專利名稱：無血培養(yǎng)的膿毒血癥質(zhì)譜診斷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于快速檢測(cè)和快速質(zhì)譜鑒定血液(膿毒血癥)或其它體液中感染性微生物的方法和裝置。早先的技術(shù)微生物“鑒定”指的是采用分類體系進(jìn)行分類:域(真核生物、原核生物和古細(xì)菌)、界(植物、動(dòng)物、真菌)、門、綱、目、科、屬、種和亞種。鑒定一份微生物樣本指的是，至少確定到屬，一般確定到種，如有可能的話，也可以確定到亞種，例如當(dāng)不同亞種具有不同病原性時(shí)，這一點(diǎn)很重要。在更為普遍的意義上，鑒定也意味著確定微生物的其他更多的個(gè)體特性，如微生物對(duì)抗生素的抵抗性。許多種屬的微生物，特別是細(xì)菌、原生動(dòng)物、微藻和未分化的真菌細(xì)胞，如酵母，均可采用質(zhì)譜方法進(jìn)行鑒定，確定度很高，可通過將通常方式下在營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長的克隆中的少量微生物轉(zhuǎn)移至質(zhì)譜樣品支撐盤上，通過樣本制備崩解微生物。從這一樣本中獲得的質(zhì)譜圖尤其能夠顯示不同的可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量和豐度；這些蛋白質(zhì)以足夠高的濃度存在于微生物中。通過與參比圖庫中的參比圖譜進(jìn)行類似度分析，基于該質(zhì)譜圖能夠鑒定該微生物。微生物鑒定對(duì)于感染性疾病而言尤為重要，特別是膿毒血癥。在膿毒血癥中，微生物從一個(gè)(通常隱蔽的)來源中持續(xù)或間斷性地釋放入體液中，大多數(shù)進(jìn)入血液循環(huán)，以及椎管中。在膿毒血癥的情形下，特別重要的是，能夠快速檢測(cè)并鑒定病原類型從而立即給予適當(dāng)?shù)闹委?。目前情況值得警惕:在德國每年有超過60，000人死于膿毒血癥；其已成為第三大常見死因。在美國，根據(jù)疾病預(yù)防控制中心(CDC)的估算，每年約有230，000人死于膿毒血癥。近年來，膿毒血癥病例數(shù)持續(xù)增長，每年增長約1.5%。死亡率超過40%?？焖勹b定可增加生存率。在當(dāng)今全球使用的傳統(tǒng)質(zhì)譜鑒定方法中，首先要培養(yǎng)微生物長成菌落。通常皮氏培養(yǎng)皿中用于培養(yǎng)的營養(yǎng)培養(yǎng)基為瓊脂，其可獲得“單菌落”，培養(yǎng)時(shí)間以小時(shí)、天或周計(jì)算，這取決于微生物的活力。如果添加或混合菌落，則可通過第二次培養(yǎng)獲得單菌落。用小棉棒將所選菌落轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜儀樣品支撐盤上，并用基質(zhì)(通常為α-氰基-4-羥基肉桂酸[HCCA]或2，5_ 二羥基苯甲酸[DHB])的強(qiáng)酸溶液噴灑，以便借由基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)將其電離，從而使得微生物崩解。酸(通常為甲酸或三氟乙酸)可以攻擊細(xì)胞壁，并且基質(zhì)溶液的有機(jī)溶劑(通常為乙腈)能夠滲入微生物的細(xì)胞內(nèi)并使變?nèi)醯募?xì)胞壁破裂。接下來通過蒸發(fā)溶劑干燥樣品，同時(shí)會(huì)引起溶解的基質(zhì)結(jié)晶。微生物中的可溶性蛋白以及細(xì)胞內(nèi)的一些其它物質(zhì)會(huì)在這一過程中摻入基質(zhì)結(jié)晶中。摻入分析物分子的基質(zhì)結(jié)晶可在質(zhì)譜儀中用聚焦紫外激光脈沖轟擊，生成蒸汽等離子體形式的分析物分子的離子，而這些離子可在質(zhì)譜儀中根據(jù)離子質(zhì)量分離進(jìn)行測(cè)量?；谶@一目的，通常采用飛行時(shí)間質(zhì)譜。該質(zhì)譜記錄這些分析物離子，其主要為蛋白質(zhì)離子。對(duì)于鑒定具有最有價(jià)值信息的離子的質(zhì)量約為3，000至15，000原子質(zhì)量單位。在本方法中，蛋白離子絕大部分是單電荷(電荷數(shù)Z = 1)，因此只需要提及離子的質(zhì)量m，而不需總是使用“質(zhì)量電荷比”m/z (而在使用其他類型的質(zhì)譜儀時(shí)這是必須且約定俗成的)?？扇苄缘鞍踪|(zhì)離子圖譜，例如質(zhì)譜，非常能反映所關(guān)心的微生物種屬的特性，這是因?yàn)槊恳环N微生物可產(chǎn)生自身的基因決定的蛋白質(zhì)混合物，每種蛋白質(zhì)具有特定質(zhì)量。較高濃度的可溶性蛋白質(zhì)的豐度可通過質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)，同樣很大程度上由基因決定，僅少部分取決于營養(yǎng)狀況或菌落成熟度。蛋白質(zhì)圖譜可用于微生物種屬的定性，正如人類的指紋鑒定一樣。目前許多公共和私人研究所正在采集可靠的參比質(zhì)譜圖供參比圖庫使用，這樣就可用于醫(yī)學(xué)診斷目的。不過所有的診斷方法需要根據(jù)相應(yīng)國家法律由官方機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)。在經(jīng)驗(yàn)證的儀器上的使用經(jīng)驗(yàn)證的圖庫的質(zhì)譜鑒定方法已在數(shù)個(gè)州市獲批。這一質(zhì)譜鑒定法已被證明非常成功。其準(zhǔn)確鑒定的可靠性遠(yuǎn)高于目前為止所用的微生物鑒定法。目前已證實(shí)，對(duì)于上百種不同種屬的微生物，鑒定確定度可超過95%。存在疑慮的情況下，如果與目前微生物鑒定方法存在偏倚，則在大多數(shù)情況下基因測(cè)序可確證質(zhì)譜鑒定是正確的。由于微生物種屬間的關(guān)系也可通過質(zhì)譜圖的相似度進(jìn)行鑒定，所以甚至可能在簡(jiǎn)單的質(zhì)譜鑒定的幫助下校正分類體系中微生物種屬的分類，最終需要通過更為復(fù)雜的DNA測(cè)序證實(shí)。為鑒定微生物，質(zhì)譜將測(cè)量約2，000原子量單位至20，000原子量單位，不過在低于約3，000原子量單位的較低質(zhì)量范圍內(nèi)的質(zhì)量信號(hào)的價(jià)值較小，這是因?yàn)槠淇梢詠碓从谕獠课降陌欢嚯囊约昂币姾投嘧兊钠渌镔|(zhì)，例如膳食依賴性脂肪酸。通過僅評(píng)估約3，000-15, 000原子量范圍內(nèi)的質(zhì)量信號(hào)可獲得最佳的鑒定結(jié)果。目前基于這一目的使用的超敏感質(zhì)譜僅具有低質(zhì)量解析，這意味著僅相差一個(gè)原子量單位的同位素基團(tuán)將無法在該質(zhì)量范圍內(nèi)被解析。僅測(cè)量同位素基團(tuán)的離子包。這種鑒定微生物的方法需要純微生物培養(yǎng)物，即所謂的“分離物”，以便取得沒有與其他微生物類型信號(hào)重疊的質(zhì)譜。不過目前已發(fā)現(xiàn)，也可評(píng)估兩種微生物混合物的質(zhì)譜圖，這樣可鑒定兩種微生物種屬(例如，參見DE 10 2009 007 266 Al，M.Kostrzewa et al.)