專利名稱：鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的pcr引物對(duì)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對(duì)及其應(yīng)用，特別涉及可以鑒定或輔助鑒定貓、牛、羊、豬、雞這五種動(dòng)物中至少一種動(dòng)物的組織和/或器官的 PCR引物對(duì)。
背景技術(shù)：
目前在國(guó)內(nèi)生肉和肉制品的生產(chǎn)和銷售領(lǐng)域，一些不法商販為了牟取暴利，利用摻雜摻假等手段欺騙消費(fèi)者的事件時(shí)有發(fā)生，比如用貓肉冒充豬肉、牛肉和羊肉等。因此一套快速、準(zhǔn)確鑒別肉種類，并且能夠適應(yīng)混合肉制品鑒定的方法，無(wú)疑會(huì)為執(zhí)法人員提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐。傳統(tǒng)的肉制品鑒定的方法主要是基于蛋白質(zhì)水平的分析，包括電泳法、免疫法、 ELISA等技術(shù)。操作過(guò)程中首先需制備相應(yīng)物種的抗體，然后抗原和抗體間進(jìn)行免疫反應(yīng)， 最后通過(guò)電泳或者顯色等方法進(jìn)行鑒別。這類鑒別技術(shù)受蛋白質(zhì)(主要起作用的部分為抗原決定簇)結(jié)構(gòu)的影響很大，實(shí)際應(yīng)用中經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題包括1.熱加工過(guò)程會(huì)改變蛋白質(zhì)(抗原決定簇)的結(jié)構(gòu)，因而無(wú)法檢測(cè)熱加工的肉類；2.對(duì)混合肉類的檢測(cè)可能出現(xiàn)交叉反應(yīng)，因?yàn)椴煌锓N蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可能具有某種程度的相似性，檢驗(yàn)的靈敏程度取決于制備的抗體的特異性強(qiáng)弱?；谝陨显?，以核酸為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法成為近幾年食品檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展方向， 包括DNA分子雜交法和PCR方法等。DNA分子雜交法操作復(fù)雜，且成本較高，目前以逐漸被 PCR方法所取代。PCR方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，可對(duì)混合肉類進(jìn)行鑒別和區(qū)分，即使摻雜少量異種肉，也能用PCR方法加以鑒別；PCR方法可用于熱加工的肉制品鑒別當(dāng)中，高溫過(guò)程僅僅打斷了核酸的片斷，并不會(huì)完全降解核酸，因而熱加工的肉制品當(dāng)中仍然存在可擴(kuò)增的模板，這在飼料工業(yè)肉骨粉來(lái)源的鑒別過(guò)程中得到了很好的證實(shí)；PCR反應(yīng)的迅速，結(jié)果易于觀測(cè)，使得這種檢測(cè)方法目前廣泛應(yīng)用在飼料、保健品的動(dòng)物源性成分的鑒別當(dāng)中。PCR技術(shù)中，引物設(shè)計(jì)是PCR成功的關(guān)鍵因素，好的引物將使檢測(cè)實(shí)驗(yàn)更加快捷， 結(jié)果更加清晰。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對(duì)或引物對(duì)組合物，以及利用所述引物對(duì)或引物對(duì)組合物鑒定待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中是否含有或候選含有貓、豬、牛、羊、雞這五種動(dòng)物中至少一種動(dòng)物的組織和/或器官的方法。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對(duì)既可為鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)，也可為在含有鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)的前提下，再含有鑒定或輔助鑒定貓、豬、牛、羊、雞組織和/或器官的5個(gè) PCR引物對(duì)中其余四個(gè)引物對(duì)中的全部、或任意三對(duì)、或任意兩對(duì)、或任一對(duì)形成的引物對(duì)組合物。具體分為如下五種
1、鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對(duì)組合物，由獨(dú)立包裝的五個(gè)引物對(duì)組成，第一對(duì)引物是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)，第二對(duì)引物是由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對(duì)，第三對(duì)引物是由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的 PCR引物對(duì)，第四對(duì)引物是由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對(duì)，第五對(duì)引物是由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對(duì)；所述動(dòng)物為貓、豬、 牛、羊、雞中的至少一種。2、鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對(duì)組合物，由獨(dú)立包裝的四個(gè)引物對(duì)組成，其中一個(gè)引物對(duì)是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)，另外三個(gè)引物對(duì)為下述四個(gè)引物對(duì)中的任三個(gè)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/ 或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對(duì)；所述動(dòng)物為貓、豬、 牛、羊、雞中的至少一種。3、鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對(duì)組合物，由獨(dú)立包裝的三個(gè)引物對(duì)組成，其中一個(gè)引物對(duì)是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)，另外兩個(gè)引物對(duì)為下述四個(gè)引物對(duì)中的任兩個(gè)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/ 或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對(duì)；所述動(dòng)物為貓、豬、 牛、羊、雞中的至少一種。4、鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對(duì)組合物，由獨(dú)立包裝的兩個(gè)引物對(duì)組成，其中一個(gè)引物對(duì)是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)，另外一個(gè)引物對(duì)為下述四個(gè)引物對(duì)中的任一個(gè)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/ 或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對(duì)；所述動(dòng)物為貓、豬、 牛、羊、雞中的至少一種。上述1中所述五個(gè)引物對(duì)在PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為1 1 1 1 1;上述2中所述四個(gè)引物對(duì)在PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為1 :1:1: 1;上述3中所述三個(gè)引物對(duì)在PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為1 1 1 ；上述4中所述兩個(gè)引物對(duì)在PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為1 1。