專(zhuān)利名稱(chēng)：一種臍帶血調(diào)節(jié)性t細(xì)胞體外擴(kuò)增及低溫保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞體外擴(kuò)增和保存方法，具體地說(shuō)，是一種臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞體外擴(kuò)增及低溫保存方法。
背景技術(shù)：
受體對(duì)MHC不匹配的移植物發(fā)生排斥反應(yīng)是組織和細(xì)胞移植失敗的主要原因。在目前臨床實(shí)踐中，傳統(tǒng)免疫抑制藥物的使用，雖能有效防止移植排斥，緩解由供者T細(xì)胞介導(dǎo)的急、慢性移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)，但常伴有受者整體免疫功能下降，感染機(jī)會(huì)增加和誘發(fā)腫瘤等副作用。因此，以誘導(dǎo)供受者之間移植免疫耐受為目的的細(xì)胞治療方法日益受到重視。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Tregs)作為一種具有強(qiáng)大免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，被公認(rèn)為免疫反應(yīng)的主要負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞，而基于Treg細(xì)胞的細(xì)胞療法也被認(rèn)為是最有希望成功的細(xì)胞療法。Treg細(xì)胞可以通過(guò)多種方式調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，包括分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β ；大量消耗維持炎癥細(xì)胞生存的細(xì)胞因子IL-2以及細(xì)胞表面的接觸抑制。同時(shí)活化Treg可以發(fā)揮廣譜的抑制效應(yīng)，且這種抑制效應(yīng)可以不受MHC分子限制。小鼠骨髓移植實(shí)驗(yàn)證明新鮮分離或體外擴(kuò)增的小鼠Treg細(xì)胞能有效的抑制GVHD，這說(shuō)明人Treg細(xì)胞也可能同樣具有這樣的治療潛力。然而，人Treg細(xì)胞的臨床運(yùn)用存在著許多問(wèn)題和挑戰(zhàn)。首先，機(jī)體內(nèi)天然的Treg 細(xì)胞數(shù)目很少，在人體內(nèi)，Treg細(xì)胞占⑶4+Τ細(xì)胞的5% 10%。這就需要建立有效的Treg 細(xì)胞體外擴(kuò)增方法，才能滿足大量的臨床輸注需要。其次，與小鼠Treg不同，人Treg細(xì)胞不能單純依靠⑶25這一表面標(biāo)志進(jìn)行分離。一些Treg表達(dá)的標(biāo)志，如R)XP3、CTLA-4和 GITR，也在某些活化效應(yīng)T細(xì)胞上表達(dá)。所以，在分離人Treg細(xì)胞亞群時(shí)存在著巨大的困難，不能僅僅依靠上述這些標(biāo)志進(jìn)行分離。而相對(duì)的，來(lái)源于臍血的T細(xì)胞基本保持幼稚狀態(tài)，T細(xì)胞亞群分布簡(jiǎn)單，存在明顯的Treg細(xì)胞亞群，同時(shí)其含量也高于外周血。另外由于其含有相對(duì)較長(zhǎng)的端粒，因而能夠大量擴(kuò)增。因此，臍血是Treg細(xì)胞的一個(gè)優(yōu)質(zhì)的來(lái)源。盡管仍有許多問(wèn)題尚待解決，但令人鼓舞的是，多個(gè)Treg細(xì)胞的臨床I期實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行，并且在近期取得了重要進(jìn)展。美國(guó)和意大利血液病專(zhuān)家已完成了兩項(xiàng)體外擴(kuò)增臍血和外周血Treg細(xì)胞抑制GVHD的I期臨床試驗(yàn)，證明經(jīng)第三方無(wú)關(guān)供者Treg細(xì)胞治療的病人其GVHD癥狀明顯減輕，且沒(méi)有出現(xiàn)感染、復(fù)發(fā)或早期死亡的情況。這明確了體外擴(kuò)增的第三方無(wú)關(guān)供者臍帶血Treg細(xì)胞在抑制GVHD上具有顯著的臨床效果，也有力的證實(shí)了臍帶血Treg細(xì)胞的臨床運(yùn)用是安全的。有研究表明，臍帶血Treg細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外擴(kuò)增培養(yǎng)后其在體內(nèi)外的抑制能力要比新鮮分離的Treg細(xì)胞更強(qiáng)，而且Treg細(xì)胞經(jīng)過(guò)凍存和融化后仍然能發(fā)揮其有效的抑制功能。綜上所述，對(duì)臍帶血Treg細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增并進(jìn)行深低溫保存，建立體外擴(kuò)增的第三方無(wú)關(guān)供者人臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞冷凍保存庫(kù)將極大地推動(dòng) Treg細(xì)胞臨床治療造血干細(xì)胞移植移植物抗宿主病、同種異基因器官移植排斥、自身免疫性疾病的開(kāi)展。