專利名稱：一種出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)出芽短梗霉細(xì)胞生產(chǎn)聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法，屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
聚蘋果酸和普魯蘭多糖都是出芽短梗霉的產(chǎn)物，都可由出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)生。為了提高聚蘋果酸或是普魯蘭多糖的產(chǎn)量，人們通過(guò)誘變選育或基因工程構(gòu)建合成能力強(qiáng)的菌種，篩選和優(yōu)化培養(yǎng)基配方，建立和優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程控制，改進(jìn)和提高下游工程技術(shù)等方面來(lái)提高產(chǎn)品的產(chǎn)量產(chǎn)率和質(zhì)量。聚蘋果酸是以蘋果酸為唯一單體聚合而成的高分子聚合物。目前國(guó)外有關(guān)微生物發(fā)酵聚蘋果酸的專利非常少，已有的發(fā)酵生產(chǎn)或人工合成聚蘋果酸(蘋果酸聚合物)的專利有1995年公開(kāi)的日本專利“生產(chǎn)蘋果酸聚合微生物的培養(yǎng)方法(P 7308188A2)"[22], 1991年公開(kāi)的日本專利“酶法生產(chǎn)L-蘋果酸聚合物(JP4341189A2)”和1992年公開(kāi)的日本專利“微生物合成L-蘋果酸聚合物(JP4211385A2)[23]”。美國(guó)專利US4320753主要是合成聚蘋果酸和相應(yīng)內(nèi)酯的衍生物@]。目前關(guān)于聚蘋果酸應(yīng)用的專利較多，如 US05811032、US05324519, US5702716等共30多項(xiàng)；國(guó)內(nèi)有關(guān)聚蘋果酸的專利僅有6項(xiàng)， 其中與聚蘋果酸生物合成有關(guān)的專利3項(xiàng)(宋存江等[25] “同時(shí)獲得副產(chǎn)物普魯蘭糖的聚蘋果酸的制備方法”申請(qǐng)?zhí)?00710058398 ；萬(wàn)印華等[26] “ β _聚蘋果酸及其鹽的制備方法”，申請(qǐng)?zhí)?200910078227. 7 ；喬長(zhǎng)晟等[27] “一種酶法去除普魯蘭多糖提取獲得 β-聚蘋果酸的方法”，申請(qǐng)?zhí)?00910068951. 1)，其余三項(xiàng)均為以聚蘋果酸為原料的應(yīng)用型專利。有關(guān)聚蘋果酸合成的研究論文有中科院微生物研所劉雙江研究員利用出芽短梗霉Aureobasidium pullulans發(fā)酵得到PMLA產(chǎn)物、喬長(zhǎng)晟等發(fā)表的“Optimization of Poly(β -L-malic acid)production using Aureobasidium pullulans by response surface methodology”、南京工業(yè)大學(xué)王發(fā)表的“聚蘋果酸的發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化”以及“響應(yīng)面發(fā)優(yōu)化β-聚蘋果酸發(fā)酵培養(yǎng)基的研究”。普魯蘭多糖是由出芽短梗霉利用糖質(zhì)化合物為基質(zhì)進(jìn)行好氣發(fā)酵產(chǎn)生的一種粘性胞外多糖，早在1936年就人們被發(fā)現(xiàn)。一直到六十年代，人們才開(kāi)始對(duì)其發(fā)酵、提取和應(yīng)用等方面發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行研究，在1978年日本林原公司實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)普魯蘭多糖。綜上所述，現(xiàn)有的技術(shù)所做的只是針對(duì)聚蘋果酸或是普魯蘭多糖一種產(chǎn)品進(jìn)行的發(fā)酵，存在原料利用率低，能耗高，成本高等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出了利用出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法。