5、鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)，由兩條單鏈DNA組成，所述兩條DNA單鏈分別為序列表中序列1所示的單鏈DNA，和序列表中序列2所示的單鏈DNA。其中，序列表中的序列1由21個(gè)核苷酸組成，序列表中的序列2由18個(gè)核苷酸組成，序列表中的序列3由M個(gè)核苷酸組成，序列4由沈個(gè)核苷酸組成，序列5由M個(gè)核苷酸組成，序列6由22個(gè)核苷酸組成，序列7由22個(gè)核苷酸組成，序列8由觀個(gè)核苷酸組成， 序列9由22個(gè)核苷酸組成，序列10由22個(gè)核苷酸組成。上述動(dòng)物組織和/或器官可來(lái)源于貓、豬、牛、羊、雞這五種動(dòng)物中任一種動(dòng)物組織和/或器官，也可以來(lái)源于貓、豬、牛、羊、雞這五種動(dòng)物中的任兩種、任三種、任四種或五種動(dòng)物的混合組織和/或器官。含有上述引物對(duì)組合物，或單獨(dú)的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。為了提高上述試劑盒的準(zhǔn)確性，所述試劑盒除含有上述引物對(duì)組合物或單獨(dú)的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)外，還含有限制性內(nèi)切酶，所述限制性內(nèi)切酶為EcoR I和/或Hind III ；所述動(dòng)物為貓、豬、牛、羊、雞中的至少一種。由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和 /或器官的PCR引物對(duì)，可PCR擴(kuò)增獲得貓肉線粒體16S rRNA基因的基因片段(如序列表中序列11所示)，該基因片段共有367個(gè)核苷酸，其中前21位和后18位分別為序列表中序列1和序列2所示上下游引物，第130-135位是Hind III的識(shí)別序列。由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和 /或器官的PCR引物對(duì)，可PCR擴(kuò)增獲得豬肉線粒體腺苷三磷酸酶VI亞基和VIII亞基基因的基因片段(如序列表中序列12所示)，該基因片段共有611個(gè)核苷酸，其中前M位和后沈位分別為序列表中序列3和序列4所示上下游引物，第133-138位是Hind III的識(shí)別序列。由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和 /或器官的PCR引物對(duì)，可PCR擴(kuò)增獲得牛肉線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶II亞基基因的基因片段(如序列表中序列13所示)，該基因片段共有494個(gè)核苷酸，其中前M位和后22 位分別為序列表中序列5和序列6所示上下游引物，第沈3-268位是Hind III的識(shí)別序列。由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和 /或器官的PCR引物對(duì)，可PCR擴(kuò)增獲得羊肉線粒體DNA細(xì)胞色素B基因的基因片段(如序列表中序列14所示)，該基因片段共有716個(gè)核苷酸，其中前22位和后觀位分別為序列表中序列7和序列8所示上下游引物，第253-258位是EcoR I的識(shí)別序列。由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對(duì)，可PCR擴(kuò)增獲得雞肉線粒體DNA腺苷三磷酸合成酶VI亞基和 VIII亞基基因的基因片段(如序列表中序列15所示)，該基因片段共有259個(gè)核苷酸，其中前22位和后22位分別為序列表中序列9和序列10所示上下游引物，第97-102位是Hind III的識(shí)別序列。本發(fā)明所提供的引物對(duì)組合物或引物對(duì)的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該制備方法具體可包括將所述引物對(duì)組合物或引物對(duì)中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。上述鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該制備方法具體可包括如下步驟上述引物對(duì)組合物或引物對(duì)中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)包裝在同一試劑盒內(nèi)PCR 反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP (dATP，dTTP，dCTP和dGTP)和限制性內(nèi)切酶，所述限制性內(nèi)切酶為Hind III和/或EcoR I。所述動(dòng)物為貓、豬、牛、羊、雞中至少一種。利用所述引物對(duì)組合物或引物對(duì)，或所述PCR試劑盒鑒定或輔助鑒定待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中是否含有或候選含有貓、豬、牛、羊、雞這五種動(dòng)物中至少一種動(dòng)物組織和/ 或器官的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，利用所述引物對(duì)組合物或引物對(duì)，鑒定或輔助鑒定待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中是否含有或候選含有貓、豬、牛、羊、雞這五種動(dòng)物中至少一種動(dòng)物組織和/或器官的方法包括下述1)和2、的步驟1)在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用上述四種引物對(duì)組合物中的任一種組合物，或單獨(dú)鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2)檢測(cè)步驟1)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有哪種或哪些動(dòng)物組織和/或器官如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是330-380bp，如367bp的DNA片段，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有貓組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是580-640bp，如61 Ibp的DNA 片段，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是460-520bp，如494bp的DNA片段，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是690-750bp，如716bp的DNA 片段，所述的DNA片段待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是230-270bp，如259bp的DNA片段，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官。所述檢測(cè)所得到的PCR產(chǎn)物大小的方法是將所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示330-380bp之間的一條帶，如367bp，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有貓組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示580-640bp之間的一條帶，如611bp，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示460-520bp之間的一條帶，如494bp，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官； 如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示690-750bp之間的一條帶，如716bp，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示230-270bp之間的一條帶，如259bp，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官。所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官來(lái)源于下述動(dòng)物中的至少一種貓、豬、牛、羊、雞。利用所述PCR試劑盒鑒定或輔助鑒定待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中是否含有或候選含有貓、豬、牛、羊、雞這五種動(dòng)物中至少一種動(dòng)物組織和/或器官的方法，包括下述a)_c) 的步驟