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN1509327B公開(kāi)了一種來(lái)自人類(lèi)血液的⑶4⑶25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，該發(fā)明提供抑制性和/或調(diào)節(jié)性人類(lèi)CD4+CD25+T細(xì)胞，用于增殖該細(xì)胞的方法，及抑制性和/ 或調(diào)節(jié)性人類(lèi)CD4+CD25+T細(xì)胞和增殖的T細(xì)胞作為調(diào)節(jié)性藥劑的用途。但是關(guān)于一種臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞體外擴(kuò)增及低溫保存方法目前還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞體外擴(kuò)增及低溫保存方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的是，提供一種所述的方法擴(kuò)增后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞體外擴(kuò)增及低溫保存方法，所述的方法包括以下步驟
a、用羥乙基淀粉代漿液分離臍帶血中有核細(xì)胞，用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個(gè)核細(xì)胞，臍帶血單個(gè)核細(xì)胞用免疫磁珠陰性分離步驟去除非CD4細(xì)胞得到CD4+細(xì)胞，臍帶血CD4+細(xì)胞進(jìn)一步用免疫磁珠陽(yáng)性分離步驟分離出CD25+細(xì)胞，獲得富含調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的臍血CD4+CD25+T細(xì)胞；
b、在細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞培養(yǎng)袋中用連接⑶3/^擬8抗體的磁珠和重組人IL-2擴(kuò)增富集的臍帶血⑶4+⑶25+Τ細(xì)胞，獲得高純度的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；
c、將所述擴(kuò)增后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞低溫保存在液氮中。所述的步驟a中分離得到臍帶血單個(gè)核細(xì)胞的步驟包括輸血傳播傳染病檢測(cè)合格的臍帶血按體積比4 1的比例加入6%羥乙基淀粉代漿液，4°C冰箱放置沉淀紅細(xì)胞，取上層血漿層離心，棄大部分血漿，沉淀的白細(xì)胞重懸后用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離，用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個(gè)核細(xì)胞。所述的步驟b中擴(kuò)增時(shí)間為2-3周，其中包括兩輪各6-8天的擴(kuò)增和兩輪擴(kuò)增中間細(xì)胞休息2-4天。所述的步驟c中擴(kuò)增后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與冷凍保護(hù)劑預(yù)處理后，分裝入冷凍管或冷凍袋中液氮-196°C保存。所述的冷凍保護(hù)劑由10% 二甲基亞砜，20%人白蛋白，70%羥乙基淀粉代漿液組成。所述的CD4+CD25+T細(xì)胞擴(kuò)增后80_99%的細(xì)胞為CD4+CD25+T細(xì)胞，擴(kuò)增后 CD4+CD25+T細(xì)胞中FoxP3+CD127-細(xì)胞比例大于80%。所述的CD4+CD25+T細(xì)胞擴(kuò)增后數(shù)量為起始細(xì)胞的1000-3000倍。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是所述的方法擴(kuò)增或低溫保存后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞作為第三方無(wú)關(guān)供者細(xì)胞在制備治療移植物抗宿主病、器官移植排斥、 自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于
本發(fā)明所述的一種臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞體外擴(kuò)增及低溫保存的方法，可以從臍帶血中獲得大量的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，在液氮中長(zhǎng)期保存，能夠滿足臨床對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞制品的需求， 用于治療移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫性疾病。


