專利名稱：同時(shí)檢測aiv-hpaiv-ndv的一步法熒光rt-pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同時(shí)檢測AIV-HPAIV-NDV的一步法熒光RT-PCR試劑盒，屬于一種快速、靈敏的針對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的安全檢測技術(shù)，為禽類養(yǎng)殖和禽產(chǎn)品的“綠色產(chǎn)業(yè)”提供技術(shù)保障； 主要應(yīng)用于農(nóng)牧企業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)。
背景技術(shù)：
禽流感(Al)和新城疫(ND)是嚴(yán)重危害禽類的病毒性疾病，常以單獨(dú)或混合感染的方式感染家禽，發(fā)病率和死亡率都很高。這兩種疾病均導(dǎo)致禽類出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)疾病癥狀，在流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化等方面均有許多相似的地方，因此在臨床鑒別診斷存在很大的困難。當(dāng)這兩種病毒混合感染時(shí)，對(duì)其正確判斷并進(jìn)行防制也更加困難。近年來，禽流感和新城疫的發(fā)生和流行不僅嚴(yán)重影響了人民的消費(fèi)信心，也導(dǎo)致國際間的禽類產(chǎn)品貿(mào)易受阻，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和國際信譽(yù)危機(jī)，更由于不斷發(fā)生的禽流感病毒致人發(fā)病而死亡的事件，極大地干擾了人民生活和社會(huì)穩(wěn)定。目前，對(duì)于禽流感H5、H7、H9亞型和新城疫病毒病檢測主要采用的技術(shù)方法有 HA-HI、ELISA、免疫熒光技術(shù)、RT-PCR、病毒分離以及基因芯片等。這些方法雖然均能很好地檢測禽流感病毒和新城疫病毒，但是均存在一定的不足，大部分方法一次只能鑒定一種亞型，或者需要先進(jìn)的儀器和昂貴的試劑，或者靈敏度不高，難以達(dá)到禽產(chǎn)品進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn)。這些因素限制了禽流感和新城疫病毒病的預(yù)防控制，因此建立一種高于農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的更加快速、靈敏、特異、重復(fù)性好的同時(shí)檢測AI-HPAI-ND病毒的一步法RT-熒光 PCR方法迫在眉睫。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。同時(shí)檢測 AI-HPAI-ND病毒的一步法熒光RT- PCR技術(shù)是根據(jù)AIV H5、H7、H9亞型HA基因和保守型序列以及NDV的保守型序列，設(shè)計(jì)出5對(duì)RT-PCR引物和探針。便于應(yīng)用我們做成試劑盒， 而且為了組裝成試劑盒兼顧試劑儲(chǔ)存的穩(wěn)定性，我們采用PCR MIX.Enzyme MIX組份分開的形式。為確保本試劑盒為綠色環(huán)保的試劑盒，我們采用體外轉(zhuǎn)錄的RNA作為外標(biāo)質(zhì)控品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)檢測AIV-HPAIV-NDV的一步法熒光RT-PCR試劑盒，其是一種高于農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的快速、靈敏、特異、重復(fù)性好的一步法熒光RT- PCR試劑盒，能同時(shí)檢測禽流感-高致病禽流感-新城疫病毒，其利用熒光定量PCR的原理，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，此方法具有簡單、快速、敏感、特異性好等特點(diǎn)，適用于臨床和檢驗(yàn)部門，為禽流感/新城疫的預(yù)防和控制提供理論和技術(shù)支撐；對(duì)現(xiàn)有各個(gè)亞型序列分析的基礎(chǔ)上，選取保守基因序列設(shè)計(jì)出5對(duì)特異性的引物和特異性熒光探針，采用Trizol法提取AIV和NDV的RNA，同時(shí)，利用一步熒光RT-PCR技術(shù)對(duì)AIV和NDV進(jìn)行檢測；在核酸提取結(jié)束后直接在體系中加入RT-PCR 反應(yīng)液，cDNA的合成與PCR反應(yīng)在同一管中進(jìn)行，不用增加額外的步驟。