a)在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用所述試劑盒中的引物對(duì)組合物或引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；b)檢測(cè)步驟a)得到的PCR產(chǎn)物的大小，根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測(cè)動(dòng)物組織和/ 或器官中含有或候選含有哪種或哪些動(dòng)物組織和/或器官的方法同上；c)對(duì)經(jīng)步驟b)檢測(cè)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，所述酶切鑒定的步驟及確定所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有哪種或哪些動(dòng)物組織和/或器官的方法為下述 cl)-c5)中的至少一種cl)將所述大小是330-380bp，如367bp的DNA片段用Hind III進(jìn)行酶切鑒定，如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被Hind III酶切為100_150bp和200_250bp的兩個(gè)片段，如132bp 和23^p，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有貓組織和/或器官；c2)將所述大小是580-640bp，如6Ilbp的DNA片段用Hind III進(jìn)行酶切鑒定，如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被Hind III酶切為100_200bp和450_550bp的兩個(gè)片段，如
和476bp，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；c3)將所述大小為460-520bp，如494bp的DNA片段用Hind III進(jìn)行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被Hind III酶切為200-300bp的兩個(gè)片段，如^^p和229bp， 所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官；c4)將所述大小為690_750bp，如716bp的DNA片段用EcoR I進(jìn)行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被EcoR I酶切為200-300bp和400-500bp的兩個(gè)片段，如 255bp和461bp，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；c5)將所述大小為230-270bp，如259bp的DNA片段用Hind III進(jìn)行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被Hind III酶切為50_100bp和150_200bp的兩個(gè)片段，如 99bp和160bp，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官；所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官來(lái)源于下述動(dòng)物中的至少一種貓、豬、牛、羊、雞。所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官具體可為結(jié)締組織(如血液)、肌肉組織。本發(fā)明的貓、豬、牛、羊、雞特異性引物，均選用了 62°C的退火溫度，實(shí)現(xiàn)了在同一溫度一次PCR完成所有鑒別。同時(shí)，PCR產(chǎn)物的酶切鑒定，進(jìn)一步增強(qiáng)了檢測(cè)的精確度。本發(fā)明的檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，能鑒別摻雜貓、豬、牛、羊和/或雞的組織和/或器官。整個(gè)結(jié)果清晰、可信度高。本發(fā)明的方法檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)短，從提取基因組到酶切結(jié)束，最短僅需要8 小時(shí)的時(shí)間(樣品數(shù)量多時(shí)酌情延長(zhǎng))。


圖1為家貓、民豬、黃牛、山羊、土雞5種肉類基因組的提取結(jié)果。其中，泳道M為 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000，泳道1為家貓的基因組，泳道2為民豬的基因組，泳道3為黃牛的基因組，泳道4為山羊的基因組，泳道5為土雞的基因組。圖2為貓?zhí)禺愐颬CR檢測(cè)家貓、民豬、黃牛、山羊、土雞肌肉樣品結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)50bp Ladder,泳道1為家貓的PCR產(chǎn)物，泳道2為民豬的PCR產(chǎn)物， 泳道3為黃牛的PCR產(chǎn)物，泳道4為山羊的PCR產(chǎn)物，泳道5為土雞的PCR產(chǎn)物。圖3為豬特異引物PCR檢測(cè)家貓、民豬、黃牛、山羊、土雞肌肉樣品結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)IOObp Ladder,泳道1為家貓的PCR產(chǎn)物，泳道2為民豬的PCR產(chǎn)物，泳道3為黃牛的PCR產(chǎn)物，泳道4為山羊的PCR產(chǎn)物，泳道5為土雞的PCR產(chǎn)物。圖4為牛特異引物PCR檢測(cè)家貓、民豬、黃牛、山羊、土雞肌肉樣品結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)50bp Ladder,泳道1為家貓的PCR產(chǎn)物，泳道2為民豬的PCR產(chǎn)物， 泳道3為黃牛的PCR產(chǎn)物，泳道4為山羊的PCR產(chǎn)物，泳道5為土雞的PCR產(chǎn)物。圖5為羊特異引物PCR檢測(cè)家貓、民豬、黃牛、山羊、土雞肌肉樣品結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)IOObp Ladder,泳道1為家貓的PCR產(chǎn)物，泳道2為民豬的PCR產(chǎn)物，泳道3為黃牛的PCR產(chǎn)物，泳道4為山羊的PCR產(chǎn)物，泳道5為土雞的PCR產(chǎn)物。圖6為雞特異引物PCR檢測(cè)家貓、民豬、黃牛、山羊、土雞肌肉樣品結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)50bp Ladder,泳道1為家貓的PCR產(chǎn)物，泳道2為民豬的PCR產(chǎn)物， 泳道3為黃牛的PCR產(chǎn)物，泳道4為山羊的PCR產(chǎn)物，泳道5為土雞的PCR產(chǎn)物。圖7為五個(gè)引物對(duì)組合物PCR檢測(cè)家貓、民豬、黃牛、山羊、土雞肌肉樣品結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)IOObp Ladder,泳道1為家貓的PCR產(chǎn)物，泳道2為民豬的PCR 產(chǎn)物，泳道3為黃牛的PCR產(chǎn)物，泳道4為山羊的PCR產(chǎn)物，泳道5為土雞的PCR產(chǎn)物。圖8為五個(gè)引物對(duì)PCR擴(kuò)增特異性片段的酶切結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)IOObp Ladder,泳道1為家貓肌肉的PCR產(chǎn)物，泳道2為家貓PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，泳道3為民豬肌肉的PCR產(chǎn)物，泳道4為民豬PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，泳道5為黃牛肌肉的PCR 產(chǎn)物，泳道6為黃牛PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，泳道7為山羊肌肉的PCR產(chǎn)物，泳道8為山羊PCR 產(chǎn)物的酶切結(jié)果，泳道9為土雞肌肉的PCR產(chǎn)物，泳道10為土雞PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果。
