(xì)胞移植療法而言，通過(guò)本文所述的方法獲得的患者特異的神經(jīng)干細(xì)胞是一個(gè)有吸引力的新供體源，從而消除因患者和供體之間的免疫不相容性所致的任何免疫排斥。這項(xiàng)策略將消除細(xì)胞移植療法中對(duì)免疫抑制劑的需求。另外，可以使用創(chuàng)建的源自健康個(gè)體的具有不同HLA純合等位基因的神經(jīng)干細(xì)胞生物樣品庫(kù)作為治療有需要的個(gè)體的供體庫(kù)。異種移植具有相容性HLA型的神經(jīng)干細(xì)胞降低不利免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，所述的不利免疫反應(yīng)可能導(dǎo)致對(duì)移植細(xì)胞的排斥。為實(shí)現(xiàn)這里所述的創(chuàng)造性突破，需要繞過(guò)重編程過(guò)程的一些現(xiàn)存局限性，以及需要將基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與采用特定培養(yǎng)基誘導(dǎo)的步驟組合。本文中提供了一種用于將體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)的方法，所述方法包括步驟
a)提供體細(xì)胞；b)通過(guò)導(dǎo)入至少兩個(gè)基因，將所述體細(xì)胞重編程為神經(jīng)干細(xì)胞；和c)用生長(zhǎng)因子和小分子誘導(dǎo)重編程。在又一個(gè)實(shí)施方案中，這種方法額外包括d)在適于神經(jīng)干細(xì)胞增殖的條件下孵育步驟b)和c)的產(chǎn)物。一般而言，步驟b)和c)的產(chǎn)物可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中容易地鑒定為神經(jīng)球。優(yōu)選地，適于增殖神經(jīng)干細(xì)胞的所述條件包含收獲所述神經(jīng)球并且在化學(xué)上定義的培養(yǎng)基中擴(kuò)增它們。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基是擴(kuò)增培養(yǎng)基(expansion medium)并且神經(jīng)球在非貼壁培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。擴(kuò)增培養(yǎng)基的非限制性實(shí)例在下文進(jìn)一步描述。術(shù)語(yǔ)“體細(xì)胞”如本文所用指形成生物本體的不是生殖系細(xì)胞(例如精子和卵細(xì)胞、產(chǎn)生它們的細(xì)胞(配子母細(xì)胞)和未分化干細(xì)胞的任何細(xì)胞。內(nèi)部器官、皮膚、骨、血液和結(jié)締組織均由體細(xì)胞構(gòu)成。用于本文所述的方法中的優(yōu)選體細(xì)胞是成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或角質(zhì)形成細(xì)胞并優(yōu)選地從皮膚活組織檢查樣品獲得。優(yōu)選地，用于轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞的體細(xì)胞是哺乳動(dòng)物來(lái)源的，最優(yōu)選地是人來(lái)源的。所述的人體細(xì)胞可以從健康個(gè)體或從患者獲得。優(yōu)選地，所述體細(xì)胞選自成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或角質(zhì)形成細(xì)胞。這些供體細(xì)胞可以容易地從任何適合的來(lái)源獲得。本文中優(yōu)選在不對(duì)人體進(jìn)行侵入性操作情況下允許分離供體細(xì)胞的來(lái)源。用于分離成纖維細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域熟知的。成纖維細(xì)胞可以從任何適合的來(lái)源獲得，例如來(lái)自多種器官組織或皮膚組織。優(yōu)選的成纖維細(xì)胞是肺成纖維細(xì)胞、包皮成纖維細(xì)胞和成人皮膚成纖維細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述人成纖維細(xì)胞從患者獲得，例如通過(guò)皮膚活組織檢查(例如，Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors (用定義的因子將人體細(xì)胞重編程為多能性)· George Q. Daley等人，Nature 2008 ；A methodfor the isolation and serial propagation of keratinocytes， endothelial cells，and fibroblasts from a sing`le punch biopsy of human skin (—種從人皮膚單次沖取活組織檢查樣品中分離并且連續(xù)增殖角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的方法)，Normand等人，In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal，1995))。脂肪細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞也可以通過(guò)皮膚活組織檢查樣品或拔除的毛發(fā)容易地衍生(Isolation andcultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generationof induced pluripotent stem cells (從皮膚或拔除的毛發(fā)中分離和培育人角質(zhì)形成細(xì)胞用于產(chǎn)生誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞)，Belmonte等人,Nature Protocols2010)并且也是本發(fā)明方法的優(yōu)選供體細(xì)胞。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面是一種用于產(chǎn)生患者特異的神經(jīng)干細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種用于從健康個(gè)體獲得的體細(xì)胞中產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞的方法。如本文所用，“神經(jīng)干細(xì)胞”指表達(dá)一些神經(jīng)標(biāo)記物(包括例如，巢蛋白(nestin))的多潛能細(xì)胞亞群。通過(guò)本文所述的方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞也稱(chēng)作“irNSC” :誘導(dǎo)的重編程神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞可以無(wú)限擴(kuò)增并且可以分化成神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(例如星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞)。術(shù)語(yǔ)“患者特異的神經(jīng)干細(xì)胞”指從患者的體細(xì)胞獲得的神經(jīng)干細(xì)胞并且也稱(chēng)作自體神經(jīng)干細(xì)胞。如本文所用的“從健康個(gè)體獲得的神經(jīng)干細(xì)胞”指從未疑似患有任何病癥或疾病的個(gè)體的體細(xì)胞中獲得的神經(jīng)干細(xì)胞。