專利名稱：一種優(yōu)化改良的中性纖維素酶meg1及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種優(yōu)化改良的中性纖維素酶 MEGl及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
纖維素酶系由三類功能不同但又互補(bǔ)的酶組成。這三類酶分別是內(nèi)切葡聚糖酶 (EG, Cx酶)，可作用于纖維素分子內(nèi)的無定形區(qū)，隨機(jī)水解β -1，4糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量的小分子纖維素。內(nèi)切型纖維素酶可為外切酶提供大量的反應(yīng)末端，同時(shí)它也能水解小分子的纖維素寡糖。外切葡聚糖酶(纖維二糖水解酶，CBH，Cl酶)。這類酶作用于纖維素分子的末端，依次從纖維素分子中切下纖維二糖，它可以作用于纖維素分子內(nèi)的結(jié)晶區(qū)、無定形區(qū)。葡萄糖苷酶(纖維二糖酶，BG)，這類酶將纖維二糖水解成葡萄糖，也可以從短鏈葡聚糖的非還原端切下葡萄糖。好氧的絲狀真菌，如常見的木霉、曲霉、青霉等能大量合成纖維素酶并分泌到胞外，各種纖維素酶組分獨(dú)立存在，為非復(fù)合酶系。纖維素酶最早應(yīng)用于動(dòng)物飼料生產(chǎn)，隨后是食品行業(yè)，緊接著這些酶制劑應(yīng)用到紡織、洗滌劑和制漿造紙工業(yè)；之后，酶制劑的應(yīng)用急劇增加，尤其是在紡織、食品、釀造和制漿造紙工業(yè)。絲狀真菌所產(chǎn)纖維素酶大多適應(yīng)酸性環(huán)境，在中性或中性偏堿性條件下酶活力喪失。隨著紡織、造紙、洗滌工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，酸性纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)已滿足不了實(shí)際生產(chǎn)的需求。例如，在紡織品整理方面，中性纖維素酶與酸性纖維素酶相比，其處理效果獨(dú)特，具有如下優(yōu)點(diǎn)1、高反差外觀中性纖維素酶能讓織物具有反差大和背著色低的外觀，藍(lán)、白色的對(duì)比非常強(qiáng)，簡化了或省略了清潔工序。2、中性纖維素酶不會(huì)使處理后的服裝產(chǎn)生嚴(yán)重的背面沾污，具有抗返染，次品率低，產(chǎn)品質(zhì)量均勻、手感好等特點(diǎn)。3、操作簡單，操作人員只需對(duì)PH值進(jìn)行少量控制便可獲得穩(wěn)定的磨蝕效果。此外，在洗滌及造紙工業(yè)中，中性或者中性偏堿的環(huán)境不利于酸性纖維素酶發(fā)揮其水解作用，從而造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。中性纖維素酶則能很好解決這些問題。然而，來源于細(xì)菌的中性纖維素酶的產(chǎn)酶量和比活性都較低，這限制了其在生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用。絲狀真菌來源的纖維素酶具有活性高，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，因此可以嘗試通過基因工程的對(duì)來源于絲狀真菌的酸性纖維素酶進(jìn)行改造，以提高其在中性或者中性偏堿性環(huán)境下的活性。里氏木霉(Trichoderma reesei)是在研究和生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的菌株，它所產(chǎn)的纖維素酶系至少包含2個(gè)外切酶(CBH I,CBH II)，5個(gè)內(nèi)切酶(EG I，EG II，EG III,EGIV, EG V)和2個(gè)β-葡萄糖苷酶(BGL I，BGL II)。在里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶中，EG I的含量最大，可占纖維素酶組分總量的5-10%，在內(nèi)切酶的作用過程中起重要作用。編碼EG I的基因序列已經(jīng)被克隆，其cDNA全長為1380bp，編碼459個(gè)氨基酸殘基的蛋白。EG I發(fā)揮作用的最適PH值為5. 5，在中性環(huán)境下酶活急劇下降。因此，通過基因改造既可以使其最適 PH值向中性或者弱堿性偏移，同時(shí)也能保持其較高的比活力，在紡織、洗滌、造紙、飼料等領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種優(yōu)化改良的中性纖維素酶MEGl。
本發(fā)明的另-一目的是提供編碼上述優(yōu)化改良的中性纖維素酶的基因MEG1。
本發(fā)明的另-一目的是提供包含上述優(yōu)化改良的中性纖維素酶基因的重組載體。
本發(fā)明的另-一目的是提供包含上述優(yōu)化改良的中性纖維素酶基因的重組菌株。
本發(fā)明的另-一目的是提供制備上述優(yōu)化改良的中性纖維素酶的方法。
本發(fā)明的另-一目的是提供上述優(yōu)化改良的中性纖維素酶的應(yīng)用。
里氏木霉天然EGl的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示
MAPSVTLPLTTAILAIARLVAAQQPGTSTPEVHPKLTTYKCTKSGGCVAQ
DTSVVLDffNY60