本發(fā)明以出芽短梗霉為培養(yǎng)菌株，采用優(yōu)化的聯(lián)產(chǎn)培養(yǎng)基配方，包括接入菌種、向發(fā)酵液中流加營(yíng)養(yǎng)物和調(diào)節(jié)劑，控制發(fā)酵液中出芽短梗霉細(xì)胞代謝產(chǎn)物生成條件。其中出芽短梗霉培養(yǎng)基中按每升發(fā)酵液的質(zhì)量含量配制碳源6g/Lj8g/L，氮源0. 5g/L-5. 5g/L，無(wú)機(jī)鹽0.01g/L-2g/L，所述碳源有葡萄糖、蔗糖、琥珀酸、檸檬酸，氮源有蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、硝酸鈉、氯化銨、碳酸銨、丁二酸銨，無(wú)機(jī)鹽有氯化鉀、硫酸鹽和磷酸鹽；發(fā)酵過(guò)程流加的營(yíng)養(yǎng)物有葡萄糖，蔗糖，蛋白胨，蘋果酸，添加的調(diào)節(jié)劑為碳酸鈣， 調(diào)節(jié)發(fā)酵液PH3-8之間，發(fā)酵溫度在20-30°C，發(fā)酵周期4_7天，得到聯(lián)產(chǎn)聚蘋果酸和普魯蘭多糖的發(fā)酵液。發(fā)酵罐培養(yǎng)基溫度降至后接入菌種，按3%的接種量接入發(fā)酵罐，攪拌轉(zhuǎn)速在200rpm，通風(fēng)比為0. 5VVM，控制溫度左右開(kāi)始發(fā)酵，從發(fā)酵開(kāi)始到72小時(shí)溫度控制在-31°C，從M小時(shí)開(kāi)始流加蔗糖，控制發(fā)酵液中葡萄糖量在35g/L，72小時(shí)以后控制溫度在25°C左右，并且繼續(xù)流加蔗糖控制發(fā)酵液中葡萄糖含量15g/L，直至發(fā)酵136小時(shí)停止加蔗糖，發(fā)酵直至發(fā)酵液中葡萄糖含量降至0后繼續(xù)發(fā)酵8小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中pH控制 5-7. 2之間，發(fā)酵166小時(shí)，普魯蘭多糖總量為52g/L以上，聚蘋果酸總量為37g/L以上。金屬離子Mn2+、Fe2\ Zn2+ 各在 0. OOlg/L-O. 4g/L ；金屬離子以硫酸鹽或氯化鹽的形式加入，包括Μη2+、 ^2+、&ι2+。上述磷酸鹽包括磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀。上述菌種包括出芽短梗霉或通過(guò)誘變和基因工程改造過(guò)的工程菌。本發(fā)明中使用菌種見(jiàn)出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)TKPM00006, CGMCC3337，見(jiàn)天津科技大學(xué)申請(qǐng)專利，申請(qǐng)?zhí)枮镃N200910071018，發(fā)明名稱為一種大量產(chǎn)生β -聚蘋果酸的誘變菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006及其培養(yǎng)方法，
公開(kāi)日期是2011. 02. 23。 該專利中公開(kāi)了本發(fā)明用出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)TKPM00006，CGMCC3337， 2009年10. 14日保藏。有益效果通過(guò)流加及發(fā)酵過(guò)程控制使聚蘋果酸和普魯蘭多糖的產(chǎn)量達(dá)到單獨(dú)發(fā)酵聚蘋果酸或普魯蘭多糖的較高水平，從而提高原料利用率，節(jié)約能源，降低了成本
具體實(shí)施例方式本發(fā)明較好的實(shí)施方式是發(fā)酵培養(yǎng)基配方是蔗糖80g/L_200g/L，蛋白胨5g/ L-50g/L,碳酸鈣 5g/L-40g/L,氯化鉀 0. lg/L_2g/L，硝酸鈉 lg/L_3g/L，硫酸鎂 0. Ig/ L-0. 6g/L，磷酸二氫鉀 0. 05g/L-4g/L, Mn2+、Fe2\ Zn2+ 各在 0. 001g/L-0. 4g/L，按常規(guī)滅菌方式在121°C下實(shí)罐滅菌20min，待培養(yǎng)基溫度降至后接入菌種，按3% -10% (種子液與發(fā)酵液的體積比)的接種量接入發(fā)酵罐，攪拌轉(zhuǎn)速在200-600rpm，通風(fēng)比為0. 5-1. 