專利名稱：一種促進(jìn)大花杓蘭種子共生萌發(fā)的真菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)大花杓蘭種子共生萌發(fā)的真菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自然條件下，蘭科植物種子的萌發(fā)都必需與適宜的真菌共生才能實(shí)現(xiàn)，常規(guī)播種不能萌發(fā)，分株繁殖的效率又太低。隨著實(shí)驗(yàn)室條件下種子非共生無菌萌發(fā)方法誕生和不斷發(fā)展完善，幾十年來極大地促進(jìn)了蘭花人工繁殖和蘭花產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。目前幾乎所有的附生蘭和部分地生蘭的種子繁殖都是采用成熟或未成熟的種子通過無菌培養(yǎng)萌發(fā)而來。 盡管無菌條件下的非共生萌發(fā)有其自身的優(yōu)點(diǎn)，同時也有它的局限性，以杓蘭屬植物為代表的許多溫帶地生蘭類群的種子在無菌培養(yǎng)基中萌發(fā)困難。大花杓蘭只有在種子發(fā)育途中一個極短的發(fā)育階段才可能在非共生培養(yǎng)基中萌發(fā)，而且萌發(fā)率不高，未成熟種子不耐儲藏，采集后必須即時播種，否則種子將失去活性。諸多限制因子導(dǎo)致大花杓蘭的批量繁殖難以實(shí)現(xiàn)，至今沒有人工繁殖的植株來滿足巨大的國內(nèi)國際市場的需求，野生植株的過度采集導(dǎo)致資源枯竭。在生物多樣性保護(hù)和瀕危物種種質(zhì)資源保存研究中，種子的長期保存是研究的主流和熱點(diǎn)之一。蘭科植物種子極其微小，長度不足1mm，相比其他植物更具有種子保存的優(yōu)勢，可以在同樣的空間和資金條件下保存更多的種類。利用特定真菌共生萌發(fā)的方式可以突破大花杓蘭成熟種子非共生方式不能萌發(fā)的瓶頸。另一方面，大花杓蘭單個果莢內(nèi)種子數(shù)量多，通過種子播種繁殖是提高繁殖效率的最佳途徑，人工繁育的植株可以進(jìn)入國際園藝市場，幫助減輕野外采集壓力，創(chuàng)造良好的社會和經(jīng)濟(jì)效益。因此了解大花杓蘭與真菌間的共生關(guān)系，篩選出有益共生菌株，對其保育研究和生產(chǎn)繁殖都具有極其重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)大花杓蘭種子共生萌發(fā)的真菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的菌株Cm-J-R-2，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為擔(dān)子菌亞門膠膜菌科的瘤菌根菌屬(Epulorhiza sp.)，已于2011年10月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. M07。本發(fā)明還保護(hù)所述菌株Cm-J-R-2在促進(jìn)大花杓蘭種子萌發(fā)中的應(yīng)用。所述應(yīng)用的具體方法如下將所述菌株Cm-J-R-2與大花杓蘭種子共培養(yǎng)。所述共培養(yǎng)具體可在燕麥培養(yǎng)基上進(jìn)行。燕麥培養(yǎng)基的具體制備方法如下將2. 5g燕麥片加入IOOOml蒸餾水中，煮沸30 分鐘，紗布過濾冷卻后用蒸餾水定容至IOOOml，加入8g瓊脂，調(diào)節(jié)pH值至6. 0，加熱攪拌至
瓊脂溶解。菌株Cm-J-R-2可以促使大花杓蘭種子萌發(fā)，平均萌發(fā)率為29.34%。本發(fā)明對于大花杓蘭的繁育具有重大價值。


圖1為菌株Cm-J-R-2的形態(tài)。圖2為念珠狀細(xì)胞的微觀特征。圖3為種子共生萌發(fā)出的原球莖；A 培養(yǎng)皿中共生萌發(fā)出的原球莖；B =A圖的局部放大圖。圖4為種子共生萌發(fā)出的原球莖(體式顯微鏡)；A 空白對照組中的種子(未萌發(fā))；B 種子與真菌共生萌發(fā)出的原球莖；C和D =B圖的局部放大圖。圖5為大花杓蘭種子與真菌共生的萌發(fā)率。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。大花杓蘭(Cypripedium macranthos)公眾可以從北京市植物園獲得；參考文獻(xiàn)張毓，趙世偉，張啟翔，等.北京地區(qū)大花杓蘭資源調(diào)查與生物學(xué)特性研究.2005中國觀賞園藝研究進(jìn)展[C].北京中國林業(yè)出版社.2005 :92-95.。實(shí)施例1、菌株Cm-J-R-2的獲得一、試驗(yàn)材料采集從吉林長白山的自然種群中采集大花杓蘭新鮮根系(盡量選擇植株的新鮮幼根)，用無菌的刀片和鑷子截取根段，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。 二、大花杓蘭根內(nèi)真菌的分離采用切片法分離大花杓蘭根內(nèi)真菌，具體步驟如下1、將根段樣品洗凈，用流水沖洗30分鐘，切成5mm的小段，放入75%酒精中15s， 然后無菌水沖洗1次；2、將菌根轉(zhuǎn)入1. 5%氯化汞中^iin，再用無菌水沖洗4次；3、將根段蘸0. lg/L氯霉素后，插入PDA平板培養(yǎng)基中，25°C恒溫箱中避光培養(yǎng)。4、分離到的真菌分別轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，不斷重復(fù)，直至沒有任何雜菌污染，即移入PDA斜面培養(yǎng)基中保存，具體步驟如下(1)定期觀察PDA平板，待真菌生長至肉眼可見的菌落后，分別記錄PDA平板培養(yǎng)基上的菌落數(shù)及種類；(2)分別從各菌落頂端截取菌絲轉(zhuǎn)移到新的PDA平板培養(yǎng)基上，繼續(xù)放入恒溫箱中進(jìn)行避光培養(yǎng)；(3)不斷重復(fù)上述兩個步驟，直至無任何雜菌污染；(4)將純化后的菌轉(zhuǎn)移到PDA斜面培養(yǎng)基上，放入4°C冰箱內(nèi)保存，備用。將分離到的一株菌命名為菌株Cm-J-R-2。三、菌株Cm-J-R-2的鑒定1、分子鑒定