RWMHDANYNSCTVNGGVNTTLCPDEATCGKNCFIEGVDYAASGVTTSGSS
LTMNQYMPSS120
SGGYSSVSPRLYLLDSDGEYVMLKLNGQELSFDVDLSALPCGENGSLYLS
QMDENGGANQ180
YNTAGANYGSGYCDAQCPVQTffRNGTLNTSHQGFCCNEMD
ILEGNSRANALTPHSCTATA240
CDSAGCGFS￡YGSGYKSYYGPGDTVDTSKTFTIITQFNTDNGSPSGNLVS
ITRKYQQNGV300
DVPSAQPGGDTISSCPSASAYGGLATMGKALSSGMVLVFSIffNDNSQYMN
WLDSGNAGPC360
SSTEGNPSNILANNPNTHVVFSNIRffGDIGSTTNSTAPPPPPASSTTFST
TRRSSTTSSS420
PSCTQTHWGQCGGIGYSGCKTCTSGTTCQYSNDYYSQCL459
本發(fā)明優(yōu)選采用易錯(cuò)PCR隨機(jī)突變及突變重組的方法對(duì)SEQ ID NO. 1所示的里氏
木霉來源的EGl進(jìn)行改造，并經(jīng)過高通量突變篩選的方法篩選得到中性纖維素酶MEG 1，本發(fā)明的MEGl和原有里氏木霉來源的EGl相比，有13個(gè)氨基酸的差異，其氨基酸序列中8位的P突變成A，55位的V突變成I，95位的E突變成Q，119位的S突變成R，152位的F突變成I，179位的N突變成H，214位的F突變成I，250位的P突變成A，285位的S突變成T， 308位的G突變成R，345位的N突變成H，427位的H突變成N，454位的Y突變成D，突變后的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示MAPSVTLALT TAILAIARLVAAQQPGTSTPEVHPKLTTYKCTKSGGCVAQ
DTSVILDffNY60
RWMHDANYNS CTVNGGVNTTLCPDEATCGKNCFIQGVDYAASGVTTSGSS
LTMNQYMPRS120
SGGYSSVSPR LYLLDSDGEYVMLKLNGQELSIDVDLSALPCGENGSLYLS
QMDENGGAHIQ180
YNTAGANYGS GYCDAQCPVQTffRNGTLNTSHQGICCNEMD
ILEGNSRANA LTPHSCTATA240
CDSAGCGFS& YGSGYKSYYGPGDTVDTSKTFTIITQFNTDNGSPTGNLVS
ITRKYQQNGV300DVPSAQPRGD TISSCPSASAYGGLATMGKA LSSGMVLVFS IffNDHSQYMNWLDSGNAGPC360SSTEGNPSNI LTNNPNTHVV FSNIRffGDIG STTNSTAPPP PPASSTTFSTTRRSSTTSSS420PSCTQTNWGQ CGGIGYSGCK TCTSGTTCQY SNDDYSQCL459該纖維素酶MEGl在作用pH值方面更加優(yōu)良，在pH值為7. 0時(shí)酶活最高。未改良的EGl在pH值為7. 0的環(huán)境下酶活較低，說明本發(fā)明的經(jīng)過改良的MEGl達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)的中性PH要求。本發(fā)明還提供了上述優(yōu)化改良中性纖維素酶基因序列MEG1，其堿基序列如SEQID NO. 4所示atggcgccctcagttacactggcgttgaccacggccatcctggccattgcccggctcgtc60
gccgcccagcaaccgggtaccagcacccccgaggtccatcccaagttgacaacctacaag120
tgtacaaagtccggggggtgcgtggcccaggacacctcggtgatccttgactggaactac180
cgctggatgcacgacgcaaactacaactcgtgcaccgtcaacggcggcgtcaacaccacg240
ctctgccctgacgaggcgacctgtggcaagaactgcttcatccagggcgtcgactacgcc300
gcctcgggcgtcacgacctcgggcagcagcctcaccatgaaccagtacatgccccgcagc360
tctggcggctacagcagcgtctctcctcggctgtatctcctggactctgacggtgagtac420
gtgatgctgaagctcaacggccaggagctgagcatcgacgtcgacctctctgctctgccg480
tgtggagagaacggctcgctctacctgtctcagatggacgagaacgggggcgcccaccag540
tataacacggccggtgccaactacgggagcggctactgcgatgctcagtgccccgtccag600
acatggaggaacggcaccctcaacactagccaccagggcatctgctgcaacgagatggat660
atcctggagggcaactcgagggcgaatgccttgacccctcactcttgcacggccacggcc720
tgcgactctgCCggttgCggcttcagcgcctatggcagcggctacaaaagctactacggc780
cccggagataccgttgacacctccaagaccttcaccatcatcacccagttcaacacggac840