圖9為五對(duì)引物對(duì)組合物PCR擴(kuò)增摻雜貓肉的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉樣品結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)IOObp Ladder,泳道1為摻雜0. 1 %貓肉的豬肉的PCR產(chǎn)物， 泳道2為摻雜0. 1 %貓肉的牛肉的PCR產(chǎn)物、泳道3為摻雜0. 1 %貓肉的羊肉的PCR產(chǎn)物， 泳道4為摻雜0. 1 %貓肉的雞肉的PCR產(chǎn)物。圖10為貓?zhí)禺愋砸飳?duì)PCR檢測(cè)長(zhǎng)毛貓、短毛貓，短毛虎皮貓肌肉樣品結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)50bp Ladder,泳道1為長(zhǎng)毛貓的PCR結(jié)果，泳道2為短毛貓的 PCR結(jié)果，泳道3為短毛虎皮貓的PCR結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、檢測(cè)動(dòng)物純肌肉樣品一、制備鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)以貓肉線粒體16S核糖體RNA基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增該基因的引物對(duì)。上游引物的序列為5 ‘ -AGCGCAACAATCAAAGCATCT-3 ‘(序列表中的序列1)，下游引物的序列為5' -CGCGGCCGTTTAACTAGC-3'(序列表中的序列2)。該引物對(duì)即為鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)。該引物對(duì)擴(kuò)增家貓的靶序列如序列表中序列11所示。序列表中的序列11的第130-135位是Hind III的識(shí)別序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后將成為兩條片段，長(zhǎng)度分別為132bp和23^p。以豬肉線粒體腺苷三磷酸酶VI亞基和VIII亞基基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增該基因的引物對(duì)。上游引物的序列為5 ‘ -CAGAATCAATTGAACTCAAAACTC-3 ‘(序列表中的序列 3)，下游引物的序列為5 ‘ -TAGTGTTGATGTTGAGTAGTGCTAAT-3 ‘(序列表中的序列4)。該引物對(duì)即為鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對(duì)。該引物對(duì)擴(kuò)增民豬的靶序列如序列表中序列12所示。序列表中的序列12的第133-138位是Hind III的識(shí)別序列，PCR 產(chǎn)物經(jīng)酶切后將成為兩條片段，長(zhǎng)度分別為135bp和476bp。以牛肉線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶II亞基基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增該基因的引物對(duì)。上游引物的序列為5‘ -CGCTTGTCTTCTTAATTAGCTCAT-3‘(序列表中的序列5)， 下游引物的序列為5‘ -GTAATATAAGCCTGGACGGGAC-3‘(序列表中的序列6)。該引物對(duì)即為鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對(duì)。該引物對(duì)擴(kuò)增黃牛的靶序列如序列表中序列13所示。序列表中的序列13的第263-268位是Hind III的識(shí)別序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后將成為兩條片段，長(zhǎng)度分別為265bp和229bp。以羊肉線粒體DNA細(xì)胞色素B基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增該基因的引物對(duì)。上游引物的序列為5 ‘ -CGGCATTCATAGGCTATGTTTT-3 ‘(序列表中的序列7)，下游引物的序列為5' -GACCGGAATGATAAGGAAATATATAATA-3'(序列表中的序列8)。該引物對(duì)即為鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對(duì)。該引物對(duì)擴(kuò)增山羊的靶序列如序列表中序列 14所示。序列表中的序列14的第253-258位是EcoR I的識(shí)別序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后將成為兩條片段，長(zhǎng)度分別為255bp和461bp。以雞肉線粒體DNA腺苷三磷酸合成酶VI亞基和VIII亞基基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增該基因的引物對(duì)。上游引物的序列為5 ‘ -TTATCCAACCCAAACTTCTTTC-3 ‘(序列表中的序列9)，下游引物的序列為5 ‘ -TTGTTTTGTGATTAGGTGGGTG-3 ‘(序列表中的序列10)。 該引物對(duì)即為鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對(duì)。該引物對(duì)擴(kuò)增土雞的靶序列如序列表中序列15所示。序列表中的序列15的第97-102位是Hind III的識(shí)別序列， PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后將成為兩條片段，長(zhǎng)度分別為99bp和160bp。二、檢測(cè)動(dòng)物純肌肉樣品1、檢測(cè)樣品的制備該實(shí)驗(yàn)中的樣品均是純肌肉，分別是家貓、民豬、黃牛、山羊、土雞肌肉樣品。2、利用步驟一的引物對(duì)PCR擴(kuò)增線粒體基因組上的相關(guān)基因片段1)樣品基因組的提取使用北京全式金生物技術(shù)有限公司Easy Pure Genomic DNA Extraction Kit (貨號(hào)EE101-01)提取步驟1中樣品的基因組DNA。結(jié)果表明，步驟1中的所有樣品使用該試劑盒均能有效提取到基因組，提取的數(shù)量在電泳檢測(cè)時(shí)可見(如圖1)，足夠用作PCR反應(yīng)的模板。2)單重PCR和五重PCR反應(yīng)及電泳檢測(cè)分別以上述步驟1中各個(gè)樣品的基因組DNA為模板，利用如下五個(gè)引物對(duì)或者是所述五個(gè)引物對(duì)的組合物進(jìn)行單重PCR和五重PCR 由序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA 組成的用于鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的引物對(duì)；由序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的引物對(duì)；由序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的引物對(duì)；由序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的引物對(duì)；由序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的引物對(duì)。其中，單個(gè)引物對(duì)的PCR體系10XBuffer 2. 0 μ L(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)DR001A)，dATP, dTTP, dCTP和dGTP各2. 5mM的4種dNTP混合物(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)D4030)2.0yL，濃度為20 μ M的上游引物l.OyL，濃度為 20 μ M的下游引物1. 