5VVM, 控制溫度左右開(kāi)始發(fā)酵，發(fā)酵液溫度控制在20°C _35°C，從發(fā)酵開(kāi)始到72小時(shí)溫度控制在-31°C，從M小時(shí)開(kāi)始流加蔗糖，控制發(fā)酵液中葡萄糖量在35g/L-50g/L，72小時(shí)以后控制溫度在25°C左右，并且繼續(xù)流加蔗糖控制發(fā)酵液中葡萄糖含量15g/L-30g/L，直至發(fā)酵136小時(shí)停止加蔗糖，發(fā)酵直至發(fā)酵液中葡萄糖含量降至0后繼續(xù)發(fā)酵8小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中PH控制5-6之間，直至發(fā)酵結(jié)束大概166小時(shí)左右，生物量達(dá)到74g/L-113g/L (干重)，普魯蘭多糖總量為40g/L-90g/L，聚蘋果酸總量為36g/L-65g/L。上述菌種包括出芽短梗霉或通過(guò)誘變和基因工程改造過(guò)的工程菌。實(shí)施例1 使用30L通用式發(fā)酵罐配置18L發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方蔗糖80g/L，蛋白胨5g/L,碳酸鈣5g/L，氯化鉀0. lg/L，硝酸鈉lg/L，硫酸鎂0. lg/L，磷酸二氫鉀0. 05g/L, Mn2+、 Fe2\Zn2+各在0. 001g/L-0. 4g/L，在121 °C實(shí)罐滅菌20min。待培養(yǎng)基溫度降至后接入菌種，按3% (種子液與發(fā)酵液的體積比)的接種量接入發(fā)酵罐，攪拌轉(zhuǎn)速在200rpm，通風(fēng)比為0. 5VVM，控制溫度左右開(kāi)始發(fā)酵，從發(fā)酵開(kāi)始到72小時(shí)溫度控制在-31°C， 從M小時(shí)開(kāi)始流加蔗糖，控制發(fā)酵液中葡萄糖量在35g/LL，72小時(shí)以后控制溫度在25°C左右，并且繼續(xù)流加蔗糖控制發(fā)酵液中葡萄糖含量15g/L，直至發(fā)酵136小時(shí)停止加蔗糖，發(fā)酵直至發(fā)酵液中葡萄糖含量降至0后繼續(xù)發(fā)酵8小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中pH控制5. 8-7. 2之間， 直至發(fā)酵結(jié)束大概166小時(shí)左右，生物量達(dá)到74g/L (干重)，普魯蘭多糖總量為52g/L，聚蘋果酸總量為37g/L。菌種為CGMCC3337。實(shí)施例2:使用30L通用式發(fā)酵罐配置18L發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方蔗糖135g/L，蛋白胨 30g/L，碳酸鈣30g/L，氯化鉀lg/L，硝酸鈉2g/L，硫酸鎂0. 4g/L，磷酸二氫鉀2. 8g/L，Mn2+、 Fe2\ Zn2+各在0. 25g/L，按常規(guī)滅菌方式在121 °C下實(shí)罐滅菌20min，待培養(yǎng)基溫度降至
后接入菌種，按6% (種子液與發(fā)酵液的體積比)的接種量接入發(fā)酵罐，攪拌轉(zhuǎn)速在 400rpm，通風(fēng)比為1VVM，控制溫度左右開(kāi)始發(fā)酵，從發(fā)酵開(kāi)始到72小時(shí)溫度控制在 280C -31°C，從M小時(shí)開(kāi)始流加蔗糖，控制發(fā)酵液中葡萄糖量在40g/L，72小時(shí)以后控制溫度在25°C左右，并且繼續(xù)流加蔗糖控制發(fā)酵液中葡萄糖含量20g/L，直至發(fā)酵136小時(shí)停止加蔗糖，發(fā)酵直至發(fā)酵液中葡萄糖含量降至0后繼續(xù)發(fā)酵8小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中pH控制5-6 之間，直至發(fā)酵結(jié)束大概166小時(shí)左右，生物量達(dá)到94g/L (干重)，普魯蘭多糖總量為73g/ L，聚蘋果酸總量為51/L。實(shí)施例3 使用30L通用式發(fā)酵罐配置18L發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方蔗糖200g/L，蛋白胨 50g/L,碳酸鈣40g/L,氯化鉀2g/L，硝酸鈉3g/L，硫酸鎂0. 6g/L，磷酸二氫鉀4g/L，Mn2+、 Fe2\ Zn2+各在0. 4g/L，按常規(guī)滅菌方式在121 °C下實(shí)罐滅菌20min，待培養(yǎng)基溫度降至