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重編程”指將體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為較不分化的細(xì)胞(例如將成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞)所需要的一個(gè)或多個(gè)步驟。通過(guò)導(dǎo)入?yún)⑴c維持神經(jīng)干細(xì)胞性能的至少兩個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)體細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞的重編程。適于將體細(xì)胞重編程為神經(jīng)干細(xì)胞的基因包括但不限于Sox2 (Seq ID No.1)、Brn2 (Seq ID No. 2),Bmil(Seq ID No. 3)、Mashl (Seq ID No. 4)、Soxll (Seq ID No. 5)、NCam(Seq ID No. 6),Kpnal (Seq ID No. 7)、Foxgl(Seq ID No. 8)、Emx2 (Seq ID No. 9)和 Pax6(Seq ID No. 10)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，導(dǎo)入至少兩個(gè)基因，在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，導(dǎo)入3個(gè)基因。待導(dǎo)入體細(xì)胞中的基因的優(yōu)選組合包含BmiI和Sox2。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少兩個(gè)基因的這種組合額外地包含Mashl。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩個(gè)基因的這種組合額外地包含選自Mashl、Emx2、Foxgl、Pax6和Soxll的一個(gè)基因。在又一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩個(gè)基因的組合包含Bmil和Sox2及Mashl。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因?qū)搿敝笇?dǎo)致所述基因在體細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的任何方法。通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，通過(guò)用重編程載體遞送至細(xì)胞中或通過(guò)用小分子活化所述基因，將所述基因?qū)塍w細(xì)胞中。重編程載體的實(shí)例是逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子。本文中優(yōu)選使用慢病毒用于遞送所述基因。適于穩(wěn)健激活所述基因的小分子的實(shí)例是DNA甲基化抑制劑、組蛋白去乙?；敢种苿Ⅺ溄菈A類(lèi)(例如麥角酸乙酰胺)、黃酮類(lèi)(例如 V _ 輕黃麗)、Paullone (例如 Kenpaullone) (Reprogramming of murine fibroblaststo induced pluripotent stem cells with chemical complementation of Klf4(用Klf4的化學(xué)互補(bǔ)物將鼠成纖維細(xì) 胞重編程為誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞).PNAS 2009 106
(22)8912-8917)、L-型通道激動(dòng)劑(例如 BIX01294)、BayK8644 和 5’ 氮胞苷((Inductionof Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by 0ct4 and Klf4with Small-Molecule Compounds (從小鼠胚胎成纖維細(xì)胞通過(guò)0ct4和Klf4連同小分子化合物誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞)，Yan Shi等人，Cell Stem Cell -2008年11月6日(第3卷，第5期，第568-574頁(yè))。為成功誘導(dǎo)重編程，在補(bǔ)充有生長(zhǎng)因子和小分子的合適培養(yǎng)基中培育體細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)因子”意指引起細(xì)胞增殖的生物活性多肽并且包括生長(zhǎng)因子和它們的類(lèi)似物。這些生長(zhǎng)因子包括但不限于表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管生成因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子，包括生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、粘液瘤和痘苗病毒衍生的生長(zhǎng)因子。本文所用的優(yōu)選生長(zhǎng)因子是BDNF (腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)、FGF2(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2)和EGF (表皮生長(zhǎng)因子)。生長(zhǎng)因子可以單獨(dú)或以配對(duì)組合使用，或最優(yōu)選地一起使用全部3種因子。另外，將成纖維細(xì)胞在至少一種小分子存在下培養(yǎng)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“小分子”或“小化合物”指合成或自然界中存在的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子，它們通常具有小于10，000克/摩爾、任選地小于5，000克/摩爾和任選地小于2，000克/摩爾的分子量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述小分子包括Rho相關(guān)的形成卷曲螺旋的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶(ROCK)蛋白激酶家族的抑制劑。ROCK抑制劑的非限制性實(shí)例包括法舒地爾(Fasudil) (1-(5-1-(5-異喹啉磺酰基)高哌嗪)、Thiazovivin (N-芐基_2_ (嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺)、￥27632((+)-0 )-反-4-(1-氨乙基)4-(4-吡啶基)環(huán)己烷甲酰胺二鹽酸鹽)和Balanol樣324化合物(N-{(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-羥基-3-甲氧基-苯甲酰基)_苯甲酰氨基]-吖庚烷-3-基} -4-羥基-3，5- 二甲基-苯甲酰胺)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述小分子選自一種或多種激酶AMPK的抑制劑(AMP激活的蛋白激酶，β I非催化亞基；正式符號(hào)PRKAB1)，CHK2 (CHK2檢查點(diǎn)同源物(粟酒裂殖酵母(S. pombe)),正式符號(hào)CHEK2)、MSKl (核糖體蛋白S6激酶，90kDa，多肽5 ;正式符號(hào)RPS6KA5)、PKA(催化性cAMP依賴(lài)性蛋白激酶α ;正式符號(hào)PRKACA)、PKGa(I型cGMP依賴(lài)性蛋白激酶；正式符號(hào)PRKG1)和SGKl (血清/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)的激酶1，正式符號(hào)SGK1)。