圖1是擴(kuò)增14天流式細(xì)胞儀檢測(cè)臍血Treg細(xì)胞的表型。擴(kuò)增后的臍帶血Treg細(xì)胞共表達(dá)⑶4和⑶25，90%以上的細(xì)胞表達(dá)R)xP3。同時(shí)，與新鮮分選的⑶4+⑶25+T細(xì)胞相比,這些細(xì)胞高表達(dá) CTLA-4 (68%)、CD39 (71%)和 LAG-3 (45%)。圖2是擴(kuò)增后的臍血Treg細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)。與活化的⑶4+⑶25-T細(xì)胞相比，擴(kuò)增后的臍帶血Treg細(xì)胞幾乎不表達(dá)IL-2基因，表達(dá)少量的IFN-γ，而高表達(dá)IL-10 和TGF-β基因。圖3是體外擴(kuò)增的第三方無(wú)關(guān)供者臍血Treg抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖。從外周血磁珠分離得到⑶4+⑶25-細(xì)胞作為效應(yīng)T細(xì)胞(Tste),經(jīng)CFSE染色后，按Treg與Tste細(xì)胞不同比例加入擴(kuò)增后的第三方無(wú)關(guān)供者的臍帶血Treg細(xì)胞，每孔用CD3/C^8單克隆抗體或者成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(mDC)刺激活化，培養(yǎng)4天后收集細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行結(jié)果分析。 第三方無(wú)關(guān)供者的臍帶血Treg細(xì)胞在Treg: Tjs應(yīng)細(xì)胞比例為1 1、1 4、1 16時(shí)能有效抑制效應(yīng)T細(xì)胞的體外擴(kuò)增。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的一種臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞體外擴(kuò)增及低溫保存方法包括以下步驟
1.輸血傳播傳染病檢測(cè)合格的臍帶血按體積比4:1的比例加入6%羥乙基淀粉代漿液，4°C冰箱放置沉淀紅細(xì)胞，取上層血漿層離心，棄大部分血漿，沉淀的白細(xì)胞重懸后用 Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離，用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個(gè)核細(xì)胞。2.臍帶血單個(gè)核細(xì)胞用免疫磁珠陰性分離步驟去除非CD4細(xì)胞得到CD4+細(xì)胞， 臍帶血CD4+細(xì)胞進(jìn)一步用免疫磁珠陽(yáng)性分離步驟分離出CD25+細(xì)胞獲得富含調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的臍血CD4+CD25+T細(xì)胞。3.在細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞培養(yǎng)袋中用連接⑶3/^擬8抗體的磁珠和重組人IL-2擴(kuò)增富集的臍帶血CD4+CD25+T細(xì)胞，擴(kuò)增時(shí)間為2-3周，其中包括兩輪各6_8天的擴(kuò)增和兩輪擴(kuò)增中間細(xì)胞休息2-4天。4.擴(kuò)增后臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞去除⑶磁珠，與冷凍保護(hù)劑預(yù)處理后，分裝入冷凍管或冷凍袋中液氮-196 °C保存。冷凍保護(hù)劑由10% 二甲基亞砜(DMSO), 20%人白蛋白，70%羥乙基淀粉代漿液(HES)組成。5.凍存的臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞復(fù)蘇后作為第三方無(wú)關(guān)供者輸注治療移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫性疾病。上述全部過(guò)程均在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行。需要說(shuō)明的是，所述的CD4+CD25+T細(xì)胞擴(kuò)增后80%_99%的細(xì)胞為CD4+CD25+T細(xì)胞，擴(kuò)增后CD4+CD25+T細(xì)胞中R)xP3+CD127-細(xì)胞比例大于80%。所述的CD4+CD25+T細(xì)胞擴(kuò)增后數(shù)量為起始細(xì)胞的1000-3000倍。實(shí)施例1
臍帶血按體積比4:1的比例加入6%羥乙基淀粉代漿液，4°C冰箱放置Ih沉淀紅細(xì)胞， 取上層血漿層離心(2000rpm/min，5min)，棄大部分血漿，沉淀的白細(xì)胞重懸后用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離(2000rpm/min，20min)，用PBS洗滌三次，得到臍帶血單個(gè)核細(xì)胞。根據(jù)廠家的說(shuō)明，用標(biāo)準(zhǔn)分離試劑盒，例如使用CliniMACS，Miltenyi Biotec公司的抗人CD8、 CD14、CD19、CD56單克隆抗體免疫磁珠去除臍帶血單個(gè)核細(xì)胞中的非CD4細(xì)胞，然后對(duì)臍帶血⑶4+T細(xì)胞用抗人⑶25抗體偶聯(lián)的磁珠富集⑶4+⑶25+細(xì)胞。臍帶血⑶4+⑶25+T細(xì)胞純化后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離細(xì)胞的純度。實(shí)施例2
