專(zhuān)利名稱(chēng)：鑒定長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體的TRAP-SCAR₂₅₂標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體鑒定的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒定長(zhǎng)穗偃麥草E 組染色體的TRAP-SCARm2標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一。在中國(guó)它是僅次于水稻的第二大農(nóng)作物，小麥生產(chǎn)對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著十分重要的戰(zhàn)略意義。由于小麥栽培品種單一化，使其遺傳基礎(chǔ)日益狹窄，抗源匱乏，極大地限制了其產(chǎn)量和品質(zhì)的進(jìn)一步改良。小麥的近緣物種中存在著大量的遺傳變異，是小麥改良可以利用的有益基因資源，將這些有益基因?qū)胄←溡恢笔沁z傳學(xué)家和育種學(xué)家經(jīng)久不衰的研究課題。偃麥草屬是小麥的一個(gè)近緣種屬，它具有普通小麥缺少的許多優(yōu)良性狀，如分蘗能力強(qiáng)，根系發(fā)達(dá)，抗寒、抗旱、耐瘠薄、耐鹽堿力強(qiáng)，多花、大穗、多實(shí)，籽粒蛋白含量高以及優(yōu)良的烘烤品質(zhì)，抗多種病害能力強(qiáng)，對(duì)小麥條銹病、 葉銹病、桿銹病、白粉病、黃矮病、條紋花葉病及腥黑穗病高抗至免疫，是小麥遺傳育種的重要親本之一。長(zhǎng)穗偃麥草(Agropyron elongatum)是小麥的一個(gè)重要近緣種，具有蛋白質(zhì)含量高、抗多種真菌和病毒病害、耐旱、耐寒、大穗多花等優(yōu)異性狀，是在小麥品種改良中應(yīng)用最廣泛的野生種之一。在自然界，長(zhǎng)穗偃麥草有二倍體、四倍體和十倍體3種倍性類(lèi)型。其中二倍體長(zhǎng)穗偃麥草(Thinopyrum elongatum) E組染色體是組成偃麥草屬(Elytrigia)多倍體物種的基本染色體組，攜帶有對(duì)小麥遺傳育種有益的基因，但對(duì)于四倍體和十倍體類(lèi)型的染色體組構(gòu)成，一直沒(méi)有一致的結(jié)論。通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交及染色體工程的方法從普通小麥野生近緣種屬轉(zhuǎn)移優(yōu)良基因的方法已被實(shí)踐證明是一條卓有成效的途徑。目前，國(guó)外從長(zhǎng)穗偃麥草中成功轉(zhuǎn)移了 Sr24 (3DL)，Sr26 (6AL)，Sr25 (7DL，7AL)，Lr 19, Lr24等基因。國(guó)內(nèi)從小麥與長(zhǎng)穗偃麥草雜種后代中育成了小偃4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、小偃107等小麥品種。通過(guò)雜交和漸滲的方式是將外源染色體的優(yōu)良性狀和優(yōu)異基因?qū)胄←湹囊环N有效的方法，但是，在重組的小麥中，源于小麥-長(zhǎng)穗偃麥草雜交后代的外源E組染色質(zhì)或染色體的檢測(cè)成為至關(guān)重要的問(wèn)題，雖然通過(guò)農(nóng)學(xué)上的重要特性以及生化分析已將有價(jià)值的基因繪圖在長(zhǎng)穗偃麥草染色體上，但這些實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)手段是不穩(wěn)定的，而且不適合進(jìn)行重要的農(nóng)學(xué)性狀的檢測(cè)。有一些遺傳學(xué)手段，如染色體分帶、原位雜交等技術(shù)，已經(jīng)將其用于小麥遺傳背景下外源遺傳物質(zhì)的檢測(cè)，但這些技術(shù)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，對(duì)技術(shù)的要求也很高，而且用這些實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行大規(guī)模的后代快速篩選依然存在一定的局限。所以，迫切要求開(kāi)發(fā)一種可以在小麥遺傳背景下快速、準(zhǔn)確、大規(guī)模的鑒定長(zhǎng)穗偃麥草外源染色質(zhì)或染色體的分子標(biāo)記技術(shù)。靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性(TRAP)是一種新型的基于PCR的分子標(biāo)記，由美國(guó)農(nóng)業(yè)部北方作物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室Hu與Vick于2003年提出，它借助大規(guī)模測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生的許多生物的大量序列信息，利用生物信息學(xué)工具和表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag, EST)數(shù)據(jù)庫(kù)信息設(shè)計(jì)引物，對(duì)目標(biāo)候選基因序列區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)生多態(tài)性分子標(biāo)記，該標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的研究中，主要在種質(zhì)資源的鑒定評(píng)價(jià)、遺傳圖譜的構(gòu)建、繪制基因組轉(zhuǎn)錄圖譜、重要的性狀標(biāo)記、比較基因組學(xué)、親緣關(guān)系和遺傳多樣性等方面取得了進(jìn)展。目前，該標(biāo)記已經(jīng)在水稻、大麥、小麥、菜豆、向日葵、甜菜等植物中得到成功應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種鑒定長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體特異TRAP-SCAR252標(biāo)記及其應(yīng)用，為快速、準(zhǔn)確地鑒定小麥遺傳背景下的外源長(zhǎng)穗偃麥草E組染色質(zhì)或染色體
奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種鑒定長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體的標(biāo)記基因，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3或 SEQ. ID. NO. 6 所示。一種擴(kuò)增SEQ. ID. NO. 3所示的標(biāo)記的引物對(duì)，其上、下游引物的核苷酸序列分別如 SEQ. ID. NO. 1、SEQ. ID. NO. 2 所示。一種擴(kuò)增SEQ. ID. NO. 6所示的標(biāo)記的引物對(duì)，其上、下游引物的核苷酸序列分別如 SEQ. ID. NO. 4、SEQ. ID. NO. 5 所示。SEQ. ID. NO. 6所示的序列作為SCAR標(biāo)記應(yīng)用于小麥遺傳背景下的長(zhǎng)穗偃麥草5E 或6E染色體的鑒定或跟蹤檢測(cè)。所述的應(yīng)用是基于長(zhǎng)穗偃麥草5E或6E染色體體系培育小麥品種的分子標(biāo)記輔助育種。所述的應(yīng)用是以SEQ. ID. NO. 4、SEQ. ID. NO. 5所示的上、下游引物對(duì)待測(cè)基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，對(duì)是否含有長(zhǎng)穗偃麥草5E或6E染色體進(jìn)行判定。所述的PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，M°C退火30s， 72°C延伸60s，30 35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。若擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果當(dāng)中含有252bp的目標(biāo)片段，則待測(cè)基因組中含有長(zhǎng)穗偃麥草5E或6E染色體；若擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果當(dāng)中沒(méi)有252bp的目標(biāo)片段，則待測(cè)基因組中沒(méi)有長(zhǎng)穗偃麥草5E或6E染色體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果1、本發(fā)明采用多個(gè)引物組合利用TRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)“中國(guó)春”小麥、二倍體長(zhǎng)穗偃麥草、四倍體長(zhǎng)穗偃麥草三種材料進(jìn)行長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體的多態(tài)性的分析，篩選出長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體的TRAP特異片段，然后再將其轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記；這樣的 SCAR標(biāo)記具有了長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體的特異性，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，非常有利于小麥遺傳背景下的長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體的鑒定和跟蹤檢測(cè)。