如本文所用，“用于誘導(dǎo)重編程的合適培養(yǎng)基”也稱(chēng)作“誘導(dǎo)培養(yǎng)基”，指用于誘導(dǎo)體細(xì)胞的重編程的任何化學(xué)上定義的培養(yǎng)基。本文中優(yōu)選的是補(bǔ)充有胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和孕酮的無(wú)血清培養(yǎng)基。本文所用的優(yōu)選培養(yǎng)基含有10-50 μ g/ml胰島素、10-100 μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和10-50nM孕酮。適于誘導(dǎo)重編程的無(wú)血清培養(yǎng)基的實(shí)例是N2B27培養(yǎng)基(N2B27是補(bǔ)充有 N2 和 B27( 二者均來(lái)自 Gibco)的 DMEM/F12 (Gibco, Paisley, UK)的 I I 混合物)、N3 培養(yǎng)基(由 DMEM/F12 (Gibco, Paisley, UK) ,25 μ g/ml 胰島素、50 μ g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白、30nM亞硒酸鈉、20nM孕酮(Sigma)、IOOnM腐胺(Sigma)組成)或NeuroCult NS-A增殖培養(yǎng)基(Stemcell Technologies)。本文中最優(yōu)選的是如上文所述的無(wú)血清培養(yǎng)基,其額外地補(bǔ)充有FGF2、EGF、BDNF和ROCK抑制劑。優(yōu)選地，所述ROCK抑制劑包含法舒地爾或Balanol樣324化合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，培養(yǎng)基補(bǔ)充有10-50ng/mL FGF2、10_50ng/mL EGF、l-20ng/mL BDNF和1-50 μ M法舒地爾或1-10 μ M Balanol樣324化合物。在導(dǎo)入至少兩個(gè)基因后，待進(jìn)行重編程的體細(xì)胞優(yōu)選地在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培育至少I(mǎi)日，優(yōu)選地I日至7日、最優(yōu)選地2日至3日。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)的體細(xì)胞用組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑預(yù)處理。如本文所用的“進(jìn)行預(yù)處理”或“預(yù)處理”意指在補(bǔ)充有所述HDAC抑制劑的合適培養(yǎng)基中孵育體細(xì)胞4至60小時(shí)，優(yōu)選地48小時(shí)。本文中有用的HDAC抑制劑選自丁酸鈉(丁酸，納鹽)、制滴菌素A (TSA, 7-[4- (二甲氛基)苯基]-N-輕基-4,6_ 二甲基-7-氧代庚-2,4-二烯酰胺)和丙戊酸(2-丙基-戊酸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)的體細(xì)胞用丙戊酸(Valproic acid)預(yù)處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)的體細(xì)胞用丙戍酸預(yù)處理48小時(shí)。為擴(kuò)大增殖作為神 經(jīng)球培養(yǎng)物的神經(jīng)干細(xì)胞，在擴(kuò)增培養(yǎng)基中培育誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞，所述擴(kuò)增培養(yǎng)基包含如上文所述的補(bǔ)充有胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和孕酮及生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述生長(zhǎng)因子包含F(xiàn)GF2、BDNF和EGF。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增培養(yǎng)基額外地包含選自肝素、抗壞血酸、SHH(重組人音猬因子)、FGF8 (重組人FGFSa同工型)、DLL4 (重組人DLL4)、Jaggedl (重組人JaggedlFc嵌合體)、法舒地爾和Balanol樣324化合物的一種或多種補(bǔ)充物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在下一個(gè)步驟中通過(guò)省略重編程培養(yǎng)基的至少一種生長(zhǎng)因子而刺激借助本文所述方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞以便分化。優(yōu)選地，待撤回的生長(zhǎng)因子包括EGF和FGF。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用標(biāo)記基因來(lái)促進(jìn)篩選成功重編程的神經(jīng)干細(xì)胞并對(duì)其定量。例如，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，將編碼熒光標(biāo)記蛋白的基因?qū)氚畜w細(xì)胞中。熒光標(biāo)記蛋白的實(shí)例是GFP、YFP、EGFP或DsRed。優(yōu)選地，所述標(biāo)記基因與巢蛋白啟動(dòng)子有效連接。巢蛋白在神經(jīng)干細(xì)胞中特異性表達(dá)，因此在巢蛋白啟動(dòng)子控制下的標(biāo)記基因允許快速篩選和鑒定誘導(dǎo)的重編程的神經(jīng)干細(xì)胞。此后，篩選這些細(xì)胞以鑒定表現(xiàn)所需表型的細(xì)胞(即神經(jīng)球)。選擇和收獲大于20 μ m、優(yōu)選地大于50 μ m的神經(jīng)球用于進(jìn)一步擴(kuò)增。在本發(fā)明的 另一個(gè)方面，提供了通過(guò)前述方法中任一種產(chǎn)生的神經(jīng)干細(xì)胞群體。優(yōu)選地，這個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞群體是患者特異的，即源自從患病個(gè)體獲得的體細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞群體從健康個(gè)體獲得。所述神經(jīng)干細(xì)胞可以無(wú)限擴(kuò)增。培養(yǎng)是容易和充分表征的?？梢灾貜?fù)地冷凍和融化神經(jīng)干細(xì)胞等分試樣。源自患者的神經(jīng)干細(xì)胞代表了研究CNS疾病的病理生理學(xué)的疾病相關(guān)性體外模型。將患者特異的體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞代表了一項(xiàng)產(chǎn)生患者特異的神經(jīng)干細(xì)胞生物樣品庫(kù)的容易獲得和重復(fù)性技術(shù)。因此，在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選方面，構(gòu)思了包含患者特異的神經(jīng)干細(xì)胞的生物樣本庫(kù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生了包含從健康個(gè)體所獲得的不同神經(jīng)干細(xì)胞群體的生物樣本庫(kù)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物樣本庫(kù)”意指從不同個(gè)體或物種取得的生物學(xué)樣品的文庫(kù)。