。鑒定可靠性僅受到輕微影響。如果該質(zhì)譜圖中超過2種微生物種屬，或者這2個(gè)微生物種屬的濃度相差很大，則會(huì)大大降低鑒定可能性和確定度。盡管膿毒血癥對(duì)生命產(chǎn)生很高風(fēng)險(xiǎn)，但是其在血液中僅有少量微生物；在膿毒血癥的成人患者中，每毫升血液僅有0.5-10個(gè)微生物能夠繁殖。在嬰兒中，這一密度會(huì)高得多，因?yàn)閶雰旱拿庖呦到y(tǒng)尚未完全發(fā)育。在成人中，血液中的微生物可被多種機(jī)制打敗:例如被抗體識(shí)別后經(jīng)由巨噬細(xì)胞，以及經(jīng)由內(nèi)源性抗生素，例如防御素。當(dāng)血液中的防御機(jī)制未能以比感染位點(diǎn)釋放微生物的速度快許多的速度摧毀這些微生物，則會(huì)出現(xiàn)膿毒血癥；這樣會(huì)快速形成次級(jí)位點(diǎn)，例如在心臟瓣膜上，這通常需要立即手術(shù)。在一些清潔的體液中，例如腦脊液，一定體積內(nèi)的微生物數(shù)量要比血液中高出許多，這樣無需預(yù)先擴(kuò)增、直接分離為質(zhì)譜鑒定提供很好的機(jī)會(huì)。如想獲得成功的醫(yī)學(xué)治療，則體液中存在病原至病原鑒定的時(shí)間是至關(guān)重要的。文件WPO 2009/065580 Al (U.Weller 2007)描述了一種通過離心和質(zhì)譜鑒定直接從體液中分離感染性物質(zhì)的方法。例如，可從沉淀(團(tuán)塊)直接轉(zhuǎn)移微生物至質(zhì)譜樣品支撐盤上。不過，這種直接分離微生物的分析方法僅在體液中存在高濃度微生物的情況下可行，例如就像在腎病患者或生殖器感染 患者的尿液中。如果在體液中存在人體細(xì)胞，則必須在分離微生物之前將其裂解，例如通過滲透作用；不過目前已有其它裂解方法。
對(duì)于膿毒血癥，一種名為“裂解離心”的方法已有30年的歷史；在采樣后立即加入皂甙(一種弱表面活性劑)的幫助下，該方法幾乎可完全溶解血液顆粒，通過小心離心可分離得到微生物，在皮氏培養(yǎng)皿中用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)(血液不會(huì)產(chǎn)生干擾影響)。數(shù)家公司已于十年前生產(chǎn)和銷售添加皂苷及其它添加劑的適當(dāng)制備管("Isolator ")以及相應(yīng)工具，首家公司是 DuPont (Wilmington, USA),隨后是 Wampole Laboratories,Cranbury, NJ, USA,目前 Oxoid Limited, Basingstoke, Hampshire, England 也具備。Isolator 是Carter-Wallace, Inc.的商標(biāo)(公司位于美國紐約州的紐約市，郵編:10105)。專利申請(qǐng)US 20100120085 (J.Hyman et al.)要求保護(hù)一種通過質(zhì)譜掃描對(duì)樣品中微生物進(jìn)行質(zhì)譜表征和鑒定的方法，其中采用已知表面活性劑溶解的方法破壞非微生物細(xì)胞；然后通過離心分離得到微生物，并通過質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。本文件還隸屬于最接近的現(xiàn)有技術(shù)。從體液中直接分離微生物進(jìn)行質(zhì)譜分析的方法僅在每毫升具有超過IO4個(gè)微生物的高濃度情況下是成功的。實(shí)際上，其僅適合于尿液、重度感染組織、化膿性部位，或者有時(shí)為腦脊液或滑液。在其它體液中，例如血液或淋巴液，微生物的數(shù)量通常很少，甚至是重度膿毒血癥。甚至在急性膿毒血癥中，每毫升血液中僅不到10個(gè)微生物。這么少的數(shù)量不足以直接進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，因此必須在此之前進(jìn)行培養(yǎng)以擴(kuò)增微生物。數(shù)十年以來，使用在目前有大量市售的特殊血液培養(yǎng)瓶中的所謂的“血液培養(yǎng)”來培養(yǎng)血液中的微生物。這涉及向血液中添加適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)物質(zhì)和抗凝劑，以及患者在血樣采集前向患者施用的任何抗生素的抑制劑或吸附劑。不同廠商生產(chǎn)的血液培養(yǎng)瓶采用的抗生素吸附劑類型大不相同。例如，采用試驗(yàn)活性炭或開孔式塑料泡沫珠。不過，兩者均會(huì)阻礙微生物生長。在通常實(shí)踐中，同時(shí)試使用2種血液培養(yǎng)瓶，其中一個(gè)供好氧微生物使用，另一個(gè)供厭氧微生物使用。現(xiàn)代血液培養(yǎng)瓶都帶有信號(hào)系統(tǒng)，如在適當(dāng)裝配的孵育器中使用，當(dāng)生長的微生物數(shù)量足夠用于微生物鑒定，則會(huì)自動(dòng)發(fā)出信號(hào)。該信號(hào)是基于對(duì)CO2含量或壓力增加的測(cè)定，不過觸發(fā)信 號(hào)時(shí)，血液中微生物的密度已經(jīng)很高了。通常質(zhì)譜鑒定會(huì)早于信號(hào)觸發(fā)數(shù)小時(shí)或數(shù)天，因此對(duì)于快速質(zhì)譜鑒定至少需要更為靈敏的觸發(fā)機(jī)制。一旦在血液培養(yǎng)基中生長了足夠數(shù)量的微生物，則必須通過離心或過濾分離微生物用于質(zhì)譜鑒定。必須去除所有痕量人體蛋白質(zhì)以及來自營養(yǎng)培養(yǎng)基的痕量蛋白質(zhì)以免干擾質(zhì)譜鑒定。例如，溶解所有人體細(xì)胞后通過離心分離得到足夠數(shù)量的微生物時(shí)，可添加數(shù)微升的強(qiáng)酸(甲酸或三氟乙酸)以及大約等量的乙腈裂解微生物；然后可以將含有釋放出的蛋白質(zhì)的溶液轉(zhuǎn)移至樣品支撐盤上。如果離心后看不到沉淀的話，在可能分離微生物解離。沉淀物的能見度極限約為IO6個(gè)微生物；相比之下，檢測(cè)限約為IO4個(gè)微生物，但是未來仍有提高的可能。IO4個(gè)微生物一般含有100飛克以上的可溶性蛋白質(zhì)，但開發(fā)出的最佳方法的質(zhì)譜檢測(cè)限遠(yuǎn)低于此。因?yàn)樵诮^大多數(shù)情況下(超過70% )，僅由單一種的微生物造成急性微生物感染，所以可成功通過質(zhì)譜鑒定體液中的微生物。僅在少數(shù)情況下(約15% )涉及2種微生物種，則其均可在質(zhì)譜中檢測(cè)到。急性感染病原體的純度與其他人體內(nèi)或人體表面出現(xiàn)的微生物形成鮮明對(duì)比。如人體腸道菌叢大約有IO14個(gè)細(xì)菌，至少由400個(gè)細(xì)菌種組成，這些細(xì)菌互相均衡地生活。通常血液和其它體液是無菌的，例如在正常狀態(tài)下，不包含任何微生物。體液中的微生物通常同時(shí)被數(shù)種防御機(jī)制立即攻擊、殺死和清除。發(fā)明目的本發(fā)明旨在提供一些可檢測(cè)和鑒定血液中(膿毒血癥)或其它體液中的感染性微生物的方法和裝置，其檢測(cè)和鑒定速度比目前的方法和裝置快數(shù)小時(shí)或數(shù)天。