后接入菌種，按10% (種子液與發(fā)酵液的體積比)的接種量接入發(fā)酵罐，攪拌轉(zhuǎn)速在 600rpm，通風(fēng)比為1. 5VVM，控制溫度左右開(kāi)始發(fā)酵，從發(fā)酵開(kāi)始到72小時(shí)溫度控制在 280C -31°C，從M小時(shí)開(kāi)始流加蔗糖，控制發(fā)酵液中葡萄糖量在50g/L，72小時(shí)以后控制溫度在25°C左右，并且繼續(xù)流加蔗糖控制發(fā)酵液中葡萄糖含量30g/L，直至發(fā)酵136小時(shí)停止加蔗糖，發(fā)酵直至發(fā)酵液中葡萄糖含量降至O后繼續(xù)發(fā)酵8小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中pH控制6-7之間，直至發(fā)酵結(jié)束大概166小時(shí)左右，生物量達(dá)到113g/L(干重)，普魯蘭多糖總量為90g/ L，聚蘋果酸總量為65g/L。
權(quán)利要求
1.一種出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法，包括如下步驟，發(fā)酵罐培養(yǎng)基溫度降至后接入菌種，按3%的接種量接入發(fā)酵罐，攪拌轉(zhuǎn)速在200rpm，通風(fēng)比為 0. 5VVM，控制溫度-31°C左右開(kāi)始發(fā)酵，從M小時(shí)開(kāi)始流加蔗糖，控制發(fā)酵液中葡萄糖量在35g/L，72小時(shí)以后控制溫度在25°C左右，繼續(xù)流加蔗糖控制發(fā)酵液中葡萄糖含量 15g/L，發(fā)酵136小時(shí)停止加蔗糖，發(fā)酵液中葡萄糖含量降至0后繼續(xù)發(fā)酵8小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中pH控制5-72之間，發(fā)酵166小時(shí)。
2.如權(quán)1所述一種出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法，其特征在于所用菌種為出芽短梗霉或通過(guò)誘變和基因工程改造的工程菌。
3.如權(quán)1所述一種出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法，其特征在于在發(fā)酵液中通過(guò)添加蘋果酸、富馬酸、琥珀酸、碳酸鈣來(lái)促進(jìn)產(chǎn)物合成。
4.如權(quán)1所述一種出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蔗糖 80g/L-200g/L，蛋白胨 5g/L-50g/L，碳酸鈣 5g/L_40g/L，氯化鉀 0. lg/L_2g/L， 硝酸鈉 lg/L_3g/L，硫酸鎂 0. lg/L-0. 6g/L，磷酸二氫鉀 0. 05g/L_4g/L，Mn2+、Fe2\ Zn2+ 各在 0.00lg/L-0. 4g/L。
5.如權(quán)4所述一種出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蔗糖80g/L，蛋白胨5g/L，碳酸鈣5g/L，氯化鉀0. lg/L，硝酸鈉lg/L，硫酸鎂 0. lg/L,磷酸二氫鉀 0. 05g/L, Mn2+、Fe2+、Zn2+ 各在 0. 00lg/L-0. 4g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法。本發(fā)明涉及一種通過(guò)出芽短梗霉細(xì)胞生產(chǎn)聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法，屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。一種出芽短梗霉聯(lián)產(chǎn)聚蘋果酸和普魯蘭多糖的方法，包括如下步驟，發(fā)酵罐培養(yǎng)基溫度降至28℃后接入菌種，按3％的接種量接入發(fā)酵罐，攪拌轉(zhuǎn)速在200rpm，通風(fēng)比為0.5VVM，控制溫度28℃-31℃左右開(kāi)始發(fā)酵，從24小時(shí)開(kāi)始流加蔗糖，控制發(fā)酵液中葡萄糖量在35g/L，72小時(shí)以后控制溫度在25℃左右，繼續(xù)流加蔗糖控制發(fā)酵液中葡萄糖含量15g/L，發(fā)酵136小時(shí)停止加蔗糖，發(fā)酵液中葡萄糖含量降至0后繼續(xù)發(fā)酵8小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中pH控制5-7.2之間，發(fā)酵166小時(shí)。提高原料利用率，節(jié)約能源，降低了成本。
文檔編號(hào)C12P7/62GK102492740SQ20111043005
公開(kāi)日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者喬長(zhǎng)晟, 姜少麗, 敖愛(ài)華, 蓋麗豐, 郝華璇 申請(qǐng)人:天津北洋百川生物技術(shù)有限公司