專利名稱：在植物中制造dha和其他lc-pufa的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大致上關(guān)于重組宿主生物體(譬如植物)，該生物體系以容許和/或增進宿主生物體中PUFAs生產(chǎn)的多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶系統(tǒng)與一或多個輔助蛋白之基因修飾。本發(fā)明亦關(guān)于制造和使用該類生物體(譬如用以獲得PUFAs)的方法以及由該類生物體獲得的產(chǎn)品(譬如油與籽)。
背景技術(shù)：
多不飽和脂肪酸(PUFAs)被認(rèn)為有益于營養(yǎng)應(yīng)用、藥學(xué)應(yīng)用、工業(yè)應(yīng)用、及其它目的。然而，來自天然來源(譬如魚油)或來自化學(xué)合成的PUFAs現(xiàn)有供應(yīng)就長期商業(yè)需求而言并不足夠。衍生自植物(譬如油籽作物)的蔬菜油較便宜且沒有和魚油相關(guān)的污染議題。然而，在商業(yè)開發(fā)植物與植物油發(fā)現(xiàn)的PUFAs通常不包括較飽和或較長鏈PUFAs，并僅通常包括諸如亞油酸(十八個碳，帶有2個雙鍵，在Λ9與12位置一18:2Λ9，12)與亞麻酸(18:3Δ9, 12，15)之脂肪酸。已說明了藉由修飾植物內(nèi)源產(chǎn)生的脂肪酸以在植物中產(chǎn)生較不飽和或較長鏈的PUFAs。舉例來說，已說明了以編碼脂肪酸延長酶和/或去飽和酶的不同個別基因?qū)χ参镞M行基因修飾，結(jié)果生成含有大量較長鏈與較不飽和PUFAs—例如二十碳五烯酸(EPA) —但亦含有大量混合短鏈與較不飽和PUFAs的葉或籽(Qi et al.，NatureBiotech.22:739(2004) ；W004/071467 ；Abbadi et al.,Plant Cell 16:1 (2004) ；Napierand Sayanova, Proceedings of the Nutrition Society 64:387-393(2005) ；Robert etal., FunctionalPlant Biology32:473-479(2005) ；U.S.App1.Pub.N0.2004/0172682)。蕓薹屬(Brassica)包括芥花(canola)-世界上最重要油籽作物之一以及生長在溫帶地區(qū)的最重要油籽作物。芥花傳統(tǒng)上具有油菜(Brassica napus,由蕪菁(Brassicarapa)與甘藍(Brassica oleracea)種間雜交所衍生的品種)的特征，其中芥酸與硫化葡萄糖苷已經(jīng)由常規(guī)育種去除或顯著減少。大部分芥花油系生產(chǎn)為供人類食用的蔬菜油形式。亦有將芥花油用于工業(yè)應(yīng)用的增長中市場。衍生自特定種類芥花籽的食用與工業(yè)油質(zhì)量系取決于其組成脂肪酸，因為脂肪酸不飽和性的種類與份量就飲食與工業(yè)應(yīng)用而言皆有意涵。常規(guī)芥花油含有約60%油酸(C18:l)、約20%亞油酸(C18:2)及約10%亞麻酸(18:3)。常規(guī)芥花通常內(nèi)含的多不飽和亞麻酸水平系非所欲的，因為該油極易氧化，氧化速率受到幾個因素影響，包括氧的存在、曝露至光與熱、油內(nèi)固有或外加抗氧化劑與促氧化劑的存在。反復(fù)油炸(誘導(dǎo)氧化)或長期儲存(自發(fā)氧化)造成的氧化導(dǎo)致走味與腐敗。氧化亦會改變芥花油的潤滑與黏稠性質(zhì)。相對于常規(guī)芥花油，展現(xiàn)降低多不飽和脂肪酸水平并增加單元不飽和油酸水平的油和較高氧化穩(wěn)定性有關(guān)。個別脂肪酸對氧化的易感性取決于其不飽和度。于是，亞麻酸一其擁有三個碳-碳雙鍵一 的氧化速率是油酸一其僅有一個雙鍵一的25倍，是亞油酸的2倍，其有兩個雙鍵。亞油酸與亞麻酸亦對味道與氣味影響最大，因該等容易形成過氧化氫。高油酸油(> 70%油酸)在儲存、油炸與精煉期間較不易氧化，并可加熱至較高溫而不生煙，使其更適宜作為烹飪油。具有籽油中的油酸(C18:l)超過70%(以重量計)且亞麻酸(C18:3)低于3.5%(以重量計)之脂肪酸配置的市售芥花品種例子為Nexera 品種，由 Dow AgroSciences LLC(Indianapolis, IN)發(fā)售，該品種產(chǎn)生 〃ω-9 油",一種非氫化之高油酸、低亞麻酸油，目前在餐廳與餐飲業(yè)用于眾多應(yīng)用，包括油炸、快炒、烘焙、噴霧及用于色拉醬。
發(fā)明概要本領(lǐng)域?qū)τ谟行什⒂行У卦谥参?、植物籽或植物油中制造一定?shù)量(譬如商業(yè)數(shù)量)的較長鏈或較不飽和PUFAs以及在植物、植物籽或植物油的該PUFAs中富含一定數(shù)量的脂質(zhì)(譬如三酸甘油酯(TAG)與磷脂(PL))之較便宜方法有所需求。一種如本案所述藉由提供以多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶和一或多個輔助蛋白之基因改造的重組宿主生物體在宿主生物體(譬如植物)中提供并增進PUFA制造的系統(tǒng)是本領(lǐng)域做法的重要替代方案。本發(fā)明系指涉一種基因改造植物(譬如蕓薹屬)、其子代、籽、細胞、組織或部位，其包含:(i)編碼多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶系統(tǒng)(譬如藻類PUFA合成酶系統(tǒng))之核酸序列，該系統(tǒng)系制造至少一 PUFA ;及(ii)編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPTase)之核酸序列，該酶系將磷酸泛酰巰基乙胺基輔助因子轉(zhuǎn)移至PUFA合成酶系統(tǒng)(譬如藻類PUFA合成酶系統(tǒng))ACP域。在某些具體例中，該基因改造植物、其子代、籽、細胞、組織或部位系來自經(jīng)濟重要蕓薹屬物種(譬如油菜或芥菜(Brassicajuncea))。在某些具體例中,PUFA合成酶系統(tǒng)系包含和SEQ ID NO:1之氨基酸序列至少60%至99%相同的氨基酸序列或包含SEQID NO:1之氨基酸序列。在某些具體例中，編碼PUFA合成酶系統(tǒng)之核酸序列系包含和SEQID N0:6之核酸序列至少60%至99%相同的核酸序列或包含SEQ ID N0:6之核酸序列。在某些具體例中，PUFA合成酶系統(tǒng)系包含和SEQ ID NO: 2之氨基酸序列至少60%至99%相同之氨基酸序列或包含SEQ ID N0:2之氨基酸序列。在某些具體例中，編碼PUFA合成酶系統(tǒng)之核酸序列系包含和SEQ ID NO: 7之核酸序列至少60%至99%相同的核酸序列或包含SEQID N0:7之核酸序列。