0 μ L，模板(總DNA) 2. 0 μ L, 5U/ μ L的Taq DNA聚合酶(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)DR001A) 0. 5 μ L，加雙蒸水至20 μ L。其中，當(dāng)上游引物為序列1時(shí)，下游引物為序列2，此時(shí)PCR體系為擴(kuò)增貓基因的 PCR體系；當(dāng)上游引物為序列3時(shí)，下游引物為序列4，此時(shí)PCR體系為擴(kuò)增豬基因的PCR體系；當(dāng)上游引物為序列5時(shí)，下游引物為序列6，此時(shí)PCR體系為擴(kuò)增?；虻腜CR體系；當(dāng)上游引物為序列7時(shí)，下游引物為序列8，此時(shí)PCR體系為擴(kuò)增羊基因的PCR體系；當(dāng)上游引物為序列9時(shí)，下游引物為序列10，此時(shí)PCR體系為擴(kuò)增雞基因的PCR體系。五個(gè)引物對(duì)組合物的PCR體系10XBuffer 2. 0 μ L(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)DR001A)，dATP, dTTP, dCTP和dGTP各2. 5mM的4種dNTP混合物(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)D4030) 2.0 μ L，濃度為20 μ M的上游引物(序列1、3、5、7和 9所示單鏈DNA)各1. 0 μ L，濃度為20 μ M的下游引物(序列2、4、6、8和10所示單鏈DNA) 各1. O μ L，模板(總DNA) 2. OyL, 5U/ μ L的TaqDNA聚合酶(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)DR001A) 0. 5 μ L，加雙蒸水至20 μ L。PCR 程序:95°C，5min 預(yù)變性；95°C，30s, 62°C，30s, 72 V，45s，擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C，延伸5min ；4°C，保溫結(jié)束。將PCR反應(yīng)獲得的產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳濃度為 1. 5% -2%。3、純肌肉樣品的PCR結(jié)果電泳檢測(cè)結(jié)果顯示(1)采用由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中家貓的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中得到一條大小330-380的條帶(圖幻，其它民豬、黃牛、山羊、土雞的肌肉樣品中沒有該條帶。說(shuō)明貓?zhí)禺愐飳Ｒ恍苑浅：?，與其他動(dòng)物沒有交叉反應(yīng)；沒有非特異的雜帶產(chǎn)生。 (2)采用由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和 /或器官的PCR引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中民豬的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中得到一條大小580-640bp 的條帶(圖幻，其它家貓、黃牛、山羊、土雞的肌肉樣品中沒有該條帶。說(shuō)明豬特異引物專一性非常好，與其他動(dòng)物沒有交叉反應(yīng)；沒有非特異的雜帶產(chǎn)生。( 采用由序列表中序列5 和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對(duì)進(jìn)行 PCR反應(yīng)，其中黃牛的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中得到一條大小460-520bp的條帶(圖4)，其它家貓、 民豬、山羊、土雞的肌肉樣品中沒有該條帶。說(shuō)明牛特異引物專一性非常好，與其他動(dòng)物沒有交叉反應(yīng)；沒有非特異的雜帶產(chǎn)生。(4)采用由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中山羊的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中得到一條大小690-750bp的條帶(圖5)，其它家貓、民豬、黃牛、土雞的肌肉樣品中沒有該條帶。說(shuō)明羊特異引物專一性非常好，與其他動(dòng)物沒有交叉反應(yīng)；沒有非特異的雜帶產(chǎn)生。(5)采用由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中土雞的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中得到一條大小230_270bp的條帶(圖6)，其它家貓、民豬、黃牛、山羊的肌肉樣品中沒有該條帶。說(shuō)明雞特異引物專一性非常好，與其他動(dòng)物沒有交叉反應(yīng)；沒有非特異的雜帶產(chǎn)生。(6)采用五個(gè)引物對(duì)組合物在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中家貓的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中只有一條 330-380bp的條帶，民豬的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中只有一條大小580_640bp的條帶，黃牛的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中只有一條大小460-520bp的條帶，山羊的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中只有一條大小690-750bp 的條帶，土雞的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中只有一條大小230-270bp的條帶(圖7)。這一結(jié)果再次說(shuō)明五種PCR引物對(duì)專一性非常好，與其他動(dòng)物DNA沒有交叉反應(yīng)，沒有非特異的雜帶產(chǎn)生； 另外，這一結(jié)果還表明，五種引物對(duì)可以同時(shí)使用，在檢測(cè)靈敏度方面能達(dá)到與單獨(dú)使用各引物對(duì)相同的效果，引物對(duì)組合物的形式使得一次PCR反應(yīng)完成五種肉類的檢測(cè)，大大節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間與成本。4、酶切鑒定將PCR擴(kuò)增獲得的家貓、民豬、黃牛、土雞的條帶使用Hind III進(jìn)行酶切反應(yīng)；山羊的條帶使用EcoR I進(jìn)行酶切反應(yīng)。酶切體系10 X Buffer 1. O μ L，限制性內(nèi)切酶0. 5 μ L，PCR產(chǎn)物8. 5 μ L，加雙蒸水至 20μ L。其中，當(dāng)PCR產(chǎn)物為家貓、民豬、黃牛、土雞的條帶時(shí)，上述IOXBuffer為與Hind III匹配使用的10XBuffer (購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)D1060A)，上述限制性內(nèi)切酶為Hind 111(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)D1060A;當(dāng)PCR產(chǎn)物為山羊的條帶時(shí)，上述IOXBuffer為與EcoR I匹配使用的IOXBuffer (購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)D1040A)，上述限制性內(nèi)切酶為EcoR 1(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)D1040A)。酶切反應(yīng)獲得的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳濃度為1. 5% -2%。結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增獲得的家貓肌肉的條帶被酶切為100_150bp和200_250bp的兩條條帶；PCR擴(kuò)增獲得的民豬肌肉的條帶被酶切為100-200bp和450-550bp的兩條條帶； 黃牛肌肉的條帶被酶切為200-300bp的兩條條帶；山羊肌肉的條帶被酶切為200-300bp和 400-500bp的兩條條帶；土雞肌肉的條帶被酶切為50-100bp和150_200bp的兩條條帶(圖 8)。