專利名稱:單核細(xì)胞增生性李斯特菌與胎兒彎桿菌的檢測試劑及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種能夠鑒別單核細(xì)胞增生李斯特菌與胎兒彎桿菌性流產(chǎn)的分子檢測技術(shù),特別是提供了能夠用于鑒別單核細(xì)胞增生性李斯特菌與胎兒彎桿菌性流產(chǎn)的分子檢測試劑及其制備方法和應(yīng)用,屬于動物性食品病原學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
懷孕母畜流產(chǎn)是獸醫(yī)臨床中最常見的疾病。在畜牧業(yè)生產(chǎn)實踐中,引起母牛母羊流產(chǎn)的誘因很多,主要有遺傳、氣候與環(huán)境、內(nèi)分泌、微生物和飼養(yǎng)管理等因素,其中由病原微生物引起的流產(chǎn)是重要的誘因。單核細(xì)胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes, LM) 是一種能引起人和動物李斯特菌病的人獸共患病原菌。自從1擬6年首次分離到該菌以來, 目前已證實該菌可感染綿羊、山羊、牛、豬、鹿、雞、兔、鼠、鴨、鵝、鸚鵡、北極狐等40多種動物。在家畜上,LM可引起腦膜腦炎、流產(chǎn)和急性敗血?。辉诩仪萆?,LM可導(dǎo)致敗血癥和心肌壞死的發(fā)生,每年該病都對我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失。同時,作為一種重要的食源性細(xì)菌,該菌能污染肉、奶、蛋等動物性食品而引起食品中毒,并能導(dǎo)致孕婦、新生兒及免疫力低下的成年人發(fā)病,對人類的健康也構(gòu)成極大的威脅,被列為是四大食源性病原菌之一。胎兒彎桿菌(Pampylobacter fetus)是引起牛羊流產(chǎn)的重要病原之一。該菌屬于彎桿菌屬的成員,包括胎兒彎桿菌胎兒亞種(C fetus subsp. Zfeto1S)和胎兒彎桿菌性病亞種 {C. fetus subsp. venerealis)。胎兒彎桿菌可感染人,尤其患有免疫缺陷癥的人,感染后能引起腦膜炎、菌血癥、關(guān)節(jié)炎、腹瀉等疾病。因此,胎兒彎桿菌嚴(yán)重威脅著人類的健康并給畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。近年來,由單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌感染導(dǎo)致的牛羊流產(chǎn)病例日益增多,在畜牧業(yè)生產(chǎn)上根據(jù)臨床癥狀無法鑒別上述兩種細(xì)菌感染引起的流產(chǎn)。目前,國內(nèi)對于單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌病的診斷方法主要依賴于病原的分離、生化實驗等常規(guī)方法,但由于胎兒彎桿菌的生長需要嚴(yán)格的氣體環(huán)境和生化條件,而且對采集的病料有特殊要求,一般的實驗室不具培養(yǎng)條件,特別是胎兒彎桿菌在合適的培養(yǎng)基上也生長緩慢, 得到了可疑菌落,用生化試驗來鑒定胎兒彎桿菌難度仍然較大。這給胎兒彎桿菌的分離帶來很大困難;單核細(xì)胞增生李斯特菌培養(yǎng)法雖然準(zhǔn)確,但制備培養(yǎng)基、計算菌落數(shù)量和鑒定菌落的生化特性都耗時耗力,并且培養(yǎng)方法的成功依賴于樣本中細(xì)菌的數(shù)量和狀況和培養(yǎng)基選擇,不適合當(dāng)前快速檢測的需求。對單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌免疫學(xué)方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和酶聯(lián)熒光分析法(ELFA)。ELISA法雖然敏感性較高,但其缺點當(dāng)檢測樣品受污染時特異性較差;ELFA法雖然特異性和敏感性都較高,但該方法的缺點是成本較高。鑒于單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌常規(guī)檢測方法存在一定的不足,目前迫切需要研究能快速鑒別單核細(xì)胞增生李斯特菌與胎兒彎桿菌性流產(chǎn)的分子檢測試劑和方法。近年來,隨著分子細(xì)菌學(xué)的快速發(fā)展,檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌的分子生物學(xué)技術(shù)也逐漸建立起來。與常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法和免疫學(xué)方法相比,分子生物學(xué)技術(shù)在檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌方面具有快速、特異、敏感和準(zhǔn)確等優(yōu)勢。內(nèi)化素J (InlJ)基因是存在于單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組中的保守基因,而16S rDNA基因在胎兒彎桿菌基因組中也高度保守。因此,根據(jù)兩種細(xì)菌的保守基因可以設(shè)計和合成針對兩種細(xì)菌的特異性的分子檢測試劑,用于檢測并鑒別上述兩種細(xì)菌引起的牛羊流產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用單核細(xì)胞增生李斯特菌MlJ基因和胎兒彎桿菌 16S rDNA基因高度保守序列設(shè)計合成了 2對用于鑒別上述兩種細(xì)菌的分子檢測試劑。本發(fā)明的另一目的是提供一種簡單實用、易操作的上述檢測試劑的制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供一種快速、特異性強、敏感性高、重復(fù)性好,應(yīng)用上述分子檢測試劑建立的檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌并能鑒別兩菌的二聯(lián)PCR檢測應(yīng)用方法。本發(fā)明公開了一種單核細(xì)胞增生性李斯特菌與胎兒彎桿菌的檢測試劑,其特征在于包含能擴增單核細(xì)胞增生性李斯特菌hi J基因和胎兒彎桿菌16S rDNA基因的2對特異性引物,其中Pl和P2引物擴增hlj基因片段,擴增長度為320 bp;P3和P4引物擴增胎兒彎桿菌16S rDNA基因片段,擴增長度為763 bp ;所述引物序列為
Pl <210>1 ; P2 <210>2 ; P3 <210>3 ; P4: <210>4。一種單核細(xì)胞增生性李斯特菌與胎兒彎桿菌檢測試劑的制備方法,其特征在于主要包括以下步驟
(1)、單核細(xì)胞增生李斯特菌hlj基因和胎兒彎桿菌16SrDNA基因保