(1)采用 Tianen，China 公司的 the TIANamp DNAsecure Plant Kit 試劑盒，提取菌株的基因組DNA。(2)以基因組DNA為模板，采用ITS1/ITS4和ITS4/ITS5引物在熱循環(huán)儀上PCR擴(kuò)增核糖體ITS特定DNA片段。(3)采用鼎國公司(Dingguo，Beijing, China)的DNA片段快速純化試劑盒 (Purification/Recover Kit)進(jìn)行純化后，用BigDye循環(huán)測序試劑盒，結(jié)合ABI 3730自動 iiJi^ft (Applied Biosystems, Foster City, CA) iij·。測序結(jié)果如序列表的序列1所示。將測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST (http // www, ncbi. nlm. nih. gov/blast)，與 GENBANK ACCESSION NO. GQ241745. 1 的相似性最高，為 99%。2、形態(tài)鑒定菌株形態(tài)見圖1。菌落乳白色，菌絲不發(fā)達(dá)，有蠟質(zhì)感，生長緩慢，培養(yǎng)過程中菌絲會形成球形或近球形的念珠狀細(xì)胞。念珠狀細(xì)胞的微觀特征見圖2。根據(jù)分子序列特征和菌落宏微觀特征，本發(fā)明鑒定菌株Cm-J-R-2為擔(dān)子菌亞門膠膜菌科無性型真菌瘤菌根菌屬(Epulorhiza)的成員。菌株Cm-J-R-2已于2011年10月觀日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 5407。實(shí)施例2、應(yīng)用菌株Cm-J-R-2促進(jìn)大花杓蘭種子萌發(fā)濾紙選用Whatman公司生產(chǎn)的濾紙(直徑為60mm ；Cat No. 1004090)，將圓形濾紙對切成兩個半圓，高壓滅菌備用。燕麥培養(yǎng)基稱取2. 5g燕麥片，加1000ml蒸餾水，加熱煮沸30分鐘，紗布過濾冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，加入8g瓊脂，調(diào)節(jié)pH值至6. 0，加熱攪拌至瓊脂溶解，分裝滅
菌備用。一、接種大花杓蘭種子1、大花杓蘭種子的滅菌將自然成熟脫落的大花杓蘭種子進(jìn)行如下滅菌用質(zhì)量百分含量為0.8% (0. 5-1. 0%均可)的次氯酸鈉水溶液滅菌7分鐘(5-8分鐘均可)。2、在裝有固體燕麥培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中平鋪兩張等大的半圓型無菌濾紙(兩張濾紙中間具有間隔區(qū)域)。3、在無菌條件下，將滅菌后的大花杓蘭種子接種于步驟2的濾紙上(每個半圓形濾紙約100粒，25°C暗培養(yǎng)2周(培養(yǎng)過程中需要確保沒有雜菌污染)。二、回接菌株 Cm-J-R-21、將菌株Cm-J-R-2劃線接種于PDA固體培養(yǎng)基，25°C暗培養(yǎng)M小時。2、將1塊5mm*5mm大小的Cm-J-R-2菌塊(從步驟1的培養(yǎng)基中取得菌塊)接種于步驟一的培養(yǎng)皿的正中處，繼續(xù)25°C暗培養(yǎng)。設(shè)置不加入上述菌塊的平行處理，作為空白對照(CK)。三、種子萌發(fā)情況的觀察接種菌塊后每周觀察一次萌發(fā)情況，約2個月后，觀察到種子開始萌發(fā)，白色的原球莖突破種皮逐漸長大。自接種菌塊開始計(jì)天數(shù)，第70天的照片見圖3。在體式顯微鏡下觀察，可見白色胚體已經(jīng)完全脫離種皮形成原球莖，并且原球莖膨大，逐漸延長，即將開始根的分化。自接種菌塊開始計(jì)天數(shù)，第70天的照片見圖4。圖4A 為空白對照組的照片，種子未萌發(fā)。圖4B為實(shí)驗(yàn)組的照片，圖4C和圖4D為圖;3B的局部放大圖，新萌出的原球莖表面密布細(xì)長的真菌菌絲，有的表面菌絲較少(圖4C)，有的表面菌絲密度更大(圖4D)。形成原球莖的大花杓蘭種子即為萌發(fā)的種子，自接種菌塊開始計(jì)天數(shù)，第70天統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和空白對照組的萌發(fā)率。進(jìn)行四次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果見表1和圖5。表1大花杓蘭種子與真菌共生的萌發(fā)率
權(quán)利要求
1.菌株(Epulorhizasp.) Cm-J-R-2，它的保藏編號為 CGMCC No. 5407。
2.保藏編號為CGMCCNo. 5407的菌株Cm-J-R-2在促進(jìn)大花杓蘭種子萌發(fā)中的應(yīng)用,
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進(jìn)大花杓蘭種子萌發(fā)的真菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的菌株為菌株Cm-J-R-2，它的保藏編號為CGMCC No.5407。菌株Cm-J-R-2能很好的促進(jìn)大花杓蘭種子萌發(fā)。本發(fā)明對于大花杓蘭的繁育具有重大價值。
文檔編號C12N1/14GK102492628SQ20111040237
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者張毓, 趙世偉 申請人:北京市植物園