與現(xiàn)有的鑒定方法相比，利用該 SCAR標(biāo)記進(jìn)行鑒定則無(wú)疑正確率要明顯提升，而且是十分方便、快捷的。2、本發(fā)明獲得的SCAR標(biāo)記稱(chēng)為SCAR252，利用普通小麥“中國(guó)春”、“中國(guó)春”-殺配子染色體2C 二體附加系、二倍體長(zhǎng)穗偃麥草、四倍體長(zhǎng)穗偃麥草材料進(jìn)行了 SCAR標(biāo)記驗(yàn)證，在二倍體長(zhǎng)穗偃麥草、四倍體長(zhǎng)穗偃麥草中擴(kuò)增出了 252bp的片段，而在普通小麥“中國(guó)春”、“中國(guó)春”-殺配子染色體2C 二體附加系中沒(méi)有該產(chǎn)物，初步證明此標(biāo)記可以用于長(zhǎng)
4穗偃麥草E組染色體的檢測(cè)。進(jìn)一步用該對(duì)SCAR引物對(duì)“中國(guó)春”-殺配子染色體2C 二體附加系與“中國(guó)春”-長(zhǎng)穗偃麥草5E 二體附加系的雜種F1代、F2代進(jìn)行了分析，結(jié)果在全部F1代以及部分 F2代材料中擴(kuò)增出了目的片段，進(jìn)一步證明了此SCAR252標(biāo)記可以用來(lái)檢測(cè)小麥背景下的長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體，為小麥背景中長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體的快速跟蹤檢測(cè)提供了新途徑。3、所用到的SCAR標(biāo)記的檢測(cè)，使用的PCR反應(yīng)體系，不需要特殊的PCR反應(yīng)儀器和特殊的反應(yīng)試劑，與其它普通PCR反應(yīng)要求一樣；只需要在PCR擴(kuò)增之后通過(guò)電泳檢測(cè)， 就可以根據(jù)電泳結(jié)果有無(wú)大小相同的目的條帶進(jìn)行判定，操作簡(jiǎn)單方便。4、本發(fā)明提供的長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體的標(biāo)記，通過(guò)SCAR標(biāo)記的檢測(cè)，為快速鑒定小麥遺傳背景下的長(zhǎng)穗偃麥草E組外源染色質(zhì)或染色體奠定了良好的基礎(chǔ)，同時(shí)也為分子標(biāo)記輔助育種提供了十分方便快捷的途徑。


圖1為T(mén)RAP引物在三種不同材料中的擴(kuò)增結(jié)果，泳道1為普通小麥“中國(guó)春”，泳道2為二倍體長(zhǎng)穗偃麥草，泳道3為四倍體長(zhǎng)穗偃麥草(Marker :DL2000)；圖2為核苷酸序列SEQ. ID No. 3 (稱(chēng)為RGA-11F ARB15)，在NCBI中進(jìn)行Blast搜索的結(jié)果；圖3為SCARm2分子標(biāo)記在四種不同材料中的擴(kuò)增結(jié)果，泳道1為“中國(guó)春”，泳道 2為“中國(guó)春”-殺配子染色體2C 二體附加系，泳道3為二倍體長(zhǎng)穗偃麥草，泳道4為四倍體長(zhǎng)穗偃麥草(Marker :DL2000)；圖4為SCAI^2分子標(biāo)記在“中國(guó)春”-長(zhǎng)穗偃麥草IE 7E —套二體附加系中的定位結(jié)果，泳道1為“中國(guó)春”，泳道2為“中國(guó)春”-殺配子染色體2C 二體附加系，泳道3為二倍體長(zhǎng)穗偃麥草，泳道4為“中國(guó)春”-長(zhǎng)穗偃麥草IE 二體附加系，泳道5為“中國(guó)春”-長(zhǎng)穗偃麥草2E 二體附加系，泳道6為“中國(guó)春”-長(zhǎng)穗偃麥草3E 二體附加系，泳道7為“中國(guó)春”-長(zhǎng)穗偃麥草4E 二體附加系，泳道8為“中國(guó)春”-長(zhǎng)穗偃麥草5E 二體附加系，泳道9 為“中國(guó)春”-長(zhǎng)穗偃麥草6E 二體附加系，泳道10為“中國(guó)春”-長(zhǎng)穗偃麥草7E 二體附加系(Marker :DL2000)；圖5為SCAR252分子標(biāo)記在“中國(guó)春”-長(zhǎng)穗偃麥草5E 二體附加系與“中國(guó)春”-殺配子染色體2C 二體附加系雜種后代Fp F2中的擴(kuò)增結(jié)果，泳道1為普通小麥-“中國(guó)春”， 泳道2為“中國(guó)春”-殺配子染色體2C 