發(fā)明摘要上述血液培養(yǎng)基并不是微生物的理想培養(yǎng)基；數(shù)種微生物很難在血液培養(yǎng)基中生長。血液基本不適合微生物生長:除了吞噬微生物的巨噬細(xì)胞外，其還包含抗菌物質(zhì)，例如防御素和抗菌酶。此外，膿毒血癥患者的血液通常還包含廣譜抗生素，在采集血樣進(jìn)行診斷前該患者已服用抗生素作為最初的治療。本發(fā)明認(rèn)識(shí)到這一情況，并提供一種方法，其(a)很大程度上(如可能在采樣后立即)破壞和溶解體液中的人體細(xì)胞，例如血液中的紅細(xì)胞和白細(xì)胞，同時(shí)必須保持微生物能夠繁殖，然后(b)通過例如離心或過濾從液體中分離病原微生物，(c)在一種不含有任何體液抗微生物成分的營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)微生物，(d)從營養(yǎng)肉湯中再次分離，并(e)通過分析微生物蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖與參比圖譜的類似性來進(jìn)行鑒定微生物。質(zhì)譜鑒定微生物的基本方法還可以在步驟(C)中包括用于監(jiān)測(cè)培養(yǎng)過程中微生物生長情況的定量方法，特別是光學(xué)方法。這些方法可早期監(jiān)測(cè)微生物的存在，同時(shí)對(duì)微生物進(jìn)行粗略分類。僅在使用光學(xué)透明的營養(yǎng)肉湯的情況下方可進(jìn)行光學(xué)監(jiān)測(cè)，有時(shí)一些特殊配方可輔助測(cè)量程序。例如，可以進(jìn)行光譜測(cè)量，例如在不同電磁譜區(qū)進(jìn)行光散射分析、消光測(cè)量、熒光測(cè)量。而且，可以 應(yīng)用聲學(xué)或電測(cè)監(jiān)測(cè)方法。優(yōu)選在僅含有很少量營養(yǎng)肉湯的微培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)以增加微生物密度，從而提高附帶的監(jiān)測(cè)方法的靈敏度。這些生長監(jiān)測(cè)的早期中間結(jié)果對(duì)于患者來說是救命的，不過如果檢測(cè)不到生長的微生物，也可以停止該方法。特別的，附帶方法可確定進(jìn)行質(zhì)譜鑒定的最早時(shí)間點(diǎn)。鑒定本身費(fèi)時(shí)很短，這樣可在早期階段開始靶向治療。本發(fā)明的一個(gè)重要方面是將巨噬細(xì)胞中的細(xì)菌種屬釋放出來，例如分枝桿菌或李斯特氏菌。經(jīng)步驟(b)分離得到微生物后，也可以加入檢測(cè)方法，例如nano-NMR或微拉曼廣譜法(miciO-Raman)，以檢測(cè)是否存在任何微生物。目前現(xiàn)代光譜學(xué)或電磁方法的發(fā)展大大提高了靈敏度，甚至可檢測(cè)到僅存在數(shù)個(gè)微生物的存在。這種方法為質(zhì)譜鑒定提供了足夠的充分純化的病原體，并比任何已知方法更為快速。當(dāng)治療患者的醫(yī)生知道微生物種屬時(shí)，其可立即開始針對(duì)性治療，因?yàn)槟壳耙阎蠖鄶?shù)微生物應(yīng)答的抗生素。通常已知該微生物種屬的耐藥情況，這在地區(qū)之間或醫(yī)院之間可能會(huì)不同。不過也可以使用培養(yǎng)的部分微生物來確定其對(duì)抗生素的耐藥性。對(duì)于因膿毒血癥、重度膿毒血癥或感染性休克進(jìn)入重癥監(jiān)護(hù)室進(jìn)行治療的患者，盡早開始針對(duì)性的和有希望的治療不僅可以比現(xiàn)在更能拯救患者生命，同時(shí)早期康復(fù)也會(huì)大大降低治療費(fèi)用，因?yàn)榛颊咴谥匕Y監(jiān)護(hù)室的住院時(shí)間縮短。
附圖簡(jiǎn)介


圖1示出了根據(jù)本發(fā)明方法所用的一種培養(yǎng)瓶，其是離心管(1)的形式，其管帽
(2)具有一個(gè)隔片(3)和一個(gè)分壓測(cè)量系統(tǒng)(4)。預(yù)真空培養(yǎng)瓶(1)具有一個(gè)書寫平板(5)，上面有一個(gè)額外的條碼出)、一個(gè)內(nèi)部涂層(7)，后者可隨著CO2增多而改變顏色以及一種可溶解人體顆粒的溶液(8)。圖2闡釋了一個(gè)帶有入口毛細(xì)管(11)和(13)的微培養(yǎng)瓶(12)，其用隔片(10)和
(14)封閉。微培養(yǎng)瓶的體積僅約為100μ 1，其經(jīng)過預(yù)真空化，可直接使用，這樣可以很容易地用注射器將營養(yǎng)肉湯中的微生物穿過其中一個(gè)隔片。微生物在微培養(yǎng)容積(12)內(nèi)生長，可通過外部測(cè)量裝置(17)或(19)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。例如，也可以在檢測(cè)器中(17)測(cè)量從外部激光二極管(15)的光束消光(16)，如果已生長了足夠數(shù)量的微生物則可發(fā)出信號(hào)。也可以在檢測(cè)器中(19)監(jiān)測(cè)光束(16)的散射光(18)。如果光束(16)可激發(fā)出與微生物成正比的熒光物質(zhì)，則可用檢測(cè)器(19)監(jiān)測(cè)熒光(18)。消光、散射光或熒光曲線可提供微生物存在的早期信息。類似地也可使用其它類型的光度計(jì)。完成培養(yǎng)后，一旦離心分離微生物后，可使用螺帽(20)打開微培養(yǎng)瓶。將營養(yǎng)肉湯移除后，微生物可在微培養(yǎng)瓶中裂解，提取液可與溶解的微生物蛋白一同被取出。圖3示一個(gè)帶有隔片(31)的非常簡(jiǎn)單的微培養(yǎng)瓶(30)，其可填充約100-200 μ I營養(yǎng)肉湯(32),在監(jiān)測(cè)范圍內(nèi)包含一個(gè)長光源(34)和一個(gè)消光檢測(cè)器(35)。本圖底部橫斷面圖示消光檢測(cè)器(35)或散射光檢測(cè)器(36)的布局，散射光在最高密度處向前彎曲，或熒光檢測(cè)器(37)，其以約等密度向各個(gè)方向輻射。小瓶很適合于培養(yǎng)后離心、洗滌以及將沉淀微生物在酸性基質(zhì)溶液中崩解。圖4示根據(jù)本發(fā)明的基本程序步驟圖。圖5示一個(gè)帶有插入步驟的優(yōu)選程序的更為詳細(xì)的示意圖。