在某些具體例中，PUFA合成酶系統(tǒng)系包含和SEQ ID N0:3之氨基酸序列至少60%至99%相同的氨基酸序列或包含SEQ ID NO: 3之氨基酸序列。在某些具體例中，編碼PUFA合成酶系統(tǒng)之核酸序列系包含和SEQ ID NO: 8之核酸序列至少60%至99%相同的核酸序列或包含SEQ ID N0:8之核酸序列。在某些具體例中，PUFA合成酶系統(tǒng)系包含SEQ ID NOs:1、2、或3或其任意組合之氨基酸序列。在某些具體例中，編碼PUFA合成酶系統(tǒng)之核酸序列系包含SEQ ID NOs:6、7或8或其任意組合之核酸序列。在某些具體例中，PPTase系包含和SEQ ID NO: 5至少60%至99%相同的氨基酸序列或包含SEQ ID NO: 5之氨基酸序列。在某些具體例中，編碼PPTase之核酸序列系和SEQID NO: 10之核酸序列至少60%至99%相同或包含SEQID NO: 10之核酸序列。在某些具體例中，(i)與(ii)之核酸序列系包含于單一重組表達載體。在某些具體例中，(i)與(ii)之核酸序列系可操作地連接至籽特異性啟動子。在某些具體例中，(i)與(ii)之核酸序列系可操作地連 接至選自由PvDlec2、Pv菜豆素、LfKCS3及FAEl所構(gòu)成之群組的啟動子。在某些具體例中，該基因改造植物(譬如產(chǎn)生芥花油的蕓薹屬物種)、其子代、籽、細胞、組織或部位又包含(iii)編碼?；?CoA合成酶(ACoAS)之核酸序列，該酶系催化長鏈PUFA游離脂肪酸(FFA)轉(zhuǎn)換成?；?CoA。在某些具體例中，ACoAS系包含和SEQ IDNO: 4至少60%至99%相同之氨基酸序列或包含SEQ ID NO: 4之氨基酸序列。在某些具體例中，ACoAS系包含和SEQ IDNO: 9之核酸序列至少60%至99%相同的核酸序列或包含SEQ IDNO:9之核酸序列。在某些具體例中，編碼ACoAS之核酸序列系包含SEQ ID N0:34之核酸序列。在某些具體例中，和/或(iii)之核酸序列系包含于單一重組表達載體。在某些具體例中，和/或(iii)之核酸序列系可操作地連接至籽特異性啟動子。在某些具體例中，⑴、( )和/或(iii)之核酸序列系可操作地連接至選自由下列所構(gòu)成之群組的啟動子:PvDlec2、LfKCS3及FAE1。在某些具體例中，該基因改造植物(譬如蕓薹屬)、其子代、細胞、組織或部位又包含編碼乙?；鵆oA羧化酶(ACCase)之核酸序列和/或編碼第2型二酰基甘油酯?；D(zhuǎn)移酶(DGAT2)之核酸序列。本發(fā)明系指涉一種分離核酸分子，其包含選自下列之核酸序列:SEQ ID NOs:6-10與SEQ ID N0:34、重組表達載體pDAB7361、重組表達載體pDAB7362、重組表達載體PDAB7363、重組表達載體pDAB7365、重組表達載體pDAB7368、重組表達載體pDAB7369、重組表達載體PDAB7370、重組表達載體pDAB100518、重組表達載體pDAB101476、重組表達載體pDAB9166、重組表達載體pDAB9167、重組表達載體pDAB7379、重組表達載體pDAB7380、重組表達載體PDAB9323、重組表達載體pDAB9330、重組表達載體pDAB9337、重組表達載體PDAB9338、重組表達載體pDAB9344、重組表達載體pDAB9396、重組表達載體pDAB101412、重組表達載體PDAB7733、重組表達載體pDAB7734、重組表達載體pDAB101493、重組表達載體pDAB109507、重組表達載體pDAB109508、重組表達載體pDAB109509、重組表達載體pDAB9151、重組表達載體pDAB 108207、重組表達載體pDAB 108208、重組表達載體PDAB108209、重組表達載體pDAB9159、重組表達載體pDAB9147、重組表達載體pDAB108224、或重組表達載體pDAB108225。在某些具體例中，得自該基因改造植物、其子代、籽、細胞、組織或部位的籽油系包含可檢測量的DHA (十二碳六烯酸(C22:6，n-3))和/或EPA ( 二十碳五烯酸(C20: 5，n_3))。在某些具體例中，該籽油系包含0.01%至15%DHA、0.05%至10%DHA、或0.05%至5%DHA。在某些具體例中，該籽油系包含0.01%至59ffiPA、0.05%至596EPA、或0.05%至P/oEPA。在其它具體例中，在籽油中發(fā)現(xiàn)的可檢測量DHA和/或EPA亦可在得自該基因改造植物的糧食和/或膳食中發(fā)現(xiàn)。在某些具體例中，可檢測量DHA和/或EPA系于具有包含-以重量計一70%或更多油酸(C18:l)和/或4%或更少亞麻酸(C18:3)之脂肪酸含量的蕓薹屬物種籽油中發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明系指涉一種油或一種籽，該等系得自本案所述基因改造植物(譬如蕓薹屬)、其子代、細胞、組織或部位。本發(fā)明系指涉一種食品，其包含得自本案所述基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位之油。本發(fā)明亦指涉一種功能食品，其包含得自本案所述基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位之油，或得自本案所述基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位之籽。本發(fā)明系指涉一種醫(yī)藥產(chǎn)品，其包含得自本案所述基因改造植物、其子代、細胞、組織或部位之油。 本發(fā)明系指涉一種制造包含至少一 LC-PUFA之油的方法，該方法系包含從本案所述基因改造植物(譬如蕓薹屬)、其子代、細胞、組織或部位或從本案所述基因改造植物(譬如蕓薹屬)、其子代、細胞、組織或部位之籽回收油。本發(fā)明亦指涉一種制造包含至少一LC-PUFA之油的方法，該方法系包含栽種本案所述基因改造植物(譬如蕓薹屬)、其子代、細胞、組織或部位。本發(fā)明亦指涉一種在籽油中制造至少一 LC-PUFA的方法，該方法系包含從本案所述基因改造植物(譬如蕓薹屬)、其子代、細胞、組織或部位之籽回收油。本發(fā)明系指涉一種在籽油中制造至少一 PUFA的方法，該方法系包含栽種本案所述基因改造植物(譬如蕓薹屬)、其子代、細胞、組織或部位。本發(fā)明亦指涉一種提供含有至少一 PUFA之補充品或治療產(chǎn)品給一個體的方法，該方法包含提供本案所述基因改造植物(譬如蕓薹屬)、其子代、細胞、組織或部位、本案所述之油、本案所述之籽、本案所述之食品、本案所述之功能食品、本案所述之醫(yī)藥產(chǎn)品給該個體。