在商購(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)袋或細(xì)胞培養(yǎng)板中用抗人CD3/CM8抗體偶聯(lián)的磁珠以及重組人 IL-2 (200U/ml)對(duì)純化的臍帶血CD4+CD25+T細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增，使用X-VIV015完全培養(yǎng)液培養(yǎng)(含有10%滅活人AB血清，青、鏈霉素雙抗50U/ml)，培養(yǎng)體系中CD3/C^8包被的 Dynal Beads與細(xì)胞的比例為1 1，于37°C、5%C02及飽和濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，隔天半量更換培養(yǎng)液和IL-2。整個(gè)擴(kuò)增時(shí)間為2-3周，其中包括各6-8天的兩輪擴(kuò)增和兩輪擴(kuò)增中間細(xì)胞休息2-4天，即細(xì)胞去除磁珠后在含IL-2 (20U/ml)的X-VIV015完全培養(yǎng)液培養(yǎng)2 天。體外擴(kuò)增結(jié)束后細(xì)胞數(shù)量增加約1500倍，臍帶血Treg細(xì)胞除去磁珠檢測(cè)表面標(biāo)志和體外抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖的能力，并進(jìn)行低溫保存。實(shí)施例3
采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行臍帶血Treg細(xì)胞免疫表型分析。使用FITC標(biāo)記的CD4抗體、 PE-Cy5標(biāo)記的⑶25抗體、APC標(biāo)記的⑶127抗體、PE標(biāo)記的CTLA-4抗體、⑶39抗體、LAG3 抗體進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記，經(jīng)固定液和破膜液處理之后，用PE標(biāo)記的R)xp3進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記。 如圖1所示，擴(kuò)增后的臍帶血iTreg細(xì)胞共表達(dá)⑶4和⑶25，90%以上的細(xì)胞表達(dá)R)xP3。同時(shí)，與新鮮分選的CD4+CD25+T細(xì)胞相比，擴(kuò)增后臍帶血Treg細(xì)胞高表達(dá)CTLA_4(68%)、CD39 (71%)和 LAG-3 (45%)ο實(shí)施例4
采用微量抽提RNA方法獲得活化的外周血CD4+CD25-T細(xì)胞以及擴(kuò)增后Treg細(xì)胞總 RNA,再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，所獲得的cDNA作為擴(kuò)增靶基因片段，用于后續(xù)Real-time PCR體系中。以β-actin作為參照量，細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10、TGF-β作為靶基因，通過(guò)Real-time PCR比較活化的外周血⑶4+⑶25-T細(xì)胞和擴(kuò)增后iTreg細(xì)胞IL_2、IFN- γ、 IL-10、TGF-β基因表達(dá)的差異。如圖2所示，與活化的⑶4+CD25_T細(xì)胞相比，擴(kuò)增后的臍帶血Treg細(xì)胞幾乎不表達(dá)IL-2基因，表達(dá)少量的IFN- γ，而高表達(dá)IL-10和TGF- β基因。實(shí)施例5
從外周血免疫磁珠分離純化得到的⑶4+⑶25-細(xì)胞作為效應(yīng)T細(xì)胞，經(jīng)CFSE (5μΜ) 染色后，以5 X IO4/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，再按Treg與效應(yīng)T細(xì)胞不同比例(1 1、1 4、 1:16,1:64)加入擴(kuò)增后的第三方無(wú)關(guān)供者的臍帶血Treg細(xì)胞，每孔用⑶3/^擬8單克隆抗體(300ng/ml)或者經(jīng)絲裂霉素處理后的同種異基因成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(mDC)刺激活化，于 37°C、5% 0)2及飽和濕度條件下培養(yǎng)4天，4天之后收集細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行結(jié)果分析。 如圖3所示，第三方無(wú)關(guān)供者的臍帶血Treg細(xì)胞在Treg: T效應(yīng)細(xì)胞比例為1:1、1:4、1:16 時(shí)能有效抑制效應(yīng)T細(xì)胞的體外擴(kuò)增。實(shí)施例6
擴(kuò)增后臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞去除CD3/CD^磁珠，與冷凍保護(hù)劑預(yù)處理后，分裝入冷凍管或冷凍袋中液氮_196°C保存。冷凍保護(hù)劑由10% 二甲基亞砜(DMS0)，20%人白蛋白，70% 羥乙基淀粉代漿液(HES)組成。人臍帶血經(jīng)過(guò)嚴(yán)格檢測(cè)程序(梅毒抗體檢測(cè)、HIV免疫檢測(cè)、 CMV抗體檢測(cè)、乙型肝炎抗原抗體檢測(cè)等)檢測(cè)合格后進(jìn)行富集和體外擴(kuò)增Treg細(xì)胞，獲得的臍帶血Treg細(xì)胞經(jīng)純度和體內(nèi)外抑制功能檢測(cè)合格后凍存在液氮中，用于治療移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫性疾病。