專利名稱：Il-21衍生物的制作方法
IL-21衍生物
本發(fā)明是申請?zhí)?00480029663.0、申請日為2004年10月8日的同名申請的分案申請°發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及白介素21(IL_21)或其類似物(包括作為IL-21拮抗劑發(fā)揮作用的 IL-21變體)的衍生物的合成和純化。
發(fā)明背景
IL-21在例如WO 00/53761中被描述成T細(xì)胞生長和NK活性的刺激物。以前沒有描述過IL-21的衍生物。其作為具有改良特征的有效制藥學(xué)衍生物，在許多應(yīng)用中引起關(guān)注。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了 IL-21或其變體的衍生物。
—方面，本發(fā)明提供了包含聚合分子或親脂性衍生物的IL-21或其變體的衍生物。
在本發(fā)明的一個方面，IL-21或其變體的衍生物所包含的聚合分子是一個或多個 PEG基團(tuán)。
在本發(fā)明的一個方面，IL-21或其變體的衍生物在分子的N末端、C末端、或內(nèi)部包含衍生化。
在本發(fā)明的一個方面，衍生化位于IL-21序列中天然存在的氨基酸和/或添加入或替代入的氨基酸。
本發(fā)明提供了特定變體、表達(dá)該特定變體的分離DNA、以及與聚合分子進(jìn)行衍生化作用的用途。本發(fā)明還提供了 IL-21或其變體的衍生物用于制造治療癌癥或感染性疾病的藥物的用途。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了 IL-21肽的多種衍生物，包括包含IL-21肽或其變體的經(jīng)過化學(xué)修飾的肽。根據(jù)衍生用分子的特征，化學(xué)修飾可能改變分子的化學(xué)和生物學(xué)特征。修飾的后果可能是肽的生物學(xué)功能得到保持，或者肽的活性可能有所降低。例如，衍生化作用可能延長衍生化肽在體內(nèi)的功能半衰期，從而補(bǔ)償活性的降低。例如，可以通過將IL-21肽或其類似物與親水性部分(moiety)偶聯(lián)產(chǎn)生保持生物學(xué)活性的IL-21衍生物來實(shí)現(xiàn)IL-21衍生物的持久作用特性。衍生化作用可以提供例如半衰期延長的肽以便于持續(xù)維持治療有效量的 IL-21或其具有相同生物學(xué)作用的衍生物。由此可以減少施用有效量的持久肽所需要的數(shù)量。衍生化可以保護(hù)分子免于酶的降解和由體內(nèi)清除出去。衍生化優(yōu)選是非免疫原性的。 在本發(fā)明的一個方面，可以修改肽的溶解性。
IL-21 活性的定義見 Parrish-Novak, 2000, Nature 408 :57-63 ；Brady, J.、 Hayakawa,Y.、Smyth,M. J.、禾口Nutt,S.L. ,2004,IL_21induces the functional maturation of murine NK cells, Journal of immunology (巴爾的摩，馬里蘭)172 :2048-2058 ；Collins, Μ. 、ffhitters, Μ. J.、禾口 Young, D. Α. ,2003, IL—21 and IL—21 receptor :a new cytokine pathway modulates innate and adaptive immunity, Immunol. Res. 28 131-140 ；Habib, Τ. 、Nelson, Α.、禾口 Kaushansky，K. ，2003， IL—21 :a novel IL-2-family lymphokine that modulates B, T, and natural killer cell responses, J. Allergy Clin.Immunol. 112 1033-1045 ；Sivakumar, P.V. ,2004, Interleukin-21 is a T-helper cytokine that regulates humoral immunity and cell—mediated anti-tumour responses, Immunology 112 177 ；Wang, G.、Tschoi, M.、Spolski, R.、Lou, Y.、Ozaki, K.、Feng, C.、Kim, G.、Leonard, W. J.、禾口 Hwu, P. , 2003, In vivo antitumor activity of interleukin 21 mediated by natural killer cells, Cancer Res. 63 :9016-9022 ；以及 Wang, G.,2003, In vivo antitumor activity of interleukin 21 mediated by natural killer cells. Cancer Res 63 :9016。認(rèn)為IL-21及其衍生物可用于治療腫瘤性疾病。腫瘤性疾病或癌應(yīng)當(dāng)理解為指所有形式的贅生性細(xì)胞生長，包括囊性瘤和實(shí)體瘤，骨和軟組織腫瘤，包括良性和惡性兩種性質(zhì)的腫瘤，包括肛門組織、膽管、膀胱、血細(xì)胞、骨、骨(繼發(fā))、 腸(結(jié)腸和直腸)、腦、腦(繼發(fā))、乳房、乳房(繼發(fā))、類癌瘤、子宮頸、兒童癌、眼、食道(食管)、頭和頸、卡波西肉瘤、腎、喉、(急性成淋巴細(xì)胞性)白血病、(急性髓細(xì)胞樣)白血病、 (慢性淋巴細(xì)胞性)白血病、(慢性髓細(xì)胞樣)白血病、(其它)白血病、肝、肝(繼發(fā))、肺、 肺(繼發(fā))、淋巴結(jié)(繼發(fā))、(何杰金氏)淋巴瘤、(非何杰金氏)淋巴瘤、黑素瘤、間皮瘤、 骨髓瘤、卵巢、胰腺、陰莖、前列腺、皮膚、軟組織肉瘤、胃、睪丸、甲狀腺、未知原發(fā)性腫瘤、陰道、外陰、子宮中的腫瘤。