在某些具體例中，該具體例所包含的PUFA為DHA和/或EPA。本發(fā)明系指涉一種制造本案所述基因改造植物(譬如蕓薹屬)、其子代、細胞、組織或部位的方法，該方法系包含以下列轉(zhuǎn)化植物或植物細胞(i)編碼PUFA合成酶系統(tǒng)(譬如藻類PUFA合成酶系統(tǒng))之核酸序列，該系統(tǒng)系制造至少一多不飽和脂肪酸(PUFA);及( )編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPTase)之核酸序列，該酶系將磷酸泛酰巰基乙胺基輔助因子轉(zhuǎn)移至PUFA合成酶系統(tǒng)(譬如藻類PUFA合成酶系統(tǒng))ACP域。在某些具體例中，該方法又包含以下列轉(zhuǎn)化植物或植物細胞:(iii)編碼酰基-CoA合成酶(ACoAS)之核酸序列，該酶系催化長鏈PUFA游離脂肪酸(FFA)轉(zhuǎn)換成酰基-CoA。附圖簡述本發(fā)明各種具體例可由下列詳細說明、圖式、及隨附序列說明更完整地理解。

圖1繪示編碼PUFA OrfA的9個重復(fù)域各者之重新設(shè)計DNA序列的Clustal W (于Vector NTI 之比對)。圖2展示pDAB7361的質(zhì)粒圖譜。圖3展示pDAB7362的質(zhì)粒圖譜。圖4展示pDAB7363的質(zhì)粒圖譜。圖5展示來自芥花事件5197 [14]-032.002的T1籽之單一籽分析DHA含量。圖6展示以O(shè)rf A、Orf B與Orf C特異性血清探測來自芥花事件5197 [14]-032.002的晚期(>30DAP)發(fā)育中Tl籽之萃取物的SDS-PAGE蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果。圖7A展示從DHA生產(chǎn)芥花事件5197 [14]-032.002.Sx002之授粉后日數(shù)15、20、
25、30、35與42收集的發(fā)育中T2籽樣本的脂質(zhì)含量。圖7B藉由蛋白質(zhì)印跡法展示OrfA、OrfB與OrfC多肽存在于DHA生產(chǎn)芥花事件5197[14]-032.002.Sx002 之萃取物。圖8展示芥花事件51 97 [ 14] -032.002之溫室生長Tl植物的純合T2植物的LC-PUFA 含量。圖9展示六個純合品系的單一 T2籽分析LC-PUFA的總結(jié)。圖10展示來自兩個T1品系與未轉(zhuǎn)化o-9Nexera710之正逆雜交(reciprocalcross)的所得親代與Fl雜交籽的DHA含量。圖11展示衍生自芥花事件5197[13]-010.001之六十個個別Tl植物的pat基因
拷貝數(shù)。
圖12展示在以授粉后日數(shù)(DAP)表示的各別6個時點使用原始強度值之空白未轉(zhuǎn)化co-9Nexera710品系中感興趣基因的表達圖樣。圖13展示在以DAP表示的各別6個時點使用正規(guī)化強度值之空白未轉(zhuǎn)化co-9Nexera710品系中感興趣基因的表達圖樣。圖14展示在以DAP表示的各別6個時點使用原始強度值之純合子事件5197[14]-032.002品系中感興趣基因的表達圖樣。圖15展示在以DAP表示的各別6個時點使用正規(guī)化強度值之純合子事件5197[14]-032.002品系中感興趣基因的表達圖樣。圖16展示以 薄層層析法(TLC)測量之成熟轉(zhuǎn)基因芥花籽的PUFA合成酶活性。圖17展示參考肽彼此相對的計算比例，其系來自在有與無共同表達HetI之大腸桿菌表達的OrfA，及于芥花事件5197 [14]-032.002表達的OrfA。圖18展示apo2_9肽對六個參考肽各者的計算比例，其系來自在有與無HetI之大腸桿菌表達的OrfA，及于轉(zhuǎn)基因芥花事件5197 [14]-032.002表達的OrfA。圖19展示pDAB7365的質(zhì)粒圖譜。圖20展示pDAB7368的質(zhì)粒圖譜。圖21展示pDAB7369的質(zhì)粒圖譜。圖22展示pDAB7370的質(zhì)粒圖譜。圖23展示pDAB100518的質(zhì)粒圖譜。圖24展示pDAB101476的質(zhì)粒圖譜。圖25展示pDAB101477的質(zhì)粒圖譜。圖26展示pDAB9166的質(zhì)粒圖譜。圖27展示pDAB9167的質(zhì)粒圖譜。圖28展示pDAB7379的質(zhì)粒圖譜。圖29展示pDAB7380的質(zhì)粒圖譜。圖30展示pDAB9323的質(zhì)粒圖譜。圖31展示pDAB9330的質(zhì)粒圖譜。圖32展示pDAB9337的質(zhì)粒圖譜。圖33展示pDAB9338的質(zhì)粒圖譜。圖34展示pDAB9344的質(zhì)粒圖譜。圖35展示pDAB9396的質(zhì)粒圖譜。圖36展示pDAB101412的質(zhì)粒圖譜。圖37展示pDAB7733的質(zhì)粒圖譜。圖38展示pDAB7734的質(zhì)粒圖譜。圖39展示pDAB101493的質(zhì)粒圖譜。圖40展示pDAB109507的質(zhì)粒圖譜。圖41展示pDAB109508的質(zhì)粒圖譜。圖42展示pDAB109509的質(zhì)粒圖譜。圖43展示pDAB9151的質(zhì)粒圖譜。圖44展示pDAB108207的質(zhì)粒圖譜。
圖45展示pDAB108208的質(zhì)粒圖譜。圖46展示pDAB108209的質(zhì)粒圖譜。圖47展示pDAB9159的質(zhì)粒圖譜。圖48展示pDAB9147的質(zhì)粒圖譜。圖49展示pDAB108224的質(zhì)粒圖譜。圖50展示pDAB108225的質(zhì)粒圖譜。圖 51 例示以 pDAB101493、pDAB7362、pDAB7369、pDAB101412 或 pDAB7380 轉(zhuǎn)化之個別轉(zhuǎn)基因擬南芥事件的T2籽的DHA與LC-PUFA含量。發(fā)明詳述本案所用〃多不飽和脂肪酸〃或"PUFA"等詞系指帶有由至少16個碳、至少18個碳、至少20個碳、或22或更多個碳構(gòu)成之碳鏈并帶有至少3或更多個雙鍵、4或更多個雙鍵、5或更多個雙鍵、或6或更多個雙鍵的脂肪酸，其中雙鍵皆為順式構(gòu)型。本案所用〃長鏈多不飽和脂肪酸〃或"LC-PUFAs"等詞系指由18個及更多碳鏈長度、20個及更多碳鏈長度、含有3或更多個雙鍵、或是22或更多個碳帶有至少3或更多個雙鍵、4或更多個雙鍵、5或更多個雙鍵、或6或更多個雙鍵所組成的脂肪酸。ω-6系列的LC-PUFAs包括但不限于Y-亞麻酸(C18:3)、雙-升-Y-亞麻酸(C20:3n_6)、花生四烯酸(C20:4n-6)、腎上腺酸(亦稱二十二碳四烯酸或DTA) (C22: 4n_6)、及二十二碳五烯酸(C22:5n_6)。