標(biāo)本和相關(guān)數(shù)據(jù)的歸檔收集物意在用于研究目的，目的在于對(duì)付神經(jīng)疾病，如神經(jīng)變性疾病，如阿爾茨海默病，帕金森病，亨廷頓病，肌萎縮側(cè)索硬化(ALS/魯蓋瑞氏癥)、中風(fēng)和脊髓損傷，或用于治療所述神經(jīng)學(xué)疾病。本發(fā)明的另一個(gè)方面是由這種方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞的用途。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用由這種方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞作為研究CNS疾病的病理生理學(xué)的體外模型。例如，由本發(fā)明方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞可以用于篩選逆轉(zhuǎn)、抑制或阻止神經(jīng)學(xué)疾病的化合物。另外，它們可以用于篩選逆轉(zhuǎn)、抑制或阻止藥品(例如糖尿病藥品)的神經(jīng)副作用的化合物。優(yōu)選地，由本文所述的本發(fā)明方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞源自患病受試者。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種治療用組合物，其含有由前述任一種方法產(chǎn)生的細(xì)胞或含有前述細(xì)胞群體的任一個(gè)。優(yōu)選地，這種治療用組合物還包含生理相容的溶液，包括例如人工腦脊液或磷酸鹽緩沖鹽水。所述治療用組合物可以用來(lái)治療、阻止或穩(wěn)定神經(jīng)學(xué)疾病，例如，阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病或ALS、溶酶體貯積疾病、多發(fā)性硬化或脊髓損傷。例如，成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞或脂肪細(xì)胞可以通過(guò)皮膚活組織檢查從需要治療的個(gè)體或從健康個(gè)體中獲得并且過(guò)本發(fā)明的方法重編程為神經(jīng)干細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，收獲神經(jīng)干細(xì)胞并且將其導(dǎo)入個(gè)體中以治療病狀。在另一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)干細(xì)胞在導(dǎo)入個(gè)體之前在適于分化成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)并且可以用來(lái)替換或輔助患病或受損組織的正常功能。本發(fā)明的巨大優(yōu)點(diǎn)在于它提供來(lái)自健康個(gè)體的患者特異的人神經(jīng)細(xì)胞或相容性神經(jīng)干細(xì)胞的基本上無(wú)限制供應(yīng)，其中所述健康個(gè)體具有適于移植的相同HLA型。細(xì)胞療法中自體和/或相容性細(xì)胞的使用提供了相對(duì)于使用非自體細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，所述非自體細(xì)胞可能是免疫排斥的對(duì)象。相反，自體細(xì)胞不可能激發(fā)明顯的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是神經(jīng)干細(xì)胞生物樣品庫(kù)用于治療神經(jīng)學(xué)疾病的用途。這些生物樣品庫(kù)優(yōu)選地包含從具有幾種HLA型的患者或健康個(gè)體所獲得的神經(jīng)干細(xì)胞。移植從健康供體獲得的細(xì)胞至需要用相容性HLA型治療的個(gè)體避免了正常情況下與異源性型細(xì)胞移植相關(guān)的突出的排斥反應(yīng)問(wèn)題。常規(guī)地，通過(guò)施用免疫抑制劑或抗排斥藥物如環(huán)孢菌素阻止或減少排斥。然而，這類(lèi)藥物具有明顯的不利副作用，例如，免疫抑制、致癌性、腎毒性以及十分昂貴。本發(fā)明應(yīng)當(dāng)消除或至少大幅減少抗排斥藥物如環(huán)孢菌素、imulan、FK-506、糖皮質(zhì)激素和雷帕霉素及其衍生物的需要。
就本發(fā)明的治療方法而言，不意在使施用神經(jīng)干細(xì)胞至哺乳動(dòng)物限于特定施用模式、給藥劑量或頻率；本發(fā)明構(gòu)思了全部施用模式，包括足以提供充分阻止或治療疾病的劑量的肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、病灶內(nèi)、皮下或任何其他途徑。神經(jīng)干細(xì)胞可以按單劑量或多劑量施用至哺乳動(dòng)物。當(dāng)施用多劑量時(shí)，劑量可以彼此相隔例如I周、I月、I年或10年。也可以在施用細(xì)胞之前、其期間或之后施用一種或多種生長(zhǎng)因子、激素、白介素、細(xì)胞因子、小分子或其他細(xì)胞以進(jìn)一步使得這些細(xì)胞偏向于特定細(xì)胞類(lèi)型。附圖簡(jiǎn)述


圖1 :用于將人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為irNSC的方法的示意圖。第O日將人成纖維細(xì)胞用胰蛋白酶消化并且使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有FGF、EGF30ng/mL ；BDNF20ng/mL ;法舒地爾 10 μ M，Polybrene4 μ g/ml的N2B27)，以小體積用基因和巢蛋白GFP報(bào)道分子的組合轉(zhuǎn)染。 將成纖維細(xì)胞以10000-30000個(gè)細(xì)胞/em2的濃度鋪種在正常的組織培養(yǎng)板中。第I日將培養(yǎng)基更換為新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。GFP/巢蛋白陽(yáng)性(GFP+)irNSC開(kāi)始出現(xiàn)，頻率非常低(每 100000個(gè)細(xì)胞中約50個(gè)irNSC GFP+)。第2日GFP+irNSC數(shù)目增加并且它們開(kāi)始移動(dòng)在一起，形成細(xì)胞團(tuán)簇。第3日細(xì)胞團(tuán)簇以清楚的球體結(jié)構(gòu)組織，所述結(jié)構(gòu)漂起并開(kāi)始作為 GFP+神經(jīng)球浮動(dòng)。計(jì)數(shù)和收獲大于20 μ m的神經(jīng)球用于進(jìn)一步擴(kuò)增。
圖2 :人巢蛋白GFP報(bào)道分子慢病毒的示意圖。將熒光蛋白copGFP和Zeocin選擇標(biāo)記克隆于來(lái)自人巢蛋白內(nèi)含子2的與最小CMV啟動(dòng)子連接的1. Skb增強(qiáng)子片段的表達(dá)控制下。
圖3 :在重編程誘導(dǎo)方法的第I日時(shí)的irNSC。上半小圖未轉(zhuǎn)化的人胎兒肺成纖維細(xì)胞MR90(相差)。下半小圖irNSC GFP+細(xì)胞的產(chǎn)生(相差和GFP通道)。
圖4 :在重編程誘導(dǎo)方法的第2日時(shí)的irNSC。細(xì)胞傾向于移行靠在一起并且開(kāi)始形成帶有irNSC GFP+核芯的球體結(jié)構(gòu)(相差和GFP通道)。
圖5 :在重編程誘導(dǎo)方法的第3日時(shí)的irNSC。在第2日形成的球體結(jié)構(gòu)物現(xiàn)在完全成熟，作為漂浮在培養(yǎng)基中的神經(jīng)球出現(xiàn)。神經(jīng)球具有直徑范圍20-100 μ m的尺度，同時(shí)細(xì)胞密度高。irNSC由巢蛋白GFP表達(dá)標(biāo)記并且可以是在幾乎全部神經(jīng)球中鑒定到，雖然并非全部神經(jīng)球均具有相同比例的irNSCGFP+(相差和GFP通道)。
圖6 :用不同基因組合產(chǎn)生的神經(jīng)球的數(shù)目。