aacggctcgcccacgggcaaccttgtgagcatcacccgcaagtaccagcaaaacggcgtc900
gacgtccccagcgcccagccccgcggcgacaccatctcgtcctgcccgtccgcctcagcc960
tacggcggcctcgccaccatgggcaaggccctgagcagcggcatggtgctcgtgttcagc1020
atttggaacgaccacagccagtacatgaactggctcgacagcggcaacgcCggCCCCtgC1080
agcagcaccgagggcaacccatccaacatcctgaccaacaaccccaacacgcacgtcgtc1140
ttctccaacatccgctggggagacattgggtctactacgaactcgactgcgcccccgccc1200
CCgCCtgCgtccagcacgacgttttcgactacacggaggagctcgacgacttcgagcagc1260
ccgagctgcacgcagactaactgggggcagtgcggtggcattgggtacagcgggtgcaag1320
acgtgcacgtcgggcactacgtgccagtatagcaacgacgactactcgcaatgcctttag1380
本發(fā)明還提供了包含上述優(yōu)化改良的中性纖維素酶基因MEGl的重組載體，優(yōu)選
為pPICz α A-MEG1。將本發(fā)明的優(yōu)化改良的中性纖維素酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的糖化酶基因插入到質(zhì)粒PPICz α A上的EcoR I和Not I 限制性酶切位點(diǎn)之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒 pPICz α A-MEGl。本發(fā)明還提供了包含上述優(yōu)化改良的中性纖維素酶基因MEGl的重組菌株，優(yōu)選重組菌株是畢赤酵母菌株Χ33。本發(fā)明還提供了一種制備上述優(yōu)化改良的中性纖維素酶MEGl的方法，包括以下步驟1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組中性纖維素酶MEGl的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的中性纖維素酶MEGl。具體地，將重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICz α A-MEGl，轉(zhuǎn)化到酵母宿主菌株Χ33中，用高濃度的抗生素平板篩選高拷貝的轉(zhuǎn)化子，將篩選到的轉(zhuǎn)化子，在7L的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵， 發(fā)酵過程中，每隔24h取發(fā)酵液測定0D_以及菌體濕重，取上清液進(jìn)行植酸酶活性檢測。發(fā)酵結(jié)束最終平均發(fā)酵酶活達(dá)到13000U/mL，實(shí)現(xiàn)中性纖維素酶MEGl的高效表達(dá)。本發(fā)明還提供了上述中性MEGl的應(yīng)用，優(yōu)選該酶在水解淀粉及在紡織、洗滌、造紙和飼料中的應(yīng)用。本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，利用基因工程手段對(duì)里氏木霉纖維素酶EGl進(jìn)行改良，以解決其在酸性環(huán)境下酶活較低，不能適用于工業(yè)生產(chǎn)的要求。經(jīng)過優(yōu)化改良的 MEGl在中性條件下酶活有很大的提高，并且，通過高拷貝外源基因菌株的篩選，得到能夠在反應(yīng)器中高效表達(dá)的生產(chǎn)菌株，進(jìn)一步滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，因此，本發(fā)明的優(yōu)化改良的 MEGl可在紡織、洗滌、造紙、飼料中顯示出巨大的應(yīng)用潛力。


圖1為pPICz α A-MEGl酵母菌株在7L發(fā)酵罐中的發(fā)酵情況。圖2為纖維素酶EGl和MEGl在不同ρΗ值環(huán)境下的相對(duì)酶活曲線圖。圖3為纖維素酶EGl和MEGl在不同溫度環(huán)境下的相對(duì)酶活曲線圖。圖4為纖維素酶EGl和MEGl的熱穩(wěn)定性曲線圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料和試劑1、菌株與載體大腸桿菌菌株！"ορΙΟ、畢赤酵母Χ33、載體 pPICzalphaA，Zeocin 購自 hvitrogen 公司，載體PECO購自Gentarget公司。2、酶與試劑盒PCR酶，質(zhì)粒提取試劑盒、膠純化試劑盒、限制性內(nèi)切酶試劑盒購自上海生工公司。3、培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為LB (1%蛋白胨，0. 5%酵母提取物，NaCl，pH7. 0)。LB-AMP為 LB培養(yǎng)基加100ug/mL氨芐青霉素。LB-Zeo為LB培養(yǎng)基加25ug/mI^eocin。酵母培養(yǎng)基為YPD(1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)。酵母篩選培養(yǎng)基為 YPDzeo (YPD+100mg/L zeocin)。酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMGY(1 %酵母提取物、2%蛋白胨、1.34% YNB,0. 00004 %Bi0tin、l%甘油(V/V))和BMMY(除以0.5%甲醇代替甘油，其余成份相與BMGY相同)。重組酵母發(fā)酵培養(yǎng)基本鹽培養(yǎng)基磷酸氫二銨5%、磷酸二氫鉀0. 5%、七水硫酸 鎂1.5%、硫酸鉀1.95%、硫酸鈣0. 1%、氫氧化鉀0. 1%、消泡劑0.03%。高壓后每升加 4. 35 毫升 PTMl。PTMl (微量鹽溶液)硫酸銅0. 6%、碘化鉀0. 018%、一水硫酸錳0. 3%、二水鉬 酸鈉0. 02 %、硼酸0. 002 %、六水氯化鈷0. 05 %、氯化鋅2 %、七水硫酸鐵6. 5 %、濃硫酸 0. 5%、生物素 0. 02%。實(shí)施例1、里氏木霉EGl基因的合成及克隆以已公布的里氏木霉EGl基因序列作為參考，人工合成該基因序列，根據(jù)基因5’ 端設(shè)計(jì)PCR引物含有EcoRI內(nèi)切酶位點(diǎn)，3’端設(shè)計(jì)PCR引物含NotI內(nèi)切酶位點(diǎn)，起引物序 列如下5，端引物 EGlFl :ATGGCGCCCTCAGTTACACT3，端引物 EGlRl CTAAAGGCATTGCGAGTAGT以合成基因?yàn)槟０?，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的片段克隆到載體 PECO上，得到重組載體pECO-EGl。實(shí)施例2、基因易錯(cuò)PCR隨機(jī)突變以上述pECO-EGl為模板，進(jìn)行易錯(cuò)PCR隨機(jī)突變擴(kuò)增，具體地?cái)U(kuò)增方法是第一輪擴(kuò)增以載體啟動(dòng)子引物T7-F和T7-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如 下
權(quán)利要求
1.一種優(yōu)化改良的中性纖維素酶MEG1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDN0.2所7J\ ο
2.一種優(yōu)化改良的中性纖維素酶基因MEG1，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的中性纖維素酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述優(yōu)化改良的中性纖維素酶基因MEG1，其特征在于，其堿基序列如 SEQ ID NO. 3 所示。
4.包含權(quán)利要求2或3所述優(yōu)化改良的中性纖維素酶基因MEGl的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為pPICzα A-MEGl。
6.包含權(quán)利要求2或3所述優(yōu)化改良的中性纖維素酶基因MEGl的重組菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為畢赤酵母菌。
8.一種制備優(yōu)化改良的中性纖維素酶MEGl的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用權(quán)利要求4的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組中性纖維素酶MEGl的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的中性纖維素酶MEG1。
9.權(quán)利要求1所述優(yōu)化改良的中性纖維素酶MEGl的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種優(yōu)化改良的中性纖維素酶MEG1及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種優(yōu)化改良的中性纖維素酶MEG1，其具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，且本發(fā)明還提供了編碼上述優(yōu)化改良的中性纖維素酶MEG1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，以及包含該基因的重組載體和重組菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)化改良的中性纖維素酶MEG1在中性條件下酶活有很大的提高，并且，通過高拷貝外源基因菌株的篩選，得到能夠在反應(yīng)器中高效表達(dá)的生產(chǎn)菌株，進(jìn)一步滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，因此，本發(fā)明的優(yōu)化改良的MEG1可在紡織、洗滌、造紙、飼料中顯示出巨大的應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)C12N15/81GK102399769SQ201110362928
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者史寶軍, 李陽源, 畢香梅, 羅長財(cái), 胡愛紅, 鐘開新, 陳麗芝 申請(qǐng)人:廣東溢多利生物科技股份有限公司