ω-3系列的LC-PUFAs包括但不限于α-亞麻酸(C18:3)、二十碳三烯酸(C20:3n-3)、二十碳四烯酸(C20:4n-3)、二十碳五烯酸(C20: 5n_3)、二十二碳五烯酸(C22:5n-3)、及二十二碳六烯酸(C22:6n_3)。LC-PUFAs亦包括帶有大于22個碳及4或更多個雙鍵的脂肪酸，包括但不限于C28:8 (n-3)。本案所用〃PUFA合成酶〃或〃PUFA合成酶系統(tǒng)〃或〃SzPUFA〃或〃hSzThPUFA〃等詞系指制造多不飽和脂肪酸(PUFAs)且尤其是長鏈PUFAs (LC-PUFAs)的酶系統(tǒng)還有該酶在復(fù)合體中的任何域。PUFA合成酶一詞系包括但不限于用于制造PUFAs的PUFA PKS系統(tǒng)或類PKS系統(tǒng)。本案所用〃磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶〃或〃PPTase〃或〃N0HetI〃 一詞系指藉由將輔助因子(譬如4-磷酸泛酰巰基乙胺)從輔酶A(CoA)轉(zhuǎn)移至存在于PUFA合成酶系統(tǒng)的一或多個ACP域來活化PUFA合成酶系統(tǒng)的酶。本案所用〃?；?CoA合成酶〃或"ACoAS"或"SzACS-2" —詞系指催化長鏈多不飽和游離脂肪酸(FFA)轉(zhuǎn)換成?；?CoA的酶。本案所用〃植物〃 一詞系包括但不限于植物的任何子代、細胞、組織、或部位?！ū＝∑贰ㄒ庵赣芍参锓蛛x、純化、濃縮、或制造的產(chǎn)品，其提供生理幫助或提供對疾病的防護，包括補充有該類產(chǎn)品的加工食品，連同由已進行基因工程以含有加強水平之該類生理活性成分的作物制造的食品?！üδ苁称贰ㄒ庵赶铝惺称?(a)外觀相似于或可為作為一部分日常飲食食用的常規(guī)食品及(b)憑借修飾通常存在于未修飾食品中的成分比例而具有加強營養(yǎng)值和/或特定飲食幫助。

〃多核苷酸〃與〃核酸〃等詞系意圖涵蓋單數(shù)核酸還有復(fù)數(shù)核酸、核酸分子或其片段、變體或衍生物、或構(gòu)建體，譬如信使RNA(mRNA)或質(zhì)粒DNA(pDNA)。多核苷酸或核酸可含有全長cDNA序列之核苷酸序列、或其片段，包括未翻譯5’與3’序列及編碼序列。多核苷酸或核酸可由任何聚核糖核苷酸或聚脫氧核糖核苷酸構(gòu)成，該等可為未修飾RNA或DNA或經(jīng)修飾RNA或DNA。舉例來說，多核苷酸或核酸可由單/雙鏈DNA、混合有單/雙鏈區(qū)的DNA、單/雙鏈RNA、及混合有單/雙鏈區(qū)的RNA、包含可為單鏈或更通常為雙鏈或混合有單/雙鏈區(qū)之DNA與RNA的雜交分子所構(gòu)成。該等用詞亦囊括多核苷酸或核酸的化學(xué)性、酶性、或代謝性修飾形式。多核苷酸或核酸序列可稱作〃分離〃，其中彼等系從其原生環(huán)境被移出。舉例來說，包含在載體內(nèi)的編碼具有二羥酸脫水酶活性之多肽或多肽片段的異源性多核苷酸或核酸就本發(fā)明目的而言被視為分離。分離多核苷酸或核酸的另外例子系包括維持于異源宿主細胞內(nèi)的重組多核苷酸或于溶液中的(部分地或?qū)嵸|(zhì)上)純化多核苷酸或核酸。根據(jù)本發(fā)明之分離多核苷酸或核酸又包括以合成方式制造的該類分子。呈DNA聚合物形式的分離多核苷酸或核酸可包含一或多 個cDNA片段、基因組DNA或合成DNA?！ɑ颉?一詞系指能夠表達特定蛋白、選擇性地包括編碼序列之前(5’無編碼序列)與之后(3’無編碼序列)的調(diào)控序列的核酸或其片段。用于本案時，〃編碼區(qū)〃 一詞系指編碼特定氨基酸序列的DNA序列?！ㄟm宜調(diào)控序列"系指位于編碼序列上游(5’無編碼序列)、內(nèi)部、或下游(3’無編碼序列)的核苷酸序列，其影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA處理或穩(wěn)定性、或翻譯。調(diào)控序列可包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、聚腺苷酸識別序列、RNA處理位點、效應(yīng)物結(jié)合位置、及莖環(huán)結(jié)構(gòu)。用于本案時，〃多肽〃 一詞意圖涵蓋單數(shù)〃多肽〃還有復(fù)數(shù)〃多肽〃及其片段并指稱由以酰胺鍵(亦習(xí)知為肽鍵)線性聯(lián)結(jié)之單體(氨基酸)所組成的分子。"多肽"一詞系指由二或多個氨基酸所組成的任何鏈或多鏈，并非指稱特定長度產(chǎn)物。于是，肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白、氨基酸鏈、或用于指稱由二或多個氨基酸所組成之任何鏈或多鏈的任何其它用詞系包括在〃多肽〃定義內(nèi)，而〃多肽〃 一詞可代替任一該等用詞或互換使用。多肽可衍生自天然生物來源或以重組科技制造，但不一定由指定核酸序列翻譯?？梢匀魏畏绞缴?包括化學(xué)合成。"分離"多肽或或其片段、變體或衍生物意指不在其天然環(huán)境的多肽。不需特殊程度的純化。舉例來說，分離多肽可從其原生或自然環(huán)境移出。在宿主細胞中表達的重組制得多肽與蛋白就本發(fā)明目的而言被視為分離，以任何適宜技術(shù)分離、分割、或是部分或?qū)嵸|(zhì)上純化的原生或重組多肽亦然。用于本案時，〃原生〃系指多核苷酸、基因或多肽在自然界被發(fā)現(xiàn)-連同其本身調(diào)控序列，倘若存在的話-的形式。用于本案時，〃內(nèi)源性〃系指多核苷酸、基因或多肽在其位于生物體或生物體基因組內(nèi)的天然位置的原生形式。"內(nèi)源性多核苷酸"系包括在其位于生物體基因組內(nèi)的天然位置的原生多核苷酸。"內(nèi)源性基因"系包括在其位于生物體基因組內(nèi)的天然位置的原生基因?！▋?nèi)源性多肽〃系包括在其位于生物體內(nèi)的天然位置的原生多肽。用于本案時，〃異源性〃系指不是在宿主生物體內(nèi)正常發(fā)現(xiàn)而是引進宿主生物體內(nèi)的多核苷酸、基因或多肽。"異源性多核苷酸"系包括以異于對應(yīng)原生多核苷酸的形式再次引進來源生物體內(nèi)的原生編碼區(qū)、或其之一部分。〃異源性基因〃系包括以異于對應(yīng)原生基因的形式再次引進來源生物體內(nèi)的原生編碼區(qū)、或其之一部分。舉例來說，異源性基因可包括以包括非原生調(diào)控區(qū)的嵌合基因之一部分再次引進原生宿主的原生編碼區(qū)?！ó愒葱远嚯?系包括以異于對應(yīng)原生多肽的形式再次引進來源生物體內(nèi)的原生多肽。用于本案時，〃修飾〃 一詞系指改變本案所揭示的多核苷酸造成該多核苷酸編碼之多肽的活性降低、實質(zhì)上消除或消除，還有改變本案所揭示的多肽造成該多肽的活性降低、實質(zhì)上消除或消除。