軟組織腫瘤包括良性單體性許旺氏細(xì)胞瘤(Benign Schwannoma Monosomy)、硬纖維瘤、成脂細(xì)胞瘤、脂肪瘤、子宮平滑肌瘤、明細(xì)胞肉瘤、皮膚纖維肉瘤、尤因肉瘤、骨骼外粘液樣軟骨肉瘤、粘液樣脂肪肉瘤、分化良好的脂肪肉瘤、小泡型橫紋肌肉瘤、和滑膜肉瘤。具體的骨腫瘤包括非骨化性纖維瘤、單房性骨囊腫、內(nèi)生軟骨瘤、動脈瘤樣骨囊腫、成骨細(xì)胞瘤、成軟骨細(xì)胞瘤、軟骨粘液纖維瘤、骨化性纖維瘤和釉質(zhì)瘤、巨細(xì)胞瘤、 纖維性結(jié)構(gòu)不良、尤因肉瘤、嗜曙紅細(xì)胞肉芽腫、骨肉瘤、軟骨瘤、軟骨肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、和轉(zhuǎn)移癌。白血病指由骨髓生成的白細(xì)胞的癌，包括但不限于白血病的四種主要類型急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、急性成髓細(xì)胞性白血病(AML)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、和慢性髓細(xì)胞樣白血病(CML)。
在討論本發(fā)明的詳細(xì)實(shí)施方案之前，提供與本發(fā)明主要方面有關(guān)的具體術(shù)語的定義。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，“IL-21”定義為WO 00/53761中作為SEQ ID No :2公布的序列或該序列的不含N端序列的序列。本申請還描述了 IL-21的變體和衍生物。在本發(fā)明的內(nèi)容中，術(shù)語“IL-21”由此指WO 00/53761中描述的IL-21，任選不含N端序列。本發(fā)明涵蓋來自其它物種的相應(yīng)蛋白質(zhì)(“直向同源物(ortholog) ”)。特別感興趣的是來自其它哺乳動物物種的IL-21多肽，包括嚙齒類、豬、羊、牛、狗、貓、馬、和其它靈長類。
"IL-21衍生物”包括衍生化或與另一種功能分子相連接。連接可以是與其它分子實(shí)體(諸如抗體、毒素、放射性同位素、毒害細(xì)胞的或抑制細(xì)胞的試劑、或聚合分子或親水性基團(tuán))化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價相連、諸如此類。非限制性實(shí)例包括聚合基團(tuán)，諸如例如PCT/DK2004/000531中公布的樹狀分子(dendrimer)、聚環(huán)氧烷(PAO)、聚烷撐二醇 (PAG)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯共馬來酸酐、聚苯乙烯共馬來酸酐、葡聚糖、羧甲基葡聚糖；血清蛋白質(zhì)結(jié)合配體，諸如與清蛋白結(jié)合的化合物，像脂肪酸，(5-(^4脂肪酸，脂肪族二酸，(例如C5-C24)。清蛋白結(jié)合物見丹麥專利申請PCT/DK04/000625。清蛋白結(jié)合物也可以是具有如下化學(xué)式的化合物
權(quán)利要求
1.IL-21衍生物或其變體，其在N-末端，C-末端包含氨基酸修飾，或者在hIL-21肽內(nèi)連接有親脂性取代基，其中所述變體與hIL-21肽具有70%以上的同一性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基是在其側(cè)鏈帶有用于衍生化的功能基團(tuán)的氨基酸，其中的氨基酸選自Asp，Glu，Cys, Gin, Ser, Thr和Tyr。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的IL-21衍生物，其中的修飾在賴氨酸殘基上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的IL-21衍生物，其中的賴氨酸殘基選自Lys22，Lys53,Lys57, Lys78, Lys89, Lysl02, Lysl03, Lysl06, Lysll3 禾口 Lysll8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中親脂性取代基在水中的溶解度為 20°C下，0. lmg/100ml-250mg/100ml 水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基包含4-40碳原子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基通過間隔物與 hIL-21肽連接。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的IL-21衍生物，其中的間隔物選自Lys，Glu,Asp, β -丙氨酸， Y-丁酸(GABA)，Y-谷氨酸和丁二酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的IL-21衍生物，其中的間隔物選自Lys，Glu和Asp，且間隔物的羧基與氨基酸殘基的氨基形成酰胺鍵，且間隔物的氨基與親脂性取代基的羧基形成酰胺鍵。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的IL-21衍生物，其中的間隔物是包含Asp,Glu，或Lys的二肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基是直鏈或者分支燒基。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基是直鏈或分支脂肪酸的酰基。