二體附加系，泳道3為二倍體長(zhǎng)穗偃麥草，泳道4 13為“中國(guó)春”-長(zhǎng)穗偃麥草5E 二體附加系與“中國(guó)春”-殺配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的F1代材料，泳道14 M為F1代自交獲得的F2代材料(Marker :DL2000)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種鑒定長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體的TRAP-SCARm2標(biāo)記及其應(yīng)用，通過(guò) TRAP-SCAR法篩選獲得特異性的TRAP片段，并轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，并對(duì)其擴(kuò)增進(jìn)行了檢測(cè)。下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)標(biāo)記的制備、擴(kuò)增和鑒定做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。所涉及的材料來(lái)源
“中國(guó)春”小麥來(lái)源于哈爾濱師范大學(xué)分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2010年4月將材料種于哈爾濱師范大學(xué)分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種重點(diǎn)試驗(yàn)苗圃基地，2個(gè)月后提取DNA進(jìn)行分子標(biāo)記篩選試驗(yàn)。二倍體長(zhǎng)穗偃麥草來(lái)源于日本國(guó)家生物資源計(jì)劃小麥中心(http://WWW. shigen. nig. ac. jp/-wheat/komugi/top. jsp) ,2010年1月將材料種于哈爾濱師范大學(xué)分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種溫室，3個(gè)月后提取DNA，保存?zhèn)溆谩Ｋ谋扼w長(zhǎng)穗偃麥草來(lái)源于中國(guó)農(nóng)科院，2010年1月將材料種于哈爾濱師范大學(xué)分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種溫室，3個(gè)月后提取DNA，保存?zhèn)溆?。“中?guó)春”-殺配子染色體2C 二體附加系來(lái)源于日本國(guó)家生物資源計(jì)劃小麥中心 (http//www. shigen. nig. ac. jp/-wheat/komugi/top. jsp) ,2010 年 4 月將材料種于哈爾濱師范大學(xué)分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種重點(diǎn)試驗(yàn)苗圃基地，2個(gè)月后提取DNA進(jìn)行分子標(biāo)記篩選試驗(yàn)。1、TRAP分子標(biāo)記方法篩選特異性TRAP片段利用TRAP分子標(biāo)記方法，在普通小麥“中國(guó)春”、二倍體長(zhǎng)穗偃麥草、四倍體長(zhǎng)穗偃麥草中進(jìn)行多態(tài)性的篩選，獲得特異性片段。1. 1采用CTAB法從新鮮的不同材料幼嫩葉片中分別提取基因組DNA，并檢測(cè)DNA 濃度及質(zhì)量；1. 2TRAP 片段擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系=DNA 模板 50ng, 10 X PCR buffer 2· 0 μ 1，dNTP Mix (2. 5mM) 1. 5 μ 1， 任意引物(0. 3pmol)ly 1，固定引物(IOpmol) 1 μ l，r Taqpolymerase (5U/μ 1) 0· 2 μ 1，滅菌超純水補(bǔ)足至20 μ 1 ；具體的PCR反應(yīng)程序?yàn)?br> 94 0C 94 0C 35 0C 72 0C
94 0C 50 0C 72 0C 72 0C
3 5 cycles