該類改變可以本領(lǐng)域熟知方法進行，包括但不限于刪除、突變(譬如自發(fā)誘變、隨機誘變、突變加成基因?qū)е碌恼T變、或轉(zhuǎn)位子誘變)、取代、插入、負調(diào)控、更動細胞位置、更動多核苷酸或多肽狀態(tài)(譬如甲基化、磷酸化或泛素化)、移除輔助因子、弓丨進反義RNA/DNA、引進干擾RNA/DNA、化學(xué)修飾、共價修飾、以UV或X-光照射、同源重組、有絲分裂重組、啟動子置換法、和/或該等之組合。決定哪個核苷酸或氨基酸殘基可被修飾的指引可藉由下列找到:比對特定多核苷酸或多肽和同源一譬如酵母或細菌一多核苷酸或多肽的序列，并使高度同源區(qū)(保守區(qū))或共同序列內(nèi)進行的修飾數(shù)量最大化。本案所用〃衍生物〃 一詞系指本發(fā)明揭示序列之修飾。該類修飾的舉例為取代、插入、和/或刪除和本案所揭示編碼序列的核酸序列相關(guān)的一或多個堿基，其保留、稍微更動、或增進油籽作物品種中本案所揭示編碼序列的功能。該類衍生物可由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易決定，舉例來說，使用計算機仿真技術(shù)以預(yù)測與最佳化序列結(jié)構(gòu)。"衍生物"一詞于是亦包括和本案所揭示編碼序列具有實質(zhì)序列同源性之核酸序列，由此使得其能具有用于制造本發(fā)明LC-PUFAs之揭示功能性。用于本案時，〃變體〃 一詞系指藉由使用譬如重組DNA技術(shù)，例如誘變所創(chuàng)造的氨基酸插入、刪除、突變、及取代而異于本發(fā)明明確列舉多肽之多肽。決定哪個氨基酸殘基可被置換、添加、或刪除而不破壞感興趣活性的指引可藉由下列找到:比對特定多肽和同源多肽的序列，并使高度同源區(qū)(保守區(qū))內(nèi)進行的氨基酸序列改變數(shù)量減至最少或以共同序
列置換氨基酸。或者，編碼該等相同或類似多肽的重組多核苷酸變體可利用基因密碼的〃冗余性"來合成或選擇?？梢M各式密碼子取代-例如產(chǎn)生各式限制位點的沉默改變-以最佳化克隆到表達用質(zhì)?；虿《据d體內(nèi)。多核苷酸序列的突變可反映在多肽或加至該多肽以修飾多肽任何部分特性的其它肽域。氨基酸〃取代〃可為以具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性的另一氨基酸置換一氨基酸的結(jié)果，亦即保守的氨基酸置換，或該等可為以具有相異結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性的氨基酸置換一氨基酸的結(jié)果，亦即非保守的氨基酸置換。"保守的"氨基酸取代可以涉及殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性、或兩性本質(zhì)之相似性為基礎(chǔ)進行。舉例來說，非極性(疏水)氨基酸系包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及甲硫氨酸；極性中性氨基酸系包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、及谷氨酰胺；帶正電(堿性)氨基酸系包括精氨酸、離氨酸、及組氨酸；及帶負電(酸性)氨基酸系包括天冬氨酸與谷氨酸。或者，"非保守"氨基酸取代可藉由選擇任一該等氨基酸的極性、電 荷、溶解度、疏水性、親水性、或兩性本質(zhì)之相異性進行?！ú迦搿ɑ颉▌h除〃可在重組蛋白結(jié)構(gòu)上或功能上耐受之變化范圍內(nèi)。容許的變化可藉由使用重組DNA技術(shù)在多肽分子內(nèi)系統(tǒng)性地插入、刪除、或取代氨基酸并檢驗所得重組變體的活性而以實驗方式?jīng)Q定。〃啟動子〃 一詞系指能夠控制編碼序列或功能性RNA表達的DNA序列。一般而言，編碼序列位于啟動子序列的3’。啟動子整體可衍生自原生基因、或由衍生自存在于自然界的不同啟動子的不同單元組成、或甚至包含合成DNA片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員系理解不同啟動子可導(dǎo)引位于不同組織或細胞種類、或于不同發(fā)展階段、或響應(yīng)不同環(huán)境或生理條件的基因表達。在大多數(shù)時間使基因在大部分細胞種類內(nèi)表達的啟動子通常稱作〃構(gòu)成啟動子"。又認(rèn)知到既然在大部分情況中，調(diào)控序列的確切邊界并無完整定義，故不同長度的DNA片段可具有相等的啟動子活性。〃可操作地連接(operably linked) 〃 一詞系指在單一核酸片段上的核酸序列關(guān)聯(lián)性，所以一者的功能系受另一者影響。舉例來說，啟動子系和編碼序列可操作地連接，如果該啟動子能夠招致該編碼序列的表達(譬如該編碼序列系受到該啟動子的轉(zhuǎn)錄控制)。編碼序列可以同義或反義方向可操作地連接至調(diào)控序列。本案所用〃表達〃 一詞系指衍生自本發(fā)明核酸片段之有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄與穩(wěn)定聚積。表達亦可指mRNA翻譯至多肽。本案所用〃過度表達〃 一詞系指高于相同或相關(guān)基因內(nèi)源性表達的表達。倘若異源性基因表達高于相仿內(nèi)源性基因之表達，則該異源性基因為過度表達。用于本案時，〃轉(zhuǎn)化〃一詞系指將核酸或片段送進宿主生物體，產(chǎn)生基因穩(wěn)定的遺傳。含有轉(zhuǎn)化核酸片段的宿主生物體稱作〃轉(zhuǎn)基因〃或〃重組〃或〃轉(zhuǎn)化〃生物體。本案所用"質(zhì)粒"與"載體"用詞系指額外的染色體單元，其經(jīng)常攜帶不為細胞中央代謝一部分的基因且通常呈環(huán)狀雙鏈DNA分子形式。該類單元可為自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線形或環(huán)狀、由單-或雙-鏈DNA或RNA構(gòu)成、衍生自任何來源，其中眾多核苷酸序列已聯(lián)合或重組至一個能夠把啟動子片段與選定基因產(chǎn)物的DNA序列連同適當(dāng)3’未翻譯序列引進細胞的獨特構(gòu)型。