圖7 :用SoX2-Bmil轉(zhuǎn)導(dǎo)后附著的神經(jīng)球。附著的神經(jīng)球顯示伸長(zhǎng)雙極細(xì)胞的特征性形態(tài)。下半小圖irNSC GFP+神經(jīng)球的更高放大率。
圖8 =EGF和FGF撤除I周后的分化細(xì)胞。撤除增生性生長(zhǎng)因子時(shí)，irNSC產(chǎn)生具有非常細(xì)的突出物的細(xì)胞，其對(duì)于神經(jīng)元標(biāo)記物tujl染色為陽(yáng)性。
圖9 :產(chǎn)生用于擴(kuò)增和 表征的irNSC神經(jīng)球批次。三百六十萬(wàn)個(gè)人成纖維細(xì)胞 MR90用胰蛋白酶消化并且使用補(bǔ)充有法舒地爾ΙΟμΜ和Polybrene4y g/ml的誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (具有 FGF、EGF30ng/mL ；BDNF20ng/mL 的 N2B27)，以小體積用 Sox2、Bmi1、巢蛋白 GFP 報(bào)道分子感染。從第4日至第8日收獲大于50μπι的GFP+神經(jīng)球并且進(jìn)一步用于擴(kuò)增。已經(jīng)使用含有法舒地爾的擴(kuò)增培養(yǎng)基(具有FGF、EGF30ng/mL BDNF20ng/mL的N2B27)擴(kuò)增一半神經(jīng)球并且使用不含法舒地爾的擴(kuò)增培養(yǎng)基擴(kuò)增另一半。第15日在含有法舒地爾的擴(kuò)增培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的神經(jīng)球具有更好的形態(tài)和更清晰和鮮明的邊界(充分形成的神經(jīng)球的標(biāo)志，小圖B);不含法舒地爾時(shí)，神經(jīng)球具有模糊的邊界(小圖A)。
圖10 :對(duì)irNSC神經(jīng)球表達(dá)NSC標(biāo)記物Sox2和巢蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)表征。第 15日，用法舒地爾擴(kuò)增的irNSC神經(jīng)球已經(jīng)鋪在ΡΟ/Lam包被的板上并且在48小時(shí)后，針對(duì) Sox2和巢蛋白表達(dá)進(jìn)行染色。irNSC神經(jīng)球附著并且irNSC從球狀體擴(kuò)展開(kāi)來(lái)。irNSC具有常見(jiàn)的NSC形態(tài)并且為Sox2和巢蛋白陽(yáng)性。小圖A :合并通道和單通道DAP1、Sox2、巢蛋白；20x放大率；小圖B :合并通道DAP1、Sox2、巢蛋白；10x放大率。
圖11 :比較法舒地爾和Balanol樣324化合物刺激產(chǎn)生irNSC神經(jīng)球的作用。人成纖維細(xì)胞頂R90用胰蛋白酶消化并且使用補(bǔ)充有法舒地爾10 μ M(斜線圖)或Balanol 樣324化合物2 μ M(黑色圖)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(具有FGF、EGF、BDNF20ng/mL ;肝素2 μ g/ml ； Polybrene4 μ g/ml 的]NeuroCult NS-A增殖試劑盒(Human, StemCells Technologies))， 以小體積用SoX2、Bmil、巢蛋白GFP報(bào)道分子感染。將成纖維細(xì)胞以10000-30000個(gè)細(xì)胞/ cm2的濃度鋪種在正常的組織培養(yǎng)板中。第I日將培養(yǎng)基更換為新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。第4 日計(jì)數(shù)大于50 μ m的GFP+神經(jīng)球。Balanol樣324小分子化合物增加神經(jīng)球生成效率大約2倍(1. 9倍)并且具有更好的重現(xiàn)性(STDEV，η = 3)。
圖12 :丙戊酸(VPA)預(yù)處理人成纖維細(xì)胞改善GFP+irNSC神經(jīng)球的產(chǎn)量。用Sox2、 Bmi1、巢蛋白GFP報(bào)道分子感染之前，將人成纖維細(xì)胞IMR90在具有或沒(méi)有HDAC抑制劑丙戊酸(2-丙基-戊酸，單鈉鹽)(ImM)的情況下預(yù)處理48小時(shí)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基(具有FGF、 EGF BDNF20ng/mL ;肝素 2 μ g/ml ；Balanol 樣 3242 μ M 的NeuroCult NS-A 增殖試劑盒 (Human, StemCells Technologies))。第7日計(jì)數(shù)大于50 μ m的神經(jīng)球(小圖A)并且報(bào)告每個(gè)神經(jīng)球的GFP+irNSC平均數(shù)(小圖B)。用VPA預(yù)處理產(chǎn)生的irNSC神經(jīng)球的代表性畫(huà)面(小圖C)。VPA預(yù)處理在第7日沒(méi)有顯著影響神經(jīng)球數(shù)目；不過(guò)VPA處理增加GFP+irNSC 數(shù)目(2.1 倍)(STDEV，η = 3)。
圖13 :限定與Sox2和Bmi I組合用于高效誘導(dǎo)irNSC神經(jīng)球的最少基因匯集物。用 Sox2、Bmil、巢蛋白GFP報(bào)道分子外加不同候選基因感染以解決其協(xié)同作用之前，將人成纖維細(xì)胞MR90用VPA(ImM)預(yù)處理48小時(shí)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基具有FGF、EGF BDNF20ng/mL ;肝素 2 μ g/ml ；Balanol 樣 324 化合物 2 μ M 的NeuroCult NS-A 增殖試劑盒(Human, StemCells Technologies)。在第 7 日對(duì)大于 50 μ m 的 irNSC 神經(jīng)球定量。Mashl、Emx2> Foxgl、Pax6 和Soxll與Bmil和Sox2協(xié)同以產(chǎn)生irNSC神經(jīng)球。
圖14 :從成年人皮膚成纖維細(xì)胞(HDFa)產(chǎn)生irNSC神經(jīng)球。成年人皮膚成纖維細(xì)胞由GIBCO提供(目錄號(hào)C-013-5C)。成年人皮膚成纖維細(xì)胞用胰蛋白酶消化并且使用補(bǔ)充有法舒地爾10 μ M的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(具有FGF、EGF、BDNF20ng/mL ;肝素2 μ g/ml的 NeuroCult NS-A 增殖試劑盒(Human, StemCells Technologies)),以小體積用 Sox2、 Bmil、巢蛋白GFP報(bào)道分子感染。第8日檢測(cè)到irNSC神經(jīng)球(代表性畫(huà)面2. 5X和10X 放大率)。