4 °Cforever該反應(yīng)程序是最開(kāi)始的5個(gè)循環(huán)在前，接著35個(gè)循環(huán)在后。在篩選的過(guò)程中，利用普通小麥“中國(guó)春”、二倍體長(zhǎng)穗偃麥草、四倍體長(zhǎng)穗偃麥草三種材料對(duì)這168個(gè)引物組合進(jìn)行篩選，篩選的依據(jù)是在普通小麥“中國(guó)春”與二倍體長(zhǎng)穗偃麥草、四倍體長(zhǎng)穗偃麥草兩種材料中存在多態(tài)性，同時(shí)二倍體長(zhǎng)穗偃麥草和四倍體長(zhǎng)穗偃麥草兩種材料又有同樣大小的PCR產(chǎn)物，且PCR產(chǎn)物的片段大小要大于500bp，重復(fù)性好， 穩(wěn)定且PCR產(chǎn)物的條帶要清晰。TRAP片段擴(kuò)增的14個(gè)正向引物來(lái)源于張娜(2009)，Li and Klindworth(2006)， 12個(gè)反向引物來(lái)源于張娜Q009)，Li and Quiros Q001)，引物均由上海生工公司合成， 正向引物和反向引物共有168個(gè)引物組合。從中篩選出特異引物對(duì)RGA-IlF ARBI5(SEQ. ID. NO. 1 和 SEQ. ID. NO. 2 所示)。1. 3取擴(kuò)增產(chǎn)物各5 μ 1，均在含有l(wèi)mg/ml EB的1. 2%瓊脂糖中電泳檢測(cè)，在紫外成像系統(tǒng)(Gel Doc-2000, Bio-Rad, USA)下觀察并照相記錄結(jié)果。1. 4構(gòu)建載體并轉(zhuǎn)化將瓊脂糖電泳產(chǎn)物回收并純化，然后將擴(kuò)增的片段連接到pMDlS-T載體(明酶切位點(diǎn)為EcoR LHindIII)上，然后將連接后的載體轉(zhuǎn)染JM109感受態(tài)細(xì)胞，接種于含有氨芐青霉素(50 μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基平板上，0. IM IPTG 4 μ 1禾口 20mg/ml的X_gal 40 μ 1 誘導(dǎo)，37°C培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)；挑取少量白斑菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)將其在含有氨芐青霉素(50 μ g/ml)的LB 固體培養(yǎng)基平板上劃線，擴(kuò)大培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)過(guò)夜；1.5挑去擴(kuò)大培養(yǎng)后的細(xì)菌，提取DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物為通用引物即 RV-M, M13-47 (Kang, 2005)，其擴(kuò)增體系如下94°C預(yù)變性 5min ；94°C變性 30s，50°C退火 30s，72°C延伸 60s，;35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin01. 6將擴(kuò)增的片段進(jìn)行測(cè)序，其核苷酸序列如SEQ. ID No. 3所示，在NCBI中將擴(kuò)增的片段(稱(chēng)為 RGA-IlF ARBI5)進(jìn)行 Blast 搜索，利用 PrimerPremier 5. 0 和 DNAMAN 5.0 等軟件進(jìn)行序列比對(duì)及分析，結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)它與小麥染色體3B特異BAC庫(kù)中的272個(gè)堿基具有88%的同源性，其分析結(jié)果如圖2所示，也可以將該片段稱(chēng)為長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體特異片段。該片段是來(lái)源于長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體的特異片段，它可以篩選含有長(zhǎng)穗偃麥草 E組染色體的后代，該片段要求在小麥遺傳背景下具有低同源性，其優(yōu)勢(shì)在于，它可以更加有效、準(zhǔn)確地篩選小麥遺傳背景下的含有長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體的后代，可以使后代篩選的過(guò)程更加簡(jiǎn)便、易行、可靠。2、將TRAP轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記根據(jù)設(shè)計(jì)SCAR引物的要求(1)引物長(zhǎng)度范圍18_2^ρ，通常是選擇20_2^ρ ；⑵ 退火溫度范圍50 60°C，最好在52 58°C ； (3) GC含量范圍40-55% ； (4)產(chǎn)物片段大小 400 800bp。利用Primer Premier 5. 0和DNAMAN 5. 0等軟件進(jìn)行TRAP片段特異SCAR引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)結(jié)果如下2C-F252 :tggaatgttg gacgaagg (SEQ. ID No. 4 所示)2C-R252 :cgcacgagca ttgttcta (SEQ. ID No. 5 所示)以該引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序分別為PCR 反應(yīng)體系=DNA 模板 30ng, 10 X PCR buffer 2· 0 μ 1，dNTP Mix (2. 