用于本案時，"密碼子簡并性"一詞系指基因密碼允許核苷酸序列變動而不影響被編碼多肽的氨基酸序列的本質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員深知特定宿主細胞在使用核苷酸密碼子指定給定的氨基酸時展現(xiàn)的〃密碼子-偏倚〃。因此，當(dāng)為了增進在一宿主細胞中的表達而合成一基因時，所欲的是俾使該基因的密碼子使用頻率接近該宿主細胞的較佳密碼子使用頻率來設(shè)計基因?！艽a子-最佳化〃 一詞一指稱供各式宿主轉(zhuǎn)化之基因或核酸分子的編碼區(qū)一系指更動基因或核酸分子編碼區(qū)的密碼子，以反映宿主生物體的典型密碼子使用而無更動該DNA所編碼的多肽。該類最佳化包括以該生物體基因中較常使用的一或多個密碼子置換至少一個、或不止一個、或相當(dāng)數(shù)量的密碼子。包含編碼任何多肽鏈之氨基酸的密碼子的核苷酸序列傾向系容許編碼該基因的序列中出現(xiàn)變化。由于各密碼子由三個核苷酸構(gòu)成，而包含核苷酸的DNA系限于四個特定堿，所以有64個可能的核苷酸組合，當(dāng)中61個系編碼氨基酸(剩余三個密碼子編碼結(jié)束翻譯的信號)。展示哪個密碼子編碼哪個氨基酸的〃基因密碼〃在本案系以表I再現(xiàn)。結(jié)果，許多氨基酸系被不止一個密碼 子指定。舉例來說，氨基酸丙氨酸與脯氨酸被四個三聯(lián)體編碼，絲氨酸與精氨酸被六個，但色氨酸與甲硫氨酸卻只被一個三聯(lián)體編碼。此簡并性使得DNA堿組合能大幅變動而無更動DNA編碼蛋白的氨基酸序列。表1.標(biāo)準(zhǔn)基因密碼
權(quán)利要求
1.一種基因改造蕓薹屬(Brassica)植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其包含: (i)編碼多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶系統(tǒng)之核酸序列，該系統(tǒng)制造至少一PUFA ;及 (ii)編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPTase)之核酸序列，該酶將磷酸泛酰巰基乙胺基輔助因子轉(zhuǎn)移至PUFA合成酶系統(tǒng)ACP域。
2.權(quán)利要求1的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該植物、其子代、細胞、組織、籽或部位為油菜(Brassica napus)。
3.權(quán)利要求1的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該植物、其子代、細胞、組織、籽或部位為芥菜(Brassica juncea)。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該PUFA合成酶系統(tǒng)包含和SEQ ID NO:1之氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1-3中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該PUFA合成酶系統(tǒng)包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1-3中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該編碼PUFA合成酶系統(tǒng)之核酸序列包含和SEQ ID NO: 6之核酸序列至少80%相同的核酸序列。
7.權(quán)利要求1-3中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該編碼PUFA合成酶系統(tǒng)之核酸序列包含SEQ ID NO:6之核酸序列。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該PUFA合成酶系統(tǒng)包含和SEQ ID NO: 2之氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求1- 7中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該PUFA合成酶系統(tǒng)包含SEQ ID NO: 2之氨基酸序列。
10.權(quán)利要求1-7中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該編碼PUFA合成酶系統(tǒng)之核酸序列包含和SEQ ID NO: 7之核酸序列至少80%相同的核酸序列。
11.權(quán)利要求1-7中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該編碼PUFA合成酶系統(tǒng)之核酸序列包含SEQ ID NO: 7之核酸序列。
12.權(quán)利要求1-11中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該PUFA合成酶系統(tǒng)包含和SEQ ID NO:3之氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求1-11中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該PUFA合成酶系統(tǒng)包含SEQ ID NO: 3之氨基酸序列。
14.權(quán)利要求1-11中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該編碼PUFA合成酶系統(tǒng)之核酸序列包含和SEQ ID NO:8之核酸序列至少80%相同的核酸序列。
15.權(quán)利要求1-11中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該編碼PUFA合成酶系統(tǒng)之核酸序列包含SEQ ID NO:8之核酸序列。
16.權(quán)利要求1-3中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該PUFA合成酶系統(tǒng)包含SEQ ID NOs: 1-3之氨基酸序列。
17.權(quán)利要求1-3中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該編碼PUFA合成酶系統(tǒng)之核酸序列包含SEQ ID NOs: 6-8之核酸序列。
18.權(quán)利要求1-17中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該PPTase包含和SEQ ID NO: 5至少80%相同之氨基酸序列。
19.權(quán)利要求1-17中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該PPTase包含SEQ ID NO: 5之氨基酸序列。
20.權(quán)利要求1-17中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該編碼PPTase之核酸序列和SEQ ID NO: 10之核酸序列至少80%相同。