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的IL-21衍生物，其中親脂性取代基的酰基是CH(CH2)nCO-,其中 η是4-38的整數(shù)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基的?；x自CH3(CH2)6CO-, CH3 (CH2)8CO-, CHjCH2)1(lC0-，CH3(CH2)12CO-, CH3(CH2)14CO-, CH3 ^H2) ^⑶-，CH3(CH2)wCO-, CH3 (CH2) 20CO-，和 CH3 (CH2) ^CO-。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基是直鏈或直鏈烷烴α，ω-二羧酸的?；?br> 16.根據(jù)權(quán)利要求15的IL-21衍生物，其中的acyl基是HOOC(CH2)mCO-,其中的m是 4-38的整數(shù)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的IL-21衍生物，其中的acyl基選自HOOC(CH2)14CO-, HOOC (CH2) 16C0-, HOOC (CH2) 18C0-, HOOC (CH2) 20CO-,和 HOOC (CH2) ^⑶-。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基是下述式的基團(tuán)CH3 (CH2)p ((CH2) qC00H) CHNH-CO (CH2) 2C0_，其中的 ρ 和 q 是整數(shù)，而且 p+q 是 8_40 的整數(shù)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基是下述式的基團(tuán)=CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH) (CH2)2C0_，其中的 r 是 10-24 的整數(shù)。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基是下述式的基團(tuán)CH3 (CH2) sC0-NHCH ((CH2) 2 (COOH) 2C0_，其中 s 是 8- 的整數(shù)。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基是下述式的基團(tuán):C00H(CH2)tCO-,其中的t是8-24的整數(shù)。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基是下述式的基團(tuán)-NHCH(COOH) (CH2)4NH-CO (CH2)uCH-,其中的 u 是 8-18 的整數(shù)。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基是下述式的基團(tuán)-NHCH(C00H) (CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)wCH3-,其中 w 是 10-16 的整數(shù)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基是下述式的基團(tuán)-NHCH(C00H) (CH2)4NH-CO(CH2)2OKCOOH)NH-CO(CH2)xCH3-,其中 χ 是 10-16 的整數(shù)。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基是下述式的基團(tuán)-NHCH(COOH) (CH2)4NH-CO(CH2)2OKcOOH)NH-CO(CH2)yCH3-,其中 y 是 1-22 的整數(shù)。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基是N-石膽?；?。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中的親脂性取代基是N-膽?；?。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)的IL-21衍生物，其中所述的衍生物具有高達(dá)4個親脂性取代基。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀的IL-21衍生物，其中所述的衍生物具有3個親脂性取代基。
30.根據(jù)權(quán)利要求四的IL-21衍生物，其中所述的衍生物具有2個親脂性取代基。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的IL-21衍生物，其中所述的衍生物具有1個親脂性取代基。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)的IL-21衍生物在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
33.根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)的IL-21衍生物在治療癌癥中的用途。
34.表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求7的IL-21衍生物的分離的DNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了IL-21或其變體的衍生物。
文檔編號C12P21/02GK102516386SQ20111040268
公開日2012年6月27日 申請日期2004年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月10日
發(fā)明者A·沃索, B·派施克, C·B·肖德特, F·Z·多沃爾德, H·沃爾迪克 申請人:諾沃挪第克公司