圖15 :使用抗壞血酸、音猬因子(Shh)、Jaggedl、DLL4和FGF8的組合擴(kuò)增irNSC神經(jīng)球以獲得irNSC GFP+的單層培養(yǎng)物。人成纖維細(xì)胞IMR90使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(具有FGF、 EGF、BDNF20ng/mL ;肝素 2 μ g/ml ；Balanol 樣 3242 μ M 的NeuroCult NS`-A 增殖試劑盒 (Human, StemCells Technologies)),用 Sox2、Bmil、Mashl 和巢蛋白 GFP 報(bào)道分子感染。第 7日將大于50 μ m的神經(jīng)球收獲并且進(jìn)一步用含有擴(kuò)增培養(yǎng)基(NeuroCult NS-A增殖試劑盒(Human，StemCells Technologies)，其具有 FGF、EGF、BDNF20ng/mL ;肝素 2 μ g/ ml ;Balanol樣3242μΜ ;抗壞血酸O. 2mM、SHH(重組人音猬因子，目錄號(hào)1845SH) 500ng/ mL、FGF8(重組人FGF8a同工型，目錄號(hào)4745F8) 100ng/mL、DLL4 (重組人DLL4，目錄號(hào) 1506D4)500ng/mL、Jaggedl (重組人 JaggedlFc 嵌合體，目錄號(hào)1277JG) 500ng/mL、來(lái)自 hESC源NSC的條件培養(yǎng)基1/10，所述NSC在具有FGF、EGF、BDNF20ng/mL ;肝素2 μ g/ml的 NeuroCult NS-A 增殖試劑盒(Human, StemCells Technologies)中培養(yǎng) 2 日(Human, StemCells Technologies))擴(kuò)增。在第14日用上文報(bào)告的擴(kuò)增培養(yǎng)基擴(kuò)增的irNSC神經(jīng)球的代表性畫(huà)面(小圖A)。神經(jīng)球具有定義的邊界，并且可以觀察到來(lái)自神經(jīng)球的脊?fàn)钔怀鑫?小圖B，放大)。在第21日，將擴(kuò)增的irNSC神經(jīng)球分離并且鋪在上ΡΟ/Lam包被的板上，以獲得irNSC GFP+的均勻單層培養(yǎng)物(小圖C，在單層上培養(yǎng)4日后irNSC單層的相差和GFP通道)。
圖16 :對(duì)irNSC神經(jīng)球表達(dá)NSC標(biāo)記物巢蛋白和早期神經(jīng)元標(biāo)記物Tuj I的免疫細(xì)胞化學(xué)表征。第21日，將如圖15中所述那樣產(chǎn)生的irNSC神經(jīng)球分離并且在NSC自我更新條件下鋪種(具有FGF、EGF、BDNF20ng/mL ;肝素2 μ g/ml的NeuroCult NS-A增殖試劑盒(Human, StemCells Technologies))以檢驗(yàn)巢蛋白標(biāo)記物的表達(dá)(48小時(shí)候小圖A,全部細(xì)胞均為巢蛋白+和Tujl-)或在分化條件下鋪種(具有BDNF20ng/mL的NeuroCult NS-A分化試劑盒(Human, StemCells Technologies)),并且在第7日對(duì)Tujl和巢蛋白染色 (小圖B，全部細(xì)胞均為T(mén)ujl+并且少數(shù)細(xì)胞是巢蛋白+)。實(shí)施例
這種方法可以通過(guò)參考本文中圖1來(lái)顯示，圖1描述本發(fā)明的方法用于將人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)。在這種方法中，將人成纖維細(xì)胞在第O日用胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)并且測(cè)定它們的生存力。將1.0xl05-3.0xl05個(gè)之間胰蛋白酶消化的成纖維細(xì)胞隨后重懸于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中并且將基因的組合作為慢病毒遞送。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，添加 Polybrene (溴化己二甲胺)以增加慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。感染在微量離心管中進(jìn)行15分鐘。 與基因組合時(shí)，使用人巢蛋白GFP報(bào)道分子。巢蛋白是NSC中特異性表達(dá)的熟 知標(biāo)記物。在巢蛋白報(bào)道分子中，熒光蛋白GFP在人巢蛋白啟動(dòng)子控制下表達(dá)(圖2)，因此這允許輕易篩選誘導(dǎo)的重編程的神經(jīng)干細(xì)胞(irNSC) GFP+。
使用適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基體積中的10000-30000個(gè)細(xì)胞/cm2濃度，將感染的細(xì)胞鋪在組織培養(yǎng)板中。在第I日，更新全部誘導(dǎo)培養(yǎng)基。可能鑒定到與人成纖維細(xì)胞相比形態(tài)清楚變化的一些irNSC GFP+(圖3)。irNSC GFP+獲得雙極和伸長(zhǎng)的形態(tài)，具有NSC常見(jiàn)的更稠密細(xì)胞質(zhì)。另外，irNSC在壓緊的單層培養(yǎng)物中生長(zhǎng)，所述壓緊的單層培養(yǎng)物與常規(guī)NSC 培養(yǎng)物中所獲得的用于激活促增殖性Notch途徑信號(hào)的常見(jiàn)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用相似。在第2日，irNSC GFP+處于更成熟的狀態(tài)并且開(kāi)始形成十分壓緊的細(xì)胞團(tuán)簇。這些irNSC團(tuán)簇開(kāi)始形成具有致密核芯的球體結(jié)構(gòu)，所述致密核芯含有irNSC GFP+(圖4)。在第3日， 球體結(jié)構(gòu)完全形成并且開(kāi)始從組織培養(yǎng)板脫落，作為神經(jīng)球漂浮在培養(yǎng)基中。神經(jīng)球具有大約20-100 μ m尺度，具有清晰邊界和其中可能鑒定到irNSCGFP+的高密度細(xì)胞核芯(圖 5)。
為實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新性突破，需要使用基因的特定組合。參與體內(nèi)和體外維持NSC特性的以下基因名單取自文獻(xiàn)知識(shí)Sox2(Sox轉(zhuǎn)錄因子和NSC的重要標(biāo)記物)、Brn2(已知與Sox 蛋白結(jié)合的POU結(jié)構(gòu)域蛋白。據(jù)報(bào)道Sox2和Brn2結(jié)合在巢蛋白啟動(dòng)子上。Brn2K0小鼠具有受損的CNS發(fā)育)、Bmil (參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)，據(jù)報(bào)道增加細(xì)胞周期蛋白E/cdk2 復(fù)合物的P21和p27抑制物的表達(dá)。細(xì)胞周期蛋白E/cdk2抑制作用決定成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白對(duì)細(xì)胞周期的控制喪失，這導(dǎo)致在NSC的自我更新?tīng)顟B(tài)期間快速的細(xì)胞周期)、Mashl (據(jù)稱(chēng)是神經(jīng)前體細(xì)胞體內(nèi)增殖的重要調(diào)節(jié)物)、Soxll(據(jù)報(bào)道在體內(nèi)于SGZ中表達(dá)的Sox蛋白)、NCam(流式細(xì)胞術(shù)中的NSC標(biāo)記物并且在CNS的不同區(qū)域中表達(dá))、Kpnal (作為輸入蛋白α 5更知名，所述輸入蛋白α 5與輸入蛋白β —起在外胚層來(lái)源的組織中負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的核輸入)。
全部基因均作為cDNA克隆至慢病毒質(zhì)粒中并且隨后包裝入慢病毒中。將慢病毒包裝的Sox2、Bmil、MashU SoxlU NCam> Kpnal、巢蛋白GFP報(bào)道分子的粒子直接轉(zhuǎn)導(dǎo)至人成纖維細(xì)胞中。在上文描述方法中測(cè)試不同的基因組合。在第3日，可能通過(guò)計(jì)數(shù)產(chǎn)生的神經(jīng)球評(píng)價(jià)產(chǎn)生irNSC成功與否。僅考慮大于50 μ m的神經(jīng)球。
如圖6中所代表，轉(zhuǎn)導(dǎo)巢蛋白報(bào)道分子慢病毒而不向誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加法舒地爾沒(méi)有使人成纖維細(xì)胞重編程為irNSC。將法舒地爾添加至誘導(dǎo)培養(yǎng)基，報(bào)告產(chǎn)生神經(jīng)球(約 50 μ m)和一些更小的神經(jīng)球(約20 μ m,未計(jì)數(shù))。