21.權(quán)利要求1-17中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該編碼PPTase之核酸序列包含SEQ ID NO: 10之核酸序列。
22.權(quán)利要求1-21中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中(i)與(ii)之核酸序列包含于單一重組表達載體。
23.權(quán)利要求1-22中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中(i)與(ii)之核酸序列可操作地連接至籽特異性啟動子。
24.權(quán)利要求1-23中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中(i)與(ii)之核酸序列可操作地連接至選自由下列所構(gòu)成之群組的啟動子:PvDleC2、LfKCS3 及 FAE1。
25.權(quán)利要求1-24中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其進一步包含: (iii)編碼?；?CoA合成酶(ACoAS)之核酸序列，該酶催化長鏈PUFA游離脂肪酸(FFA)轉(zhuǎn)換成?；?CoA。
26.權(quán)利要求25的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該ACoAS包含和SEQ ID N0:4至少80%相同之氨基酸序列。
27.權(quán)利要求25的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該ACoAS包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列。
28.權(quán)利要求25的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該編碼ACoAS之核酸序列包含和SEQ ID NO: 9之核酸序列至少80%相同的核酸序列。
29.權(quán)利要求25的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該編碼ACoAS之核酸序列包含SEQ ID NO:9之核酸序列。
30.權(quán)利要求25的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該編碼ACoAS之核酸序列包含SEQ ID N0:34之核酸序列。
31.權(quán)利要求25-30中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中(i)、( )及(iii)之核酸序列包含于單一重組表達載體。
32.權(quán)利要求25-31中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中(i)、(ii)及(iii)之核酸序列可操作地連接至籽特異性啟動子。
33.權(quán)利要求25-32中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中(i)、( )及(iii)之核酸序列可操作地連接至選自由下列所構(gòu)成之群組的啟動子:PvDlec2、LfKCS3 及 FAE1。
34.權(quán)利要求1-33中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其還包含編碼乙酰基CoA羧化酶(ACCase)之核酸序列和/或編碼第2型二?；视王ヵ；D(zhuǎn)移酶(DGAT2)之核酸序列。
35.一種分離核酸分子，其包含選自SEQ ID NOs:6-10之核酸序列。
36.一種重組表達載體pDAB7361。
37.一種重組表達載體pDAB7362。
38.一種重組表達載體pDAB7363。
39.權(quán)利要求1-34中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該植物、其子代、細胞、組織、籽或部位包含可檢測量的DHA(二十二碳六烯酸(C22: 6，n-3))、DPA (C22: 5，n_6 或 n_3)、或 EPA ( 二十碳五烯酸(C20: 5，n_3))。
40.權(quán)利要求1-34與39中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該植物、其子代、細胞、組織、籽或部位包含0.01%至15%DHA。
41.權(quán)利要求1-34、39與40中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該植物、其子代、細胞、組織、籽或部位包含0.05%至10%DHA。
42.權(quán)利要求1-34與39-41中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該植物、其子代、細胞、組織、籽或部位包含0.05%至5%DHA。
43.權(quán)利要求1-34與39-42中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該植物、其子代、細胞、組織、籽或部位包含0.01%至596EPA。
44.權(quán)利要求1-34與39-43中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該植物、其子代、細胞、組織、籽或部位包含0.05%至596EPA。
45.權(quán)利要求1-34與39-44中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該植物、 其子代、細胞、組織、籽或部位包含0.05%至P/oEPA。
46.權(quán)利要求1-34與39-45中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該植物、其子代、細胞、組織、籽或部位包含0.01%至5%DPA。
47.權(quán)利要求1-34與39-46中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該植物、其子代、細胞、組織、籽或部位包含0.05%至5%DPA。
48.權(quán)利要求1-34與39-47中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位，其中該植物、其子代、細胞、組織、籽或部位包含0.05%至1%DPA。