5mM) 1. 5 μ 1， 上游引物(10 μ Μ) 1 μ 1，下游引物(10μΜ)1μ l,r Taq polymerase (5U/μ 1) 0· 2 μ 1，滅菌超純水補(bǔ)足至20 μ 1 ；所述的PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，M°C退火30s， 72°C延伸60s，30 35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為252bp，所以將其命名為SCAR252，具體的核苷酸序列如 SEQ. ID No. 6 所示。3、SCAR252分子標(biāo)記驗(yàn)證3. 1長(zhǎng)穗偃麥草特異SCAR252分子標(biāo)記提取普通小麥“中國(guó)春”、“中國(guó)春”-殺配子染色體2C 二體附加系、二倍體長(zhǎng)穗偃麥草、四倍體長(zhǎng)穗偃麥草材料的DNA，以其基因組為模板，采用2C-F252和2C-R252作為引物對(duì)擴(kuò)增，再將其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，進(jìn)行了 SCAR標(biāo)記驗(yàn)證，具體的檢測(cè)結(jié)果如圖3所示在二倍體長(zhǎng)穗偃麥草(泳道幻、四倍體長(zhǎng)穗偃麥草(泳道4)中擴(kuò)增出了 252bp的片段，而在普通小麥“中國(guó)春”(泳道1)、“中國(guó)春”-殺配子染色體2C 二體附加系(泳道2) 中沒(méi)有該目的條帶，初步證明此標(biāo)記可以用于長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體的檢測(cè)。3. 2長(zhǎng)穗偃麥草特異SCAIi252分子標(biāo)記定位利用“中國(guó)春”-長(zhǎng)穗偃麥草IE 7E —套二體附加系對(duì)SCAR252分子標(biāo)記進(jìn)行定位，分別以IE 7E 二體附加系的基因組為模板，采用2C-F252和2C-R252作為引物對(duì)擴(kuò)增，再將其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，進(jìn)行了 SCAR標(biāo)記定位，具體的檢測(cè)結(jié)果如圖4所示其中泳道 3為陽(yáng)性對(duì)照，可以看到該標(biāo)記定位于“中國(guó)春”-長(zhǎng)穗偃麥草5E(泳道8)、“中國(guó)春”-長(zhǎng)穗偃麥草6E (泳道9)兩個(gè)同祖群的染色體上。3. 3長(zhǎng)穗偃麥草特異SCAIi252分子標(biāo)記應(yīng)用進(jìn)一步利用SCARm2分子標(biāo)記對(duì)“中國(guó)春”-殺配子染色體2C 二體附加系與“中國(guó)春”-長(zhǎng)穗偃麥草5E 二體附加系的雜種F1代、F2代進(jìn)行了分析，電泳結(jié)果如圖5所示作為陰性對(duì)照的“中國(guó)春”沒(méi)有擴(kuò)增出目的片段，陽(yáng)性對(duì)照二倍體長(zhǎng)穗偃麥草擴(kuò)增出目的片段，在全部F1代(泳道4 13)以及部分F2代材料中擴(kuò)增出了目的片段，該 SCAR252標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果與材料基因組的特性相吻合，表現(xiàn)出檢測(cè)的特異性；進(jìn)一步證明了此SCAR252標(biāo)記可以用來(lái)檢測(cè)小麥背景下的長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體。因此該SCAR標(biāo)記就可應(yīng)用于小麥遺傳背景下的長(zhǎng)穗偃麥草5E或6E染色體鑒定或跟蹤檢測(cè)以SEQ. ID. NO. 4、SEQ. ID. NO. 5所示的上、下游引物對(duì)待測(cè)基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，對(duì)是否含有長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體進(jìn)行判定若擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果當(dāng)中含有252bp的目標(biāo)片段，則待測(cè)基因組中含有長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體，而且為 5E或6E染色體；若擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果當(dāng)中沒(méi)有252bp的目標(biāo)片段，則待測(cè)基因組中沒(méi)有長(zhǎng)穗偃麥草5E或6E染色體。該SCAR標(biāo)記也為快速鑒定小麥遺傳背景下的長(zhǎng)穗偃麥草5E或6E染色質(zhì)或染色體奠定了良好的基礎(chǔ)，同時(shí)也為分子標(biāo)記輔助育種提供了十分方便快捷的途徑篩選標(biāo)準(zhǔn)即在普通小麥“中國(guó)春”背景下含有長(zhǎng)穗偃麥草5E或6E染色質(zhì)或染色體的后代。