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞體外擴(kuò)增及低溫保存方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟a、用羥乙基淀粉代漿液分離臍帶血中有核細(xì)胞，用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個(gè)核細(xì)胞，臍帶血單個(gè)核細(xì)胞用免疫磁珠陰性分離步驟去除非CD4細(xì)胞得到CD4+細(xì)胞，臍帶血CD4+細(xì)胞進(jìn)一步用免疫磁珠陽(yáng)性分離步驟分離出CD25+細(xì)胞，獲得富含調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的臍血CD4+CD25+T細(xì)胞；b、在細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞培養(yǎng)袋中用連接⑶3/^擬8抗體的磁珠和重組人IL-2擴(kuò)增富集的臍帶血⑶4+⑶25+Τ細(xì)胞，獲得高純度的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；c、將所述擴(kuò)增后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞低溫保存在液氮中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟a中分離得到臍帶血單個(gè)核細(xì)胞的步驟包括輸血傳播傳染病檢測(cè)合格的臍帶血按體積比4:1的比例加入6%羥乙基淀粉代漿液，4°C冰箱放置沉淀紅細(xì)胞，取上層血漿層離心，棄大部分血漿，沉淀的白細(xì)胞重懸后用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離，用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個(gè)核細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟b中擴(kuò)增時(shí)間為2-3周，其中包括兩輪各6-8天的擴(kuò)增和兩輪擴(kuò)增中間細(xì)胞休息2-4天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟c中擴(kuò)增后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與冷凍保護(hù)劑預(yù)處理后，分裝入冷凍管或冷凍袋中液氮-196°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的冷凍保護(hù)劑由10%二甲基亞砜，20% 人白蛋白，70%羥乙基淀粉代漿液組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的CD4+CD25+T細(xì)胞擴(kuò)增后80-99%的細(xì)胞為CD4+CD25+T細(xì)胞，擴(kuò)增后CD4+CD25+T細(xì)胞中R)xP3+CD127-細(xì)胞比例大于80%。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的CD4+CD25+T細(xì)胞擴(kuò)增后數(shù)量為起始細(xì)胞的1000-3000倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的方法擴(kuò)增或低溫保存后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞作為第三方無(wú)關(guān)供者細(xì)胞在制備治療移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞體外擴(kuò)增及低溫保存方法，所述的方法包括以下步驟從臍帶血中分離富含調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的CD4+CD25+T細(xì)胞群；擴(kuò)增所述富集后的CD4+CD25+T細(xì)胞群獲得高純度的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；將所述擴(kuò)增后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞低溫保存在液氮中，作為第三方無(wú)關(guān)供者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞應(yīng)用于臨床疾病治療。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明所述的方法，可以從臍帶血中獲得大量的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，在液氮中長(zhǎng)期保存，能夠滿足臨床對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞制品的需求，用于治療移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫性疾病。
文檔編號(hào)C12N5/0783GK102517253SQ20111042524
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者任亞娜, 楊懿銘, 楊潔, 范華驊, 謝如鋒 申請(qǐng)人:上海市血液中心