采用我們的創(chuàng)造性方法產(chǎn)生的神經(jīng)球利用以下基因組合將SoX2-Bmil在第3日收獲并且另外擴(kuò)增14日。irNSCs神經(jīng)球的擴(kuò)增是關(guān)鍵步驟。使用補(bǔ)充有FGF、EGF、BDNF 的N2B27培養(yǎng)基在特定的超低非貼壁板(Corning)中培養(yǎng)神經(jīng)球。為了實(shí)現(xiàn)均勻的irNSC GFP+神經(jīng)球群體，每2-3日采用清潔過(guò)程。在14日擴(kuò)增期間，具有低密度irNSC GFP+的一些神經(jīng)球不能夠恰當(dāng)?shù)卦鲋?，最有可能歸因于被未轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞污染。這類(lèi)污染的神經(jīng)球裂解成需要除去的單細(xì)胞。在第14日，測(cè)試神經(jīng)球在聚鳥(niǎo)氨酸/層粘連蛋白包被的板上附著和產(chǎn)生神經(jīng)元樣細(xì)胞。對(duì)于附著，將20-40個(gè)神經(jīng)球/cm2鋪種在聚鳥(niǎo)氨酸/層粘連蛋白包被的板上的擴(kuò)增培養(yǎng)基中，其中所述擴(kuò)增培養(yǎng)基僅第I日補(bǔ)充10 μ M法舒地爾，以便改善改善細(xì)胞附著和展開(kāi)。在第I日，培養(yǎng)物可能顯示神經(jīng)球的附著和展開(kāi)(圖7)。在展開(kāi)的神經(jīng)球的中心，我們鑒定到具有常見(jiàn)NSC形態(tài)的irNSC GFP+ο將神經(jīng)球培育額外3 日，并且隨后僅將BDNF添加至N2B27 (神經(jīng)元分化條件)。在EGF和FGF撤除后，irNSC改變形態(tài)。它們變得更拉伸并且開(kāi)始形成神經(jīng)突樣細(xì)胞突出物。在分化條件的第7日，將細(xì)胞固定并且對(duì)神經(jīng)元標(biāo)記物tujl染色(圖8)。
在法舒地爾存在下擴(kuò)增的神經(jīng)球具有更好的形態(tài)以及清晰和鮮明的邊界(充分形成的神經(jīng)球的標(biāo)志物，圖9，小圖B);在法舒地爾不存在下，神經(jīng)球具有模糊的邊界(圖 9，小圖A)。irNSC具有常見(jiàn)的NSC形態(tài)并且為Sox2和巢蛋白陽(yáng)性(圖10)。
圖11顯示Rock激酶抑制劑Balanol樣324化合物增加GFP+神經(jīng)球的產(chǎn)率。
這些證據(jù)顯示，這種方法能夠基于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)(最佳組合SoX2-Bmil、 Sox2_Bmi1-Mash1、Sox2_Bmi1-Sox 11、Sox2_Bmi1-Emx2、Sox2-Bmi1-Foxgl 和 SOX2-Bmil-PaX6，也參見(jiàn)圖13)和化學(xué)上定義的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的關(guān)聯(lián)步驟，將人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為irNSC。
為了增加irNSC的產(chǎn)率，將人成纖維細(xì)胞用或者不用HDAC抑制劑丙戊酸(VPA， 2_丙基-戊酸，單鈉鹽)預(yù)處理。處理快結(jié)束時(shí)，將人成纖 維細(xì)胞在感染之前于補(bǔ)充有FBS10%和L-谷氨酰胺的DMEM/F12中孵育，其中補(bǔ)充有l(wèi)mMVPA(圖12)。
圖14顯示從成年人皮膚成纖維細(xì)胞(HDFa)中產(chǎn)生irNSC神經(jīng)球。
圖15顯示使用抗壞血酸、音猬因子(Shh)、JaggedU DLL4和FGF8的組合擴(kuò)增 irNSC神經(jīng)球。圖16顯示對(duì)irNSC神經(jīng)球表達(dá)NSC標(biāo)記物巢蛋白和早期神經(jīng)元標(biāo)記物Tuj I 的免疫細(xì)胞化學(xué)表征。
材料和方法
細(xì)胞培養(yǎng)物
誘導(dǎo)培養(yǎng)基N2B27 (N2B27是補(bǔ)充有N2和B27 ( 二者均來(lái)自Gibco)的DMEM/ F12(Gibco, Paisley, UK)的1:1 混合物，其補(bǔ)充有人 EGF (Peprotech) 30ng/mL,人 FGF230ng/mL (Peprotech)、人 BDNF (Roche) 20ng/mL 和法舒地爾(Calbiochem) 10 μ M 或 Balanol樣324化合物(N- {(3R，4R) -4- [4- (2-氟-6-羥基-3-甲氧基-苯甲?；?_苯甲酰氨基]-吖庚烷-3-基} -4-羥基-3，5- 二甲基-苯甲酰胺)2 μ Μ。
擴(kuò)增培養(yǎng)基補(bǔ)充有人EGF (Peprotech) 30ng/mL、人 FGF230ng/mL (Peprotech)、人 BDNF(Roche)20ng/mL 的 N2B27，或
具有FGF、EGF、BDNF20ng/mL ;肝素 2 μ g/ml ；Balanol 樣 3242 μ M ;抗壞血酸O.2mM、SHH(重組人音猬因子，目錄號(hào)1845SH) 500ng/mL、FGF8 (重組人FGF8a同工型，目錄號(hào)4745F8) 100ng/ml、DLL4 (重組人 DLL4，目錄號(hào)1506D4) 500ng/mL、Jaggedl (重組人 JaggedlFc 嵌合體，目錄號(hào)1277JG) 500ng/mL 的NeuroCult NS-A 增殖試劑盒(Human, StemCells Technologies)。
分化培養(yǎng)基補(bǔ)充有人BDNF(Roche) 20ng/mL、層粘連蛋白 2 μ g/ml (Invitrogen) 的 N2B27。
人成纖維細(xì)胞MR90胎兒肺成纖維細(xì)胞(ATCC批號(hào)580229699)或成年人皮膚成纖維細(xì)胞(GIBC0,目錄號(hào)C-013-5C)。
慢病毒預(yù)包裝的即用型慢病毒粒子從Sigma (Stemgent Reprogramming Lentivirus human Sox2,目錄號(hào) ST070012)、Genecopeia(人 Bmil Lentifect 慢病毒粒子，目錄號(hào) LP-B0015-Lvl05 ；SoxllLentifect 慢病毒粒子，目錄號(hào) LP-M0425-LV105 ； MashlLentifect 慢病毒粒子，目錄號(hào) LP-Z0740-LV105 ；人 KpnalLentifect 慢病毒粒子， 目錄號(hào) LP-U1286-Lvl05 ；NCaml Lentifect 慢病毒粒子，目錄號(hào) LP_Z2645_Lvl05)和 SBI Systems Biosciences (巢蛋白GFP報(bào)道分子pGreenZeo -hNestin轉(zhuǎn)錄的報(bào)道分子病毒， SR10035VA-1)獲得。
滴度巢蛋白GFP1. 45 * IO5/μ1、BMI14. 3 * IO5/μ1、Sox21. 07 * IO4/μ1、 Soxl 13. 2 * IO6/μ l、Mashl4. 7 * IO6/μ l、NCam3. 3 * IO4/μ1、Kpnall. 8 * IO5/μ I。
操作方案
1.1rNSCs 的產(chǎn)生`
-在具有300μ I誘導(dǎo)培養(yǎng)基(其含有polybrene (溴化己二甲胺,Sigma) 4 μ g/ml) 的微量離心中，針對(duì)不同的基因組合(感染復(fù)數(shù)(M. 0.1.)，每個(gè)單一慢病毒使用30)和報(bào)道分子巢蛋白GFP慢病毒(M. 0.1，使用10)，將200，000個(gè)頂1 90人成纖維細(xì)胞以慢病毒感染。
-在室溫孵育15分鐘。
-在處理的6孔組織培養(yǎng)板中的一個(gè)孔內(nèi)，在1.7ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基中接種300 μ I