權(quán)利要求
1.一種鑒定長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體的標(biāo)記基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3 或 SEQ. ID. NO. 6 所示。
2.一種擴(kuò)增SEQ. ID. NO. 3所示的標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于，其上、下游引物的核苷酸序列分別如 SEQ. ID. NO. 1、SEQ. ID. NO. 2 所示。
3.一種擴(kuò)增SEQ. ID. NO. 6所示的標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于，其上、下游引物的核苷酸序列分別如 SEQ. ID. NO. 4、SEQ. ID. NO. 5 所示。
4.SEQ. ID. NO. 6所示的序列作為SCAR標(biāo)記應(yīng)用于小麥遺傳背景下的長(zhǎng)穗偃麥草5E或 6E染色體的鑒定或跟蹤檢測(cè)。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于基于長(zhǎng)穗偃麥草5E或6E染色體體系培育小麥品種的分子標(biāo)記輔助育種。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的鑒定或跟蹤檢測(cè)是以SEQ.ID. NO. 4、 SEQ. ID. NO. 5所示的上、下游引物對(duì)待測(cè)基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，對(duì)是否含有長(zhǎng)穗偃麥草5E或6E染色體進(jìn)行判定。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5min ；94°C變性 30s, 54°C退火 30s, 72°C延伸 60s, 30 35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，若擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果當(dāng)中含有252bp的目標(biāo)片段，則待測(cè)基因組中含有長(zhǎng)穗偃麥草5E或6E染色體；若擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果當(dāng)中沒(méi)有 252bp的目標(biāo)片段，則待測(cè)基因組中沒(méi)有長(zhǎng)穗偃麥草5E或6E染色體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒定長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體的TRAP-SCAR252標(biāo)記及其應(yīng)用，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3或SEQ.ID.NO.6所示。通過(guò)TRAP-SCAR法篩選獲得特異性的TRAP片段，并轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，并對(duì)其擴(kuò)增進(jìn)行了檢測(cè)。本發(fā)明提供的長(zhǎng)穗偃麥草E組染色體的標(biāo)記，通過(guò)SCAR標(biāo)記的檢測(cè)，為快速鑒定小麥遺傳背景下的長(zhǎng)穗偃麥草5E或6E染色質(zhì)或染色體奠定了良好的基礎(chǔ)，同時(shí)也為分子標(biāo)記輔助育種提供了十分方便快捷的途徑。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102443640SQ20111040445
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者徐國(guó)輝, 束永俊, 汪慧, 趙迪, 郭東林, 郭長(zhǎng)虹 申請(qǐng)人:哈爾濱師范大學(xué)