說(shuō)明PCR產(chǎn)物符合最初的設(shè)計(jì)，不是非特異性擴(kuò)增的結(jié)果，說(shuō)明PCR反應(yīng)結(jié)果真實(shí)有效。5、測(cè)序驗(yàn)證將家貓肌肉的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明家貓(序列表中的序列11)PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中家貓NC_001700的16S核糖體RNA基因片段的序列同源性達(dá)到98% 以上，大小為367bp。將民豬肌肉的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明民豬(序列表中的序列12)PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中家豬AP003^8. 1基因腺苷酸磷酸酶VI亞基和VIII亞基片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為611bp。將黃牛肌肉的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明黃牛(序列表中的序列13)PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中黃牛AY526085. 1的細(xì)胞色素C氧化酶II亞基基因片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為494bp。將山羊肌肉的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明山羊(序列表中的序列14)PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中山羊⑶068049的細(xì)胞色素B基因片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為716bp。將土雞肌肉的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明土雞(序列表中的序列15) PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中原雞AY235571. 1腺苷酸磷酸合成酶VI亞基和VIII亞基片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為259bp。上述實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，引物之間沒有交叉反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物符合預(yù)計(jì)的大小，且都能被設(shè)計(jì)好的限制性內(nèi)切酶切割，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物不是非特異性擴(kuò)增的結(jié)果。整個(gè)結(jié)果清晰、可信度高。實(shí)施例2檢測(cè)摻雜肌肉樣品一、制備鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對(duì)設(shè)計(jì)和制備方法同實(shí)施例1 一。二、檢測(cè)動(dòng)物肌肉樣品1、檢測(cè)樣品的制備該實(shí)驗(yàn)中的樣品是摻雜家貓肉的民豬肉、黃牛肉、山羊肉和土雞肉1)摻雜貓肉的豬肉在99.9g豬肉中摻雜0. Ig貓肉，制成0. 的摻雜貓肉的豬肉。2)摻雜貓肉的牛肉在99.9g牛肉中摻雜0. Ig貓肉，制成0. 的摻雜貓肉的牛肉。3)摻雜貓肉的羊肉在99.9g羊肉中摻雜0. Ig貓肉，制成0. 的摻雜貓肉的羊肉。4)摻雜貓肉的雞肉在99.9g雞肉中摻雜0. Ig貓肉，制成0. 的摻雜貓肉的雞肉。2、利用步驟一的引物對(duì)PCR擴(kuò)增線粒體基因組上的相應(yīng)基因片段1)樣品基因組的提取制備方法同實(shí)施例1步驟二 2。2) PCR反應(yīng)及電泳檢測(cè)分別以上述步驟1中各個(gè)樣品的基因組DNA為模板，以序列表中序列1、3、5、7和 9所示的上游引物和序列表中序列2、4、6、8和10所示的下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。其PCR反應(yīng)(五個(gè)引物對(duì)組合物)體系為10XBuffer 2. 0 μ L(購(gòu)自寶生物工程 (大連)有限公司，貨號(hào)DROO1Α)，dATP, dTTP, dCTP和dGTP各2. 5mM的4種dNTP混合物 (購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)D4030) 2.0 μ L，濃度為20 μ M的上游引物(序列 1、3、5、7和9所示單鏈DNA)各l.OyL，濃度為20 μ M的下游引物(序列2、4、6、8和10所示單鏈DNA)各1. 0 μ L，模板(總DNA) 2. 0 μ L, 5U/ μ L的I1aq DNA聚合酶(購(gòu)自寶生物工程 (大連)有限公司，貨號(hào)DR001A) 0. 5 μ L，加雙蒸水至20 μ L。PCR 程序:95°c，5min 預(yù)變性；95°C，30s, 62°C，30s, 72°C，45s，擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C，延伸5min ；4°C，保溫結(jié)束。將PCR反應(yīng)獲得的產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳濃度為 1. 5% -2%。3、摻雜貓肉的肌肉樣品檢測(cè)結(jié)果電泳檢測(cè)結(jié)果表明，摻雜0. 貓肉的豬肉中得到兩條大小分別為330_380bp和580-640bp的條帶，摻雜0. 貓肉的牛肉中得到兩條大小分別為330-380bp和460_520bp 的條帶，摻雜0. 貓肉的羊肉中得到兩條大小分別為330-380bp和690-750bp的條帶，摻雜0. 貓肉的雞肉中得到兩條大小分別為330-380bp和230-270bp的條帶(圖9)。4、測(cè)序驗(yàn)證將如下PCR 產(chǎn)物均進(jìn)行測(cè)序:230-270bp (雞)、330_380bp (貓)、460_520bp (牛)、 580-640bp (豬)、690-750bp (羊)，結(jié)果表明家貓(序列表中的序列11) PCR產(chǎn)物的序列與 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中家貓NC_001700的16S核糖體RNA基因片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為367bp，且在130-135位有HindIII酶切位點(diǎn)。民豬(序列表中的序列12) PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中家豬AP003^8. 1基因腺苷酸磷酸酶VI亞基和VIII亞基片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為611bp，且在133-138位有HindIII酶切位點(diǎn)；黃牛(序列表中的序列13)PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中黃牛AY526085. 1的細(xì)胞色素C氧化酶II亞基基因片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為494bp，且在沈3-268位有HindIII酶切位點(diǎn)；山羊(序列表中的序列14) PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中山羊⑶068049的細(xì)胞色素 B基因片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為716bp，且在253-258位有EcoRI酶切位點(diǎn)； 土雞(序列表中的序列15)PCR產(chǎn)物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中原雞AY235571. 