該操作在不影響準(zhǔn)確度的情況下，不僅縮短了操作時(shí)間、減少了污染、降低了勞動(dòng)強(qiáng)度，而且也直接降低了臨床樣品PCR診斷的成本，延續(xù)了熒光定量PCR檢測方法的快速簡便性能，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的一種同時(shí)檢測AI-HPAI-ND病毒的一步法熒光 RT-PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒由反轉(zhuǎn)錄引物(1 )、反轉(zhuǎn)錄體系(2 )、PCR體系(3 )、陽性對(duì)照(4)、陰性對(duì)照(5)組成；其中反轉(zhuǎn)錄引物(1)為通用的隨機(jī)引物；反轉(zhuǎn)錄體系(2)包括反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、Buffer、dNTPs ； PCR體系(3)包括Buffer、dNTPs、混合上下游引物、探針、Taq酶、DEPC水；陽性對(duì)照(4)為通用型\H5\H7\H9AIV與NDV純化的質(zhì)粒；陰性對(duì)照(5)為滅菌的DEPC水。其建立的5對(duì)特異性引物和探針
權(quán)利要求
1. 一種同時(shí)檢測AI-HPAI-ND病毒的一步法熒光RT-PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒由反轉(zhuǎn)錄引物(1)、反轉(zhuǎn)錄體系(2)、PCR體系(3)、陽性對(duì)照(4)、陰性對(duì)照(5)組成，其中反轉(zhuǎn)錄引物(1)為通用的隨機(jī)引物；反轉(zhuǎn)錄體系(2)包括反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、Buffer、 dNTPs ； PCR體系(3)包括Buffer、dNTPs、混合上下游引物、探針、Taq酶、DEPC水；陽性對(duì)照(4)為通用型\H5\H7\H9AIV與NDV純化的質(zhì)粒；陰性對(duì)照(5)為滅菌的DEPC水； 本方法建立的5對(duì)特異性引物和探針 AIV H5 上游引物5’-TTATTCAACAGTGGCGAG-3' 下游引物5 ‘ -CCAG (T) AAAGATAGACCAGC-3 ’ 探針序列5’FAM -CCCTAGCACTGGCAATCATG-BHQ3‘ AIV H7 上游引物5'-TTTGGTTTAGCTTCGGG-3'下游引物5 ‘ -GAAGAA (C) AAGGCC (T) CATTG-3 ’ 探針序列:5'FAM -CATCATGTTTCATACTTCTGGCCAT- BHQ 3' AIV H9 上游引物5’-ATGGGGTTTGCTGCC-3'下游引物5' -TTATACAAATGTTGCAC (T) CTG-3' 探針序列:5'FAM -TTCTGGGCCATGTCCAATGG- BHQ 3' AIV Ml 上游引物5'- CCAGTGAGCGAGGACTGCAG-3‘ 下游引物5'- GGATCCCCATTCCCATTGAG-3‘ 探針序列5 ‘ FAM-TGGACTGGAATGATAGATG-BHQ3‘ NDV Ml 上游引物5'- AGTGATGTGCTCGGACCTTC-3‘ 下游引物5 ‘ - CCTGAGGAGAGGCATTTGCTA-3 ’ 探針序列5'FAM- TTCTCTAGCAGTGGGACAGCCTGC-BHQ3'。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種同時(shí)檢測AI-HPAI-ND病毒的一步法熒光RT-PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒由反轉(zhuǎn)錄引物、反轉(zhuǎn)錄體系、PCR體系、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照組成，其中反轉(zhuǎn)錄引物為通用的隨機(jī)引物；反轉(zhuǎn)錄體系包括反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、Buffer、dNTPs;PCR體系包括Buffer、dNTPs、混合上下游引物、探針、Taq酶、DEPC水；陽性對(duì)照為通用型\H5\H7\H9AIV與NDV純化的質(zhì)粒；陰性對(duì)照為滅菌的DEPC水；其采用自身設(shè)計(jì)的特異性引物和Taqman探針，使用FAM/BHQ熒光標(biāo)記素標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)對(duì)通用型AI-H5/H7/H9亞型AI-ND病毒的一管多型檢測，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、操作簡單方便等優(yōu)點(diǎn)，可以為禽類養(yǎng)殖和禽產(chǎn)品的“綠色產(chǎn)業(yè)”提供技術(shù)保障，主要應(yīng)用于農(nóng)牧企業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102409111SQ201110423390
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者丁壯, 叢彥龍, 劉慧 , 姜翠翠, 張曉東, 朱利塞, 李想, 李鑫, 母連志, 韓明明 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)