-第I日，更新2ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基/每孔
-第3日，收獲神經(jīng)球，小心地收集具有漂浮球狀體的2ml
-擴(kuò)增神經(jīng)球
2.神經(jīng)球的擴(kuò)增
-從6孔板的3個(gè)孔中收集具有漂浮神經(jīng)球的培養(yǎng)基于15ml管內(nèi)
-使球狀體沉降10分鐘
-十分小心地移除上清液(單細(xì)胞將不沉降并且隨上清液一起吸出)
-在4ml終體積擴(kuò)增培養(yǎng)基中重懸球狀體
-接種在超低貼壁性B6板(Corning)中
-孵育2-3 日
-每2-3日重復(fù)擴(kuò)增流程直至與產(chǎn)生irNSC相距14日
3.分化神經(jīng)球
-第14日irNSC的產(chǎn)生和在擴(kuò)增流程后，在立體顯微鏡下選擇具有清晰邊界和富含irNSC GFP+的圓形神經(jīng)球
-使用擴(kuò)增培養(yǎng)基在事先用聚鳥(niǎo)氨酸/層粘連蛋白包被的24孔板中鋪種40個(gè)球狀體，同時(shí)添加法舒地爾10 μ M或Balanol樣324化合物2 μ Μ。
-次日，更新為不含法舒地爾/Balanol樣324化合物2μ M的擴(kuò)增培養(yǎng)基。
-孵育3日
-移除擴(kuò)增培養(yǎng)基并添加分化培養(yǎng)基
-在3-4日后更新分化培 養(yǎng)基
-孵育3-4 日
-用PFA4 %固定細(xì)胞并且進(jìn)行免疫染色
irNSC神經(jīng)球染色操作方案在第15日用以下抗體將神經(jīng)球染色用于表征小鼠抗巢蛋白和兔抗Sox20/N和隨后第二抗小鼠488和抗兔555，持續(xù)I小時(shí)。
第一抗體
單克隆小鼠抗巢蛋白，1/500稀釋(MAB5326MiIIipore)
多克隆兔抗Sox2，1/500 稀釋(AB5603MI Millipore)
第二抗體
Alexa fluor488, IgG, 1/1000 稀釋?zhuān)窖蚩剐∈?Al 1029Invitrogen)
Alexa fluor555, IgGl/1000 稀釋?zhuān)窖蚩雇?A21429Invitrogen)
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞(NCS)的方法，包括 a)提供體細(xì)胞， b)通過(guò)導(dǎo)入選自Bmi1、Sox2、Mashl、Soxl1、Emx2>Foxgl和Pax6的至少兩個(gè)基因，將所述體細(xì)胞重編程為NSC ;和 c)用生長(zhǎng)因子和小分子誘導(dǎo)重編程。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括 d)在適于NSC增殖的條件下孵育步驟b)和c)的產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中步驟a)的體細(xì)胞是人細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟a)的體細(xì)胞選自成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟c)的生長(zhǎng)因子和小分子是化學(xué)上定義的培養(yǎng)基的補(bǔ)充物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中化學(xué)上定義的培養(yǎng)基是補(bǔ)充有胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和孕酮的無(wú)血清培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟b)的至少兩個(gè)基因包含Bmil和 Sox2。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中步驟b)的至少兩個(gè)基因額外地包含選自Mashl、Soxl1、Emx2> Foxgl 和 Pax6 的至少一個(gè)基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中步驟b)的至少兩個(gè)基因包含Bm1、Sox2和Mashl ο
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟C)的生長(zhǎng)因子選自FGF2、EGF和 BDNF。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟c)的小分子包含ROCK抑制劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中ROCK抑制劑選自1-(5-異喹啉磺酰基)高哌嗪、N-芐基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺、(+) - (R)-反-4- (1-氨乙基)-N- (4-吡啶基)環(huán)己烷甲酰胺二鹽酸鹽和N-{(3R，4R)-4-[4-(2-氟_6_羥基-3-甲氧基-苯甲?；?-苯甲酰氨基]-吖庚烷-3-基} -4-羥基-3，5- 二甲基-苯甲酰胺。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中體細(xì)胞用組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑預(yù)處理。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述體細(xì)胞的重編程是通過(guò)慢病毒遞送至少兩個(gè)基因的組合實(shí)現(xiàn)的。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的神經(jīng)干細(xì)胞作為CNS疾病體外模型的用途。
17.治療用組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求15所述的神經(jīng)干細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的治療用組合物，其中神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞。
19.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法獲得的NSC生物樣本庫(kù)。
20.基本上如本文所述的方法和用途。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及用于將體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)的方法。另外，本申請(qǐng)涉及基于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和化學(xué)上定義的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的關(guān)聯(lián)步驟，將人成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞或脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化成神經(jīng)干細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C12N5/0797GK103068974SQ201180040130
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者K·克里斯滕森, M·格拉夫, R·亞科內(nèi), R·杰加西亞 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司