1腺苷酸磷酸合成酶VI亞基和VIII亞基片段的序列同源性達(dá)到98%以上，大小為259bp，且在97-102 位有HindIII酶切位點(diǎn)。實(shí)施例3、利用鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)檢測(cè)不同貓肉樣品一、制備鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)設(shè)計(jì)和制備方法同實(shí)施例1步驟一。二、檢測(cè)各種貓肉樣品1、檢測(cè)樣品檢測(cè)樣品為長(zhǎng)毛貓、短毛貓和短毛虎皮貓肌肉。2、利用步驟一的引物對(duì)PCR擴(kuò)增線粒體基因組上的16S核糖體RNA基因片段1)樣品基因組的提取同實(shí)施例1。2) PCR 反應(yīng)同實(shí)施例1。將PCR反應(yīng)獲得的產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳濃度為2%。 電泳檢測(cè)結(jié)果表明長(zhǎng)毛貓、短毛貓和短毛虎皮貓肌肉中均得到一條大小330-380bp的條帶 (圖10)。這說(shuō)明貓的引物對(duì)貓類具有通用性，能適合多種貓的鑒定。3、測(cè)序驗(yàn)證將所有的長(zhǎng)毛貓、短毛貓和短毛虎皮貓肌肉的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明長(zhǎng)毛貓(序列表中的序列16)、短毛貓(序列表中的序列17)和短毛虎皮貓(序列表中的序列 18)肌肉的PCR產(chǎn)物的大小均為367bp，均在第130-135位有HindIII的識(shí)別位點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對(duì)組合物，由獨(dú)立包裝的五個(gè)引物對(duì)組成，第一對(duì)引物是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)，第二對(duì)引物是由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對(duì)，第三對(duì)引物是由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR 引物對(duì)，第四對(duì)引物是由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對(duì)，第五對(duì)引物是由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對(duì)；所述動(dòng)物為貓、牛、羊、 豬、雞中的至少一種。
2.鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對(duì)組合物，為下述1)- 中任一種1)由獨(dú)立包裝的四個(gè)引物對(duì)組成，其中一個(gè)引物對(duì)是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)，另外三個(gè)引物對(duì)為下述四個(gè)引物對(duì)中的任三個(gè)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對(duì)；所述動(dòng)物為貓、牛、羊、豬、雞中的至少一種；2)由獨(dú)立包裝的三個(gè)引物對(duì)組成，其中一個(gè)引物對(duì)是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)，另外兩個(gè)引物對(duì)為下述四個(gè)引物對(duì)中的任兩個(gè)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對(duì)；所述動(dòng)物為貓、牛、羊、豬、雞中的至少一種；3)由獨(dú)立包裝的兩個(gè)引物對(duì)組成，其中一個(gè)引物對(duì)是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)，另外一個(gè)引物對(duì)為下述四個(gè)引物對(duì)中的任一個(gè)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對(duì)、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對(duì)；所述動(dòng)物為貓、牛、羊、豬、雞中的至少一種；
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)組合物，其特征在于權(quán)利要求1所述五個(gè)引物對(duì)在PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為1 :1:1:1: 1 ；權(quán)利要求2中1)所述四個(gè)引物對(duì)在 PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為1 :1:1: 1 ；權(quán)利要求2中2)所述三個(gè)引物對(duì)在PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為1 1 1 ；權(quán)利要求2中3)所述兩個(gè)引物對(duì)在PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為1 1。
4.鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)，由兩條單鏈DNA組成，所述兩條 DNA單鏈分別為序列表中序列1所示的單鏈DNA，和序列表中序列2所示的單鏈DNA。
5.鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的試劑盒，其特征在于所述試劑盒含有權(quán)利要求1-4中任一所述的引物對(duì)組合物或引物對(duì)，和限制性內(nèi)切酶，所述限制性內(nèi)切酶為 EcoR I和/或Hind III ；所述動(dòng)物為貓、牛、羊、豬、雞中的至少一種。
6.權(quán)利要求1-4中任一所述的引物對(duì)組合物或引物對(duì)的制備方法，其特征在于所述制備方法包括將權(quán)利要求1-4中任一所述的引物對(duì)組合物或引物對(duì)中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。
7.權(quán)利要求5所述的PCR試劑盒的制備方法，包括如下步驟將權(quán)利要求1-4中任一所述的引物對(duì)組合物或引物對(duì)中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP和限制性內(nèi)切酶；所述限制性內(nèi)切酶為Hind III和/或EcoR I。
8.利用權(quán)利要求1-4中任一所述的引物對(duì)組合物或引物對(duì)鑒定或輔助鑒定待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中是否含有或候選含有貓、牛、羊、豬、雞這五種動(dòng)物中至少一種動(dòng)物組織和/或器官的方法，包括下述(1)和的步驟所述(1)為如下A)-E)中任一步驟A)在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)組合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；B)在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求2中1)所述的引物對(duì)組合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；C)在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求2中2、所述的引物對(duì)組合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；D)在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求2中幻所述的引物對(duì)組合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；E)在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求4所述的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)檢測(cè)步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有哪種或哪些動(dòng)物組織和/或器官如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是330-380bp，如367bp的DNA片段，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有貓組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是580-640bp，如61 