優(yōu)選實(shí)施例如圖4所示，本發(fā)明提供一種方法，其包含以下基本步驟:a)溶解體液中的人體細(xì)胞，優(yōu)選采用弱表面活性劑；b)從體液中分離微生物，例如通過離心或過濾；c)在營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)微生物，其中營養(yǎng)肉湯中不含有體液中抗微生物的成分；d)從培養(yǎng)基中分離微生物，例如通過離心或過濾；e)通過對(duì)微生物蛋白質(zhì)譜與參比譜圖的類似性分析來鑒定微生物。圖5更為詳細(xì)地顯示了本方法的優(yōu)選實(shí)施例，其包含插入步驟bl)，b2)，cl)，c2)和dl)。在同一實(shí)施例中并不需要進(jìn)行所有其它步驟。術(shù)語“體液”廣義上指的是可被微生物感染的機(jī)體內(nèi)所有內(nèi)部或分泌的液體。除了血液外，其還包含淋巴液、滑液、腦脊液、尿液、淚液、組織勻漿液以及來自化膿性膿腫或發(fā)炎的鼻粘膜的液體。在其中一些液體中，微生物濃度很高，在干凈分離微生物后，甚至無需進(jìn)一步培養(yǎng)，即可成功進(jìn)行即時(shí)鑒定。本發(fā)明不關(guān)注這些液體；在這些液體中的微生物可采用上述WPO 2009/065580 Al (U.Weller 2007)中的一種方法進(jìn)行直接分離和鑒定。但是，在大多數(shù)體液中，微生物的含量很低，必須在鑒定前對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)以高度擴(kuò)增。這也就是本發(fā)明的目的所在。下面詳述的方法采用血液作為體液；不過,也可使用其它體液,但是必須相應(yīng)地添加一定量的表面活性劑和其它物質(zhì)。這里的描述將離心作為將微生物從液體中分離的方法，但并不排除過濾或其它分離方法，例如磁珠吸附?；旧希诓襟E(a)中在離心前用蒸餾水就可以破壞血球，這會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)血球因?yàn)闈B透作用而破裂。重復(fù)離心和加入蒸餾水可幾乎破壞所有血球。與微生物一同離心分離出來殘余的細(xì)胞膜碎片幾乎不干擾后續(xù)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。不過，優(yōu)選的方法在步驟(a)中采用弱表面活性劑以崩解和溶解血液顆粒。尤為重要的是，使用精確稱量的無毒弱表面活性劑進(jìn)行血球溶解，這樣甚至敏感的微生物也完全能保留繁殖能力。例如，優(yōu)選經(jīng)過稀釋的、無毒皂苷溶液。血球精細(xì)的細(xì)胞膜主要由磷脂組成，其以非共價(jià)鍵結(jié)合形成細(xì)胞膜。表面活性劑可溶解蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的非共價(jià)鍵。細(xì)胞膜的磷脂本身是兩性的，即它們具有表面活性劑的特點(diǎn)，可通過形成微球而被其它表面活性劑溶解為納米膠質(zhì)，這樣添加的表面活性劑可鍵合至其很難再破壞微生物的程度，。本發(fā)明的另一個(gè)重要方面是通過溶解血球，從巨噬細(xì)胞或其它人體血細(xì)胞中釋放寄居的細(xì)菌，例如分支桿菌或李斯特氏菌。在采集血樣后優(yōu)選立即溶解血球，并從血液中分離微生物，這是因?yàn)閷⒚舾械奈⑸镩L時(shí)間留在血液中，則其可能會(huì)喪失增殖能力。對(duì)于敏感微生物，在血液中活微生物的生存半衰期僅為數(shù)小時(shí)，而健壯的微生物甚至可在血液中繁殖。但是即使在皂苷溶解的血液中，敏感微生物的半衰期也不會(huì)太長；因此推薦在溶解血球后最遲2小時(shí)內(nèi)通過離心或過濾將微生物從液體中分離出來。使用蒸餾水裂解或用精確量的表面活性劑溶解，在這兩種情況下，液體中的殘?jiān)繒?huì)不同，例如未完全溶解的細(xì)胞壁和血球的其它不可溶性成分，但是不會(huì)顯著影響本方法的殘?jiān)?。這些成分可通過稍后步驟(d)中洗滌分離得到的微生物中去除，該步驟有一個(gè)特別的洗滌步驟(dl)，用強(qiáng)表面活性劑溶解所有非微生物蛋白。在步驟(a)中，很重要的一點(diǎn)是，破壞血球要保證將所有隱藏在細(xì)胞中的微生物釋放出來。在步驟(b)中從液體分離微生物后,去除所有可溶性人體蛋白，包括來自血球的可溶性蛋白，以及對(duì)微生物繁殖有害的所有內(nèi)源性抗體，例如防御素和抗微生物酶。防御素在中性粒細(xì)胞中組成高達(dá)30%的顆粒物質(zhì),在白細(xì)胞中組成高達(dá)60%。如需要，插入洗滌步驟(bl)。同時(shí)特別重要的一點(diǎn)是，去除所有已作為膿毒血癥患者治療的一部分的廣譜抗生素，這要在步驟(b)和(bl)中自動(dòng)進(jìn)行。市售的血液培養(yǎng)瓶包含不同類型的顆粒物質(zhì)，可使這項(xiàng)抗生素?zé)o害，包括活性炭以及硬質(zhì)開孔塑料泡沫珠。制造商對(duì)這些添加劑多有爭(zhēng)論，不過它們均會(huì)有損于血液培養(yǎng)基中的微生物生長，這部分因?yàn)槠淇衫喂涛轿⑸?，也可能是因?yàn)楫?dāng)血液培養(yǎng)瓶在孵箱中來回移動(dòng)實(shí)際上會(huì)碾壓微生物。之前提到可清潔在步驟(C)中充分培養(yǎng)后沉淀的微生物的中間洗滌步驟(dl)，其可去除不屬于微生物的所有痕量殘留的外源蛋白，即所有人體蛋白以及所有來自于培養(yǎng)基并可吸附質(zhì)微生物的蛋白。甚至活微生物從血球未溶解的細(xì)胞壁上產(chǎn)生的可溶性蛋白。如果在質(zhì)譜中來自外源蛋白的信號(hào)疊加在微生物蛋白的信號(hào)上，則鑒定會(huì)變得困難得多。步驟(dl)中的清潔可采用強(qiáng)表面活性劑完成，例如SDS (十二烷基硫酸鈉)，因?yàn)閷?duì)于質(zhì)譜鑒定而言，微生物不需要保持其繁殖能力。最后，必須裂解微生物，釋放出可溶性蛋白，從而獲取微生物蛋白的質(zhì)譜圖用于步驟(e)中的質(zhì)譜鑒定。正如簡(jiǎn)介中所述，優(yōu)選當(dāng)微生物仍在離心管中的時(shí)候，加入數(shù)微升的強(qiáng)有機(jī)酸，例如甲酸或三氟乙酸，以及數(shù)微升的乙腈進(jìn)行微生物裂解；不過目前通常在將微生物鋪在質(zhì)譜樣品支撐盤上后也可裂解微生物。使用傳統(tǒng)方法獲取微生物蛋白的質(zhì)譜圖，并在步驟(e)中通過與參比圖譜進(jìn)行類似性分析完成鑒定。如果采用離心，則可在同一離心管中進(jìn)行步驟(a)至⑷以及裂解微生物以獲得微生物蛋白溶液供質(zhì)譜采集。例如，這里使用的是一個(gè)1.5ml標(biāo)準(zhǔn)離心管。不過，為了足夠確定地檢測(cè)每毫升僅有0.5個(gè)活菌的膿毒血癥，使用特殊的培養(yǎng)皿(約15ml)則更有優(yōu)勢(shì)，其可使用8-10ml血液。目前其體積與所用的血液培養(yǎng)瓶體積類似,不過其可進(jìn)行離心,而血液培養(yǎng)瓶則不行。例如，分析嬰兒的血液時(shí)可使用1.5ml標(biāo)準(zhǔn)離心管，因?yàn)樵谶@種情況下僅可獲得少量血液，而在膿毒血癥情況下嬰兒血液中的微生物含量通常較高。此處所述方法適用于較大的離心管。當(dāng)使用一個(gè)預(yù)制的即用型15ml離心管時(shí)，可加入約8ml血液。優(yōu)選用隔片密封離心管并進(jìn)行預(yù)真空化；其經(jīng)過預(yù)制，含有2-4ml無菌溶液，其中包含約240 μ g無毒皂苷、少量泡沫抑制劑和至少一種抗凝劑。血液培養(yǎng)物處理方法中得知無菌灌入血液的精準(zhǔn)原則。小心顛倒離心管5次，立即混合其中的液體，30秒后在3000g下離心10分鐘，然后微生物形成一個(gè)松散的沉淀塊。用無菌注射器小心去除上清；插入一個(gè)帶有微濾器的無菌毛細(xì)管針，這樣無菌空氣可流入?，F(xiàn)在再用無菌注射器向微生物中添加IOml培養(yǎng)基。