49.一種油，其得自權(quán)利要求1-34與39-48中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位。
50.一種籽，其得自權(quán)利要求1-34與39-48中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位。
51.一種籽油，其得自權(quán)利要求1-34與39-48中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位。
52.—種食品，其包含得自權(quán)利要求1-34與39-48中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位之油，或得自權(quán)利要求1-34與39-48中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位之籽。
53.一種功能食品，其包含得自權(quán)利要求1-34與39-48中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位之油，或得自權(quán)利要求1-34與39-48中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位之籽。
54.一種醫(yī)藥產(chǎn)品，其包含得自權(quán)利要求1-34與39-45中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位之油，或得自權(quán)利要求1-34與39-48中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位之籽。
55.一種制造包含至少一 PUFA之油的方法，該方法包含從權(quán)利要求1-34與39-45中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位或從權(quán)利要求1-34與39-48中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織或部位之籽回收油。
56.一種制造包含至少一 PUFA之油的方法，該方法包含使權(quán)利要求1-34與39-48中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位生長。
57.一種制造在籽油中的至少一 PUFA的方法，該方法包含從權(quán)利要求1-34與39-48中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織或部位之籽回收油。
58.一種制造在籽油中的至少一 PUFA的方法，該方法包括使權(quán)利要求1-34與39-48中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位生長。
59.一種提供含有至少一 PUFA之補充品或治療產(chǎn)品給一個體的方法，該方法包含提供權(quán)利要求1-34與39-48中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位、權(quán)利要求49的油、權(quán)利要求50的籽、權(quán)利要求51的籽油、權(quán)利要求52的食品、權(quán)利要求53的功能食品、或權(quán)利要求54的醫(yī)藥產(chǎn)品給該個體。
60.權(quán)利要求55-59中任一項的方法，其中該PUFA為DHA。
61.權(quán)利要求55-59中任一項的方法，其中該PUFA為EPA。
62.一種制造權(quán)利要求1-34與39-48中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位的方法，該方法包含以下列核酸序列轉(zhuǎn)化蕓薹屬植物或植物細胞:(i)編碼藻類PUFA合成酶之核酸序列，該酶制造至少一多不飽和脂肪酸(PUFA);及(ii)編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPTase)之核酸序列，該酶將磷酸泛酰巰基乙胺基輔助因子轉(zhuǎn)移至藻類PUFA合成酶A CP域。
63.權(quán)利要求62的方法，該方法進一步包含以下列核酸序列轉(zhuǎn)化蕓薹屬植物或植物細胞:(iii)編碼酰基-CoA合成酶(ACoAS)之核酸序列，該酶催化長鏈PUFA游離脂肪酸(FFA)轉(zhuǎn)換成酰基-CoA。
64.一種來自蕓薹屬植物籽的油組成物，其包含約0.05%至5%DHA。
65.一種來自蕓薹屬植物籽的油組成物，其包含約0.05%至5%DHA并具有>70%油酸(以重量計)之脂肪酸配置。
66.一種來自蕓薹屬植物籽的油組成物，其包含約0.05%至5%DHA并具有〈3.5% α -亞麻酸(以重量計)之脂肪酸配置。
67.一種來自蕓薹屬植物籽的油組成物，其包含約0.05%至5%DHA并具有>70%油酸與<3.5% α -亞麻酸(以重量計)之脂肪酸配置。
68.一種制造權(quán)利要求1-34與39-48中任一項的基因改造蕓薹屬植物、其子代、細胞、組織、籽或部位的方法，該方法包含以包含下列核酸序列之表達盒轉(zhuǎn)化蕓薹屬植物或植物細胞:(i)編碼PUFA合成酶系統(tǒng)之核酸序列，該系統(tǒng)制造至少一多不飽和脂肪酸(PUFA)；( )編碼?；?CoA合成酶(ACoAS)之核酸序列，該酶催化長鏈PUFA游離脂肪酸(FFA)轉(zhuǎn)換成酰基-CoA ;及(iii)編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPTase)之核酸序列，該酶活化PUFA合成酶系統(tǒng)ACP域。
全文摘要
本發(fā)明提供重組宿主生物體(譬如植物)，該生物體系以容許和/或增進宿主生物體中PUFAs生產(chǎn)的多不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶系統(tǒng)與一或多個輔助蛋白(譬如PPTase和/或ACoAS)之基因修飾。本發(fā)明亦關(guān)于制造和使用該類生物體(譬如用以獲得PUFAs)的方法以及由該類生物體獲得的產(chǎn)品(譬如油和/或籽)。
文檔編號C12N5/00GK103080319SQ201180035255
公開日2013年5月1日 申請日期2011年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月17日
發(fā)明者T.A.沃爾什, A.O.默洛, D.加喬特, P.G.羅斯勒, S.貝萬, J.M.庫納, J.G.梅茨 申請人:陶氏益農(nóng)公司, Dsm Ip資產(chǎn)公司