Ibp的DNA片段，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是460-520bp，如494bp的DNA片段，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是690-750bp，如716bp的DNA片段，所述的DNA片段待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物中含有大小是230-270bp，如259bp的DNA片段，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官；所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官來(lái)源于下述動(dòng)物中的至少一種貓、牛、羊、豬、雞。
9.利用權(quán)利要求5所述的試劑盒鑒定或輔助鑒定待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中是否含有或候選含有貓、牛、羊、豬、雞這五種動(dòng)物中至少一種動(dòng)物組織和/或器官的方法，包括下述a)-c)的步驟a)在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權(quán)利要求5所述試劑盒中的引物對(duì)組合物或引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；b)檢測(cè)步驟a)得到的PCR產(chǎn)物的大小，確定所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有哪種或哪些動(dòng)物組織和/或器官，方法如權(quán)利要求8步驟( 所述；c)對(duì)經(jīng)步驟b)檢測(cè)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，所述酶切鑒定的步驟及確定所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有哪種或哪些動(dòng)物組織和/或器官的方法為下述 cl)-c5)中的至少一種cl)將所述大小是330-380bp，如367bp的DNA片段用HindIII進(jìn)行酶切鑒定，如果所述 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被HindIII酶切為100_150bp和200_250bp的兩個(gè)片段，如132bp和235bp， 所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有貓組織和/或器官；c2)將所述大小是580-640bp，如61 Ibp的DNA片段用HindIII進(jìn)行酶切鑒定，如果所述 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被HindIII酶切為100_200bp和450_550bp的兩個(gè)片段，如135bp和476bp， 所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；c3)將所述大小為460-520bp，如494bp的DNA片段用HindIII進(jìn)行酶切鑒定的步驟， 如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被HindIII酶切為200-300bp的兩個(gè)片段，如和229bp，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官；c4)將所述大小為690-750bp，如716bp的DNA片段用EcoRI進(jìn)行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被EcoRI酶切為200-300bp和400-500bp的兩個(gè)片段，如255bp和 461bp，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；c5)將所述大小為230480bp，如259bp的DNA片段用HindIII進(jìn)行酶切鑒定的步驟， 如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被HindIII酶切為50_100bp和150_200bp的兩個(gè)片段，如99bp 和160bp，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官； 所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官來(lái)源于下述動(dòng)物中的至少一種貓、牛、羊、豬、雞。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述方法，其特征在于所述檢測(cè)所得到的PCR產(chǎn)物大小的方法是將所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示330-380bp之間的一條帶，如367bp，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有貓組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示580-640bp之間的一條帶，如 611bp，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；如果所述PCR 產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示460-520bp之間的一條帶，如494bp，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/ 或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示 690-750bp之間的一條帶，如716bp，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；如果所述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示230-280bp之間的一條帶，如 259bp，所述待測(cè)動(dòng)物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官。
全文摘要
本發(fā)明公開了鑒定或輔助鑒定動(dòng)物組織和/或器官的PCR引物對(duì)及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的引物對(duì)為鑒定或輔助鑒定貓、牛、羊、豬和雞組織和/或器官的共五個(gè)PCR引物對(duì)中，包含鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對(duì)在內(nèi)的至少一種引物對(duì)；所述鑒定或輔助鑒定貓、豬、牛、羊和雞組織和/或器官的共五個(gè)PCR引物對(duì)依次分別由序列1和序列2所示兩條DNA單鏈、序列3和序列4所示兩條DNA單鏈組成、序列5和序列6所示兩條DNA單鏈、序列7和序列8所示兩條DNA單鏈、序列9和序列10所示兩條DNA單鏈組成。本發(fā)明五個(gè)引物對(duì)均選用了62℃的退火溫度，實(shí)現(xiàn)了在同一溫度一次PCR完成所有鑒別，且特異性強(qiáng)，檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)短。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102382891SQ20111036313
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者于雷, 侯東軍, 姜艷彬, 尹艷, 李通, 李穎, 楊紅菊, 王海 申請(qǐng)人:侯東軍