振蕩培養(yǎng)基使微生物分散開；將離心管在特定溫度下服用特定時(shí)間。孵育過程中輕微振蕩，效果更佳，這樣可防止微生物沉淀。市售的血液培養(yǎng)瓶通常帶有信號(hào)裝置，其可安裝在孵箱上，當(dāng)微生物生長至足夠數(shù)量時(shí)可提示。有時(shí)這些信號(hào)裝置是基于孵箱壁涂層顏色隨CO2含量改變而改變，有時(shí)是基于對(duì)CO2增加的不同類型的測(cè)量或僅基于氣壓增加。測(cè)量CO2含量時(shí)，一般必須使用2個(gè)血液培養(yǎng)瓶:一個(gè)供好氧微生物，一個(gè)供厭氧微生物。雖然由于靈敏度較低，這些信號(hào)裝置距離理想的質(zhì)譜鑒定仍有距離，但其還可應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明方法的培養(yǎng)皿中。由于血球并不釋放CO2，所以效果會(huì)更好。圖1示一種培養(yǎng)皿，其包含一個(gè)離心管(1)，管帽(2)具有一個(gè)隔片(3)和一個(gè)微分壓測(cè)量系統(tǒng)(4)。培養(yǎng)皿(I)具有一個(gè)帶有額外條碼(6)的書寫平板(5);其經(jīng)預(yù)真空化，可供填充。作為分壓測(cè)量系統(tǒng)(4)的替代方法，離心管可具有一個(gè)內(nèi)部涂層(7)，后者可變換顏色來提示CO2增力口。離心管含有精確稱量的一種溶液(8)，其可溶解人體細(xì)胞，例如該溶液的組成包含溶解在無菌水中的皂苷、抗凝劑和泡沫抑制劑。如上所述，帶有微濾器的無菌注射器和針頭用于填充離心管和更換液體。必須小心避免從環(huán)境中帶入任何污染微生物直至完成孵育?？墒褂?種裝有不同類型培養(yǎng)基的相同培養(yǎng)皿類培養(yǎng)好氧和厭氧微生物。在足夠長時(shí)間的孵育(步驟c)后，再次通過離心(步驟d)分離微生物，如果培養(yǎng)皿可以離心的話，則10，OOOg下3分鐘就足夠了。棄上清，用溶于水的0.5% SDS溶液振搖微生物，卻出所有殘留的人體或培養(yǎng)基蛋白(步驟dl)。再次離心和棄上清后，用蒸餾水洗滌微生物并再次離心。重要的一點(diǎn)是，必須去除所有痕量SDS，因?yàn)镾DS (和其它強(qiáng)表面活性齊U)會(huì)大大降低質(zhì)譜儀離子源中蛋白的電離。采用傳統(tǒng)方法裂解微生物以釋放可溶性蛋白、采集質(zhì)譜圖并對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行微生物鑒定(步驟e)，在此不再詳述。除了在步驟(b)和 (d)中通過離心分離微生物外，還可通過微過濾分離和洗滌。通常使用離心進(jìn)行微過濾。由于添加表面活性劑可完全溶解血細(xì)胞的細(xì)胞膜及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，微過濾也可獲得微生物的純分離物。經(jīng)驗(yàn)顯示約15%的血液培養(yǎng)物表現(xiàn)為陽性結(jié)果。由于盡早檢測(cè)出疑似膿毒血癥中是否存在膿毒血癥對(duì)于一名患者的生存極為有利，可在步驟(b)中首次分離微生物后插入質(zhì)譜檢測(cè)沉淀的微生物，例如nano-NMR或微拉曼廣譜。目前正在研發(fā)用于檢測(cè)離心沉淀中是否存在單個(gè)微生物的超敏微譜和電磁方法。盡早確定是否存在微生物不僅可節(jié)省后續(xù)方法費(fèi)用，同時(shí)對(duì)于主治醫(yī)生而言也非常重要，醫(yī)生可據(jù)此盡早調(diào)整治療。盡管目前這些檢測(cè)尚未成功，但在今后可能會(huì)非常重要。更令人期待的是本方法步驟(Cl)中監(jiān)測(cè)微生物擴(kuò)增生長的方法，步驟(C)中培養(yǎng)期間，對(duì)測(cè)量微生物密度具有非常高的靈敏度。在步驟(Cl)中，可通過檢測(cè)微生物密度的增加來在早期確定是否存在能夠繁殖的微生物，而且更重要的是，步驟(Cl)中的監(jiān)測(cè)還可確定能夠開始質(zhì)譜鑒定的最早時(shí)間。然后可停止培養(yǎng)(步驟c2)。本監(jiān)測(cè)僅在本發(fā)明中可以實(shí)現(xiàn):將血液培養(yǎng)基替換為清澈的具有設(shè)定光學(xué)特性的培養(yǎng)基。術(shù)語“清澈”不意味著在全廣譜范圍內(nèi)完全透明；指的是足以應(yīng)用某種光度計(jì)而不產(chǎn)生干擾。在這樣一種自定義組分的培養(yǎng)基中，可使用電磁廣譜范圍內(nèi)的各種光譜法，例如紅外光譜法、拉曼光譜法、散射光和吸收光譜法及其它。例如，熒光光譜法具有很好的檢測(cè)靈敏度。其可通過向培養(yǎng)基中添加物質(zhì)來激發(fā)或輔助，微生物的代謝可產(chǎn)生熒光分解產(chǎn)物，或者其吸附在微生物細(xì)胞壁上產(chǎn)生可測(cè)量的熒光。熒光物質(zhì)吸附在細(xì)胞壁上改變其熒光波長。由于微生物還通常生長在培養(yǎng)皿壁上，還可采用表面測(cè)量方法，例如等離子體共振光譜法(PRS)或表面增強(qiáng)拉曼光譜法(SERS)。也可以采用不同類型的聲學(xué)和震動(dòng)譜。而且，可采用的電子監(jiān)測(cè)方法:例如測(cè)量合適形狀容器中電介質(zhì)常數(shù)。通常不同的測(cè)量方法可不僅追蹤生長，還可粗略對(duì)微生物進(jìn)行分類。甚至生長速度也可提示最初的分類，該分類可能是醫(yī)學(xué)相關(guān)的。當(dāng)使用這些測(cè)量方法監(jiān)測(cè)微生物生長時(shí)，如果在步驟(b)中分離的微生物在容積比血液少許多的培養(yǎng)基中生長時(shí)，其優(yōu)勢(shì)更為突出。在良好的培養(yǎng)基中，微生物會(huì)呈現(xiàn)指數(shù)生長至高達(dá)每毫升IO 7-1O8個(gè)微生物的密度，而質(zhì)樸鑒定僅需約IO4個(gè)微生物。因此進(jìn)行低于Iml的微量培養(yǎng):例如100 μ I培養(yǎng)基就足夠供用于質(zhì)譜鑒定的微生物生長。例如，最初在原始離心管中的100 μ I培養(yǎng)基中短暫培養(yǎng)1-2個(gè)小時(shí)后，可以將步驟(b2)中的微生物轉(zhuǎn)移至一個(gè)特殊形狀的體積僅為100-200 μ I的微培養(yǎng)室中。在該少量培養(yǎng)基中，接種密度以及后續(xù)微生物密度約比在等量血液中培養(yǎng)的100倍。圖2和3示此種微培養(yǎng)室。這種微培養(yǎng)室尤其適合不同類型的光譜法，因?yàn)槲⑸锩芏纫?00倍。微生物以每小時(shí)僅繁殖I代的中等繁殖速度，從單個(gè)微生物培養(yǎng)12小時(shí)可獲得所需IO4個(gè)微生物。侵襲性微生物繁殖速度更快，例如大腸桿菌。圖2中所示的微培養(yǎng)室(12)可簡(jiǎn)單地用一種消光測(cè)量裝置(17)掃描:當(dāng)光束(16)穿過培養(yǎng)室時(shí)，這種裝置可監(jiān)測(cè)因光散射或吸收導(dǎo)致的延遲。無需將光源
(15)和消光測(cè)量單元(17)與微培養(yǎng)室連接，其可安裝在孵育室中，這樣可循環(huán)掃描數(shù)個(gè)微培養(yǎng)室。不僅可測(cè)量消光；一種類似的測(cè)量裝置(19)還可測(cè)量當(dāng)用光束(16)照射生長中的微生物時(shí)所產(chǎn)生的散射光(18)或熒光(18)。無需將光源(15)和消光測(cè)量單元(17)與微培養(yǎng)室連接，其可安裝在孵育室中，這樣可循環(huán)掃描數(shù)個(gè)微培養(yǎng)室。不僅可測(cè)量消光；一種類似的測(cè)量裝置(19)還可測(cè)量當(dāng)用光束(16)照射生長中的微生物時(shí)所產(chǎn)生的散射光(18)或熒光(18)。在如圖4所示的更為簡(jiǎn)單的微培養(yǎng)室(12)中，可非常簡(jiǎn)單地通過橫跨培養(yǎng)管的長二極管系統(tǒng)(34)的光線和使用消光測(cè)量裝置檢測(cè)(34)微生物的生長。檢測(cè)器(35)和
(36)能很容易地檢測(cè)散射光(正向光密度最高)或熒光(各方向光密度相同)。如果微培養(yǎng)室具有有利形狀，則當(dāng)已生長了質(zhì)譜鑒定所需的約IO4個(gè)微生物時(shí)，這些監(jiān)測(cè)裝置可以給出準(zhǔn)確提示。與目前血液培養(yǎng)通常使用的信號(hào)裝置相比，這樣可節(jié)省數(shù)小時(shí)至數(shù)天的時(shí)間，這通常對(duì)患者生存是至關(guān)重要的。如上所述，這類測(cè)量系統(tǒng)還可在早期可靠提示是否存在微生物，甚至進(jìn)行粗略分類，這也對(duì)于患者早期治療至關(guān)重要。本發(fā)明的基本條件——在特殊培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物——方可實(shí)現(xiàn)在微培養(yǎng)室中的培養(yǎng)。與圖2和3所示類似的微培養(yǎng)室適合于上述許多類型的光譜法，雖然培養(yǎng)室壁窗的形狀和材料需要適合光譜法類型。例如，如圖3所示，其形狀也可以直接適合于通過離心從液體中分離微生物，以及適合于最終崩解微生物。也可以在硅片上使用微培養(yǎng)室和電路來測(cè)量硅片上微生物生長情況(“芯片實(shí)驗(yàn)”)。使用特別靈敏的光譜法進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)，例如上述的使用特殊物質(zhì)的熒光光譜法，可更早地監(jiān)測(cè)都微生物的生長。在這種情況下，僅分析能夠生長的微生物，例如確實(shí)有害的微生物；這與步驟(b)后分析沉淀物不同，其也可測(cè)量死亡或無法繁殖的微生物。我們一直強(qiáng)調(diào)，盡早檢測(cè)真正的膿毒血癥對(duì)患者康復(fù)，甚至是生存具有重大意義。本發(fā)明基于在特別有利的培養(yǎng)基中培養(yǎng)基微生物，而不是抗微生物的體液中。正如所釋，正是特殊的培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)了對(duì)微生物生長情況的同時(shí)測(cè)量。不過，首先必須將微生物從體液中干凈地分離出來。所采用的方法與30多年前開發(fā)的一種方法類似，其適用于Isolator 管，可將微生物從血液中干凈地分離出來，該方法已經(jīng)過無數(shù)次的嘗試和建議。其涉及采用一種精確稱量的不含破壞微生物或使之無法繁殖的弱表面活性劑快速溶解不同類型的血球。已證明一 種純化的無毒皂苷是很好的弱表面活性劑，不過還可使用許多其它類型的表面活性劑。血球精細(xì)的細(xì)胞膜主要由磷脂組成，其以非共價(jià)鍵結(jié)合形成細(xì)胞膜。表面活性劑可溶解蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的非共價(jià)鍵，同時(shí)通過離子吸附破壞細(xì)胞內(nèi)大分子蛋白質(zhì)的四級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜的磷脂是親水性的，也就是具有表面活性劑的特性，能夠形成膠束而以納米膠體的形式被其它表面活性劑溶解。這樣，大部分細(xì)胞膜溶解，但是其可大多可與添加至血液中的表面活性劑結(jié)合，這樣就不會(huì)再破壞微生物。血球的大部分內(nèi)部結(jié)構(gòu)也被表面活性劑破壞和溶解，包括細(xì)胞核的核膜以及白血球的DNA。離心之后，隨著去除上清液這些溶解成分也會(huì)被去除。巨噬細(xì)胞也會(huì)被溶解，從而釋放出寄居的任何微生物。另一方面，細(xì)菌的細(xì)胞壁非常穩(wěn)定；它們主要是由交聯(lián)的聚合胞壁質(zhì)組成。對(duì)于革蘭氏陽性菌，還有與聚合的磷壁酸的交叉鏈接。這些共價(jià)鍵網(wǎng)面能夠短暫承受表面活性劑的溶解作用至少數(shù)分鐘。表面活性劑還可滲入微生物中，破壞蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)，這會(huì)破壞其繁殖能力；因此很重要的一點(diǎn)是，在步驟(a)中首次溶解人體細(xì)胞時(shí)使用精密稱量的弱表面活性劑，優(yōu)選無毒皂苷，并僅讓表面活性劑作用一小段時(shí)間。敏感微生物在皂苷血液溶液中的生存半衰期僅為數(shù)小時(shí)。因此必須盡快從液體中分離出微生物。推薦微生物在液體中保留不超過2小時(shí)。因此必須通過信使或特殊傳送系統(tǒng)將裝有血液的培養(yǎng)皿快速送至實(shí)驗(yàn)室，在那里實(shí)施后續(xù)方法。不過也可以用含有抗凝劑的正常血液容器將血液送至實(shí)驗(yàn)室，延遲時(shí)間最短是最重要的。
對(duì)于孵育生長的微生物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定而言，微生物是死是活并不重要，只要其內(nèi)部的蛋白未釋放出來或其原始結(jié)構(gòu)未改變。因此可以在步驟(dl)中使用更強(qiáng)的表面活性齊U，例如SDS(十二烷基硫酸鈉)來清潔微生物以除去所有殘留的外源蛋白。不過必須再次徹底清洗強(qiáng)表面活性劑，因?yàn)榧词故呛哿繗埩?，也?huì)阻礙蛋白電離，從而阻礙獲取質(zhì)譜圖。在根據(jù)本發(fā)明方法的另一實(shí)施例中，首先將離心管中的血液離心。然后去除上清血漿，用弱表面活性劑溶液振搖深紅色的沉淀:例如I %皂苷溶液。I毫升血液中的深紅色沉淀物不但含有微生物，通常還含有5百萬個(gè)紅血球、7千個(gè)白血球，還有5萬個(gè)血小板，將其放入燒瓶與添加的表面活性劑一起混合，從而破壞血球的細(xì)胞膜并釋放出可溶性蛋白質(zhì)。再度離心該深紅色溶液，這時(shí)上清液依然為深紅色，而沉淀物若肉眼可見則是純白色。現(xiàn)在可加入培養(yǎng)基至沉淀中，并進(jìn)行孵育。在本實(shí)施例的修改方案中，還可以僅用蒸餾水振搖深紅色的血球沉淀物。其本身可破壞大多數(shù)的血球。重復(fù)離心和用蒸餾水重懸沉淀可獲得足夠純凈的微生物用于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在進(jìn)行步驟(e)中的質(zhì)譜采集前，裂解微生物并提取可溶性微生物蛋白。最后，將數(shù)微升70%甲酸加入至沉淀的微生物中。甲酸可攻擊微生物細(xì)胞壁上的肽聚糖，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。接著為了盡量溶解更多蛋白質(zhì)而添加等量的乙腈。再次離心溶液從而使固體組分沉淀，例如微生物細(xì)胞壁殘留物。現(xiàn)在必須從上清中溶解的微生物蛋白中獲取質(zhì)譜圖?？稍跀?shù)種質(zhì)譜儀中使用已知的數(shù)種電離方法完成，不過目前僅使用特殊的MALDI飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。 對(duì)于在MALDI飛行時(shí)間質(zhì)譜儀中傳統(tǒng)采集質(zhì)譜，目前每測(cè)量一個(gè)MALDI樣品點(diǎn)要加入約1.5 μ I上清，并進(jìn)行干燥。然后加入約1.5 μ I基質(zhì)物質(zhì)溶液，優(yōu)選溶于50%丙酮水溶液的HCCA，并加入一些(約3% )三氟乙酸(TFA)?；谶@一目的，例如，使用的樣品支撐盤在疏水環(huán)境中親水錨直徑為2毫米。不過也可以使用一次性樣品支撐盤，上面可以刻圈以防止溶液擴(kuò)散。液體形成一個(gè)半球形的液滴，直徑為2毫米。樣品支撐盤上的樣品制劑干燥后，就可以開始取得質(zhì)譜了?？梢杂煤芏喾N方式修改測(cè)量樣品的最簡(jiǎn)單預(yù)制方法。其中一個(gè)選項(xiàng)是利用已經(jīng)涂好一層基質(zhì)溶液薄膜的樣品支撐盤:例如，HCCA?？梢园押屑姿岷鸵译娴纳锨逡河靡埔汗苤苯右频皆摫印Ｔ摫∧ぞ哂辛⒓唇Y(jié)合表面所有蛋白的性能，這樣約I分鐘后可去除殘留液體。這也可以去除雜質(zhì)。接下來可以選擇性地添加一滴丙酮，通過重結(jié)晶把蛋白質(zhì)牢牢地嵌入薄膜的小結(jié)晶體內(nèi)。完成培養(yǎng)后，制備用于在MALDI飛行質(zhì)譜儀中獲取質(zhì)譜圖的測(cè)量樣品共費(fèi)時(shí)約10-15分鐘。現(xiàn)在通過真空鎖將帶有制備好的樣品的樣品支撐盤放入市售質(zhì)譜儀的離子源中。質(zhì)譜儀運(yùn)轉(zhuǎn)約5分鐘。在紫外線脈沖激光以200赫茲運(yùn)轉(zhuǎn)的質(zhì)譜儀中，只需要幾秒即可從測(cè)量的樣品獲得足夠數(shù)量的個(gè)別質(zhì)譜，從而得到非常有用的總質(zhì)譜。因此，數(shù)分鐘后就可以獲得質(zhì)譜。目前有市售的計(jì)算機(jī)軟件可通過質(zhì)譜鑒定微生物。從良好的質(zhì)譜鑒定微生物所需要的時(shí)間視計(jì)算機(jī)的性能、參考質(zhì)譜庫的大小、類似性分析的運(yùn)算法則而定。使用市售的質(zhì)譜儀電腦，從樣品中鑒定質(zhì)譜圖，包括確認(rèn)樣品，僅費(fèi)時(shí)數(shù)分鐘；因此在完成微生物培養(yǎng)后，最晚在半小時(shí)內(nèi)鑒定出微生物種屬。
在另一實(shí)施例中，如果在最后的洗滌步驟后可看到沉淀物，則可用棉棒將分離得到的少量微生物轉(zhuǎn)移至樣品支撐盤上，并按平常制備方法操作。傳統(tǒng)棉棒技術(shù)的質(zhì)譜在很大程度上與離心管內(nèi)加入酸的分解技術(shù)的質(zhì)譜類似。如果證實(shí)質(zhì)譜有差異，該兩種樣品預(yù)制方式的質(zhì)譜可以輸入到質(zhì)譜庫作為參考質(zhì)譜使用。本方法主要提供一種比現(xiàn)行方法快得多的微生物病原鑒定方法，其主要在血液培養(yǎng)皿以及皮氏培養(yǎng)皿中培養(yǎng)微生物。本發(fā)明在對(duì)微生物生長有利的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，而不是在抗微生物的血液中培養(yǎng)，并分離、洗滌和立即通過質(zhì)譜方法鑒定。培養(yǎng)基可允許使用一種靈敏的微生物生長監(jiān)測(cè)方法，這樣當(dāng)已生長了質(zhì)譜鑒定所需的IO4個(gè)微生物后即可停止培養(yǎng)?？刹捎觅|(zhì)譜方法進(jìn)行鑒定，而無需對(duì)該微生物有任何了解，這樣可直接鑒定至微生物所屬的種或亞種。目前沒有任何其它鑒定方法如此快速可靠。鑒定分離出的微生物的最后步驟(e)可按照傳統(tǒng)方法，或者通常通過培養(yǎng)菌落而分離單一類型的微生物。這種隔離自然存在，因?yàn)閷?duì)于急性感染只有一種或最多只有兩種微生物是病原體。這意味著獲得了足夠純的微生物培養(yǎng)物(分離物)。即使有兩種微生物存在，這方法也仍然非常有效。正如之前所強(qiáng)調(diào) 的，快速鑒定膿毒血癥中的微生物是極為重要的。如果該種屬經(jīng)常出現(xiàn)，則通常已了解其耐藥情況，因此不著急確定耐藥性。對(duì)于較少出現(xiàn)的微生物，以及經(jīng)常出現(xiàn)但耐藥情況差異很大的微生物種屬，了解其對(duì)不同抗生素的耐藥性以及，最重要的，了解其耐藥強(qiáng)度是很必要的。在這種情況下，嘗試在存在高濃度抗生素條件下培養(yǎng)的方法，在步驟(d)中少部分微生物沉淀物可用于鑒定該微生物的耐藥情況。如果早期懷疑的微生物不太常見，則在多個(gè)微培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)前先在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在其中一個(gè)培養(yǎng)瓶中，可培養(yǎng)微生物用于質(zhì)譜鑒定，在其它培養(yǎng)瓶中，可培養(yǎng)微生物進(jìn)行多種抗生素耐藥性分析。在本發(fā)明的方法中，首先從內(nèi)源細(xì)胞中分離微生物，這同樣適用于膿腫或其它炎癥部位，因?yàn)樗鼈兺瑯影瑑?nèi)源性細(xì)胞。該方法的一個(gè)例子是化膿性病灶，也就是一些生物的積累物，其中有被部分消化的微生物以及消滅微生物的特定類型的白血球。這里同樣地，內(nèi)源性細(xì)胞可用表面活性劑溶液溶解。另一個(gè)例子是利用棉棒采集鼻粘膜，鑒定其中的微生物(特別是MRSA)是很多人感興趣的。也可以從其它粘膜采集此類樣品。雖然在大多數(shù)情況下，直接分離可提供用于鑒定的足夠微生物，如需要同樣可以在合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在上述方法中，利用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀以基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)電離獲得微生物的質(zhì)譜。一般是這樣，但不是必須的。例如，也可以用靜電噴霧電解來自微生物的可溶性蛋白質(zhì)溶液。這種類型的電離產(chǎn)生質(zhì)量范圍大約為600到1，600道爾頓的重疊程度很高的多電荷離子，需要高分辨率的質(zhì)譜儀。大氣壓下化學(xué)電離法(APCI)更具優(yōu)勢(shì)，其主要提供分析物的單電荷離子。正交發(fā)射離子的飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(OTOF-MS)可以作質(zhì)譜儀使用，也可以使用離子回旋共振質(zhì)譜儀(ICR-MS)或其他高分辨率的質(zhì)譜儀。也可生產(chǎn)和市售上述根據(jù)本發(fā)明方法的不同培養(yǎng)皿。例如，其也可一同放入市售試劑盒中:用于吸液的無菌一次性注射器；例如，注射器形式提供的即用型培養(yǎng)基；供無菌通氣的帶有微濾器的穿刺針；一次性樣品支撐盤和基質(zhì)物質(zhì)。了解本發(fā)明之后，技能熟練的人可以用各種各樣的方式修改上述的方法。上面已描述了基于培養(yǎng)基中培養(yǎng)基的一些修改方案，但肯定還有方法，不僅可對(duì)微生物進(jìn)行早期質(zhì)譜鑒定，還可以 早期生成微生物的其它信息。
權(quán)利要求
1.一種鑒定體液中微生物的方法，包含以下步驟: a)溶解體液中的人體細(xì)胞； b)從體液中分離微生物； c)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物； d)從培養(yǎng)基中分離微生物； e)通過對(duì)微生物蛋白質(zhì)譜與參比譜圖的類似性分析來鑒定微生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中體液為血液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中體液為淋巴液、滑液、腦脊液或勻漿組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的方法，其中在步驟a)中采用一種表面活性劑溶解人體細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中溶解人體細(xì)胞的方法包含一種皂苷溶液，其中添加有泡沫抑制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的方法，其中在步驟b)后研究是否分離微生物，僅當(dāng)已檢測(cè)到微生物時(shí)方可進(jìn)行步驟c)。`
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一所述的方法，其中在步驟c)中微生物培養(yǎng)僅在不到Iml的培養(yǎng)基中進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的方法，其中在步驟c)中微生物培養(yǎng)過程中監(jiān)測(cè)微生物定量生長。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中僅當(dāng)監(jiān)測(cè)提示具有足夠用于質(zhì)譜鑒定數(shù)量的微生物時(shí)，方進(jìn)行步驟c)中的微生物培養(yǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中監(jiān)測(cè)微生物定量生長的方法包含測(cè)量消光、散射光或突光的方法。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中監(jiān)測(cè)培養(yǎng)皿中微生物定量生長的方法包含測(cè)量熒光的方法，其中培養(yǎng)基包含一種物質(zhì)，其被微生物降解或吸附至微生物上可產(chǎn)生一種可測(cè)量的熒光或熒光波長發(fā)生可測(cè)量的改變。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11之一所述的方法，其中采用SDS(十二烷基硫酸鈉)步驟d)中從培養(yǎng)基中分離得到的微生物上的外源蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12之一所述的方法，其中對(duì)于步驟e)中的質(zhì)譜采集，通過基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)方法電離微生物蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13之一所述的方法，其中一部分在培養(yǎng)基中生長的微生物用于測(cè)試其對(duì)抗生素的耐藥性。
15.用于實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1-15之一所述的方法的培養(yǎng)皿，適合通過離心分離微生物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的一種裝置，其允許通過外部測(cè)量裝置監(jiān)測(cè)培養(yǎng)期間微生物的生長情況。
17.步驟a)中根據(jù)權(quán)利要求13或16所述的培養(yǎng)皿經(jīng)預(yù)真空化，可灌入體液，并含有一種表面活性劑、泡沫抑制劑和溶解人體顆粒的抗凝劑的溶液。
18.試劑盒包裝，包含根據(jù)權(quán)利要求15-17之一所述的即用型培養(yǎng)皿和即用型培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于快速檢測(cè)和快速質(zhì)譜鑒定血液(膿毒血癥)或其它體液中感染性微生物的方法和裝置。本發(fā)明認(rèn)識(shí)到血液并不是微生物培養(yǎng)的一種良好環(huán)境，并提供一種方法，其(a)很大程度上(如可能在采樣后立即)破壞和溶解體液中的人體細(xì)胞，例如血液中的紅細(xì)胞和白細(xì)胞，同時(shí)必須保持微生物能夠繁殖，然后(b)通過例如離心或過濾從液體中分離病原微生物，(c)在一種不含有任何體液抗微生物成分的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，(d)從培養(yǎng)基中再次分離，并(e)分析微生物蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖與參比圖譜的類似性來進(jìn)行鑒定。溶解人體細(xì)胞還可釋放出寄居于巨噬細(xì)胞中的微生物。與所有其它培養(yǎng)方法相比，在含有合適組分的光學(xué)透亮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)不僅可加速微生物擴(kuò)增，還可持續(xù)測(cè)量自低微生物密度開始的定量生長。首先，這實(shí)現(xiàn)了在最早的時(shí)間實(shí)施質(zhì)譜鑒定；其次，其在鑒定之前提供了對(duì)微生物的陽性檢測(cè)，這可挽救患者生命；第三，其可盡早開始確定耐藥性。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK103140589SQ201180038142
公開日2013年6月5日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月2日
發(fā)明者M·科斯特?zé)嵬? W·普施, T·邁爾, K·米歇爾曼, J·弗蘭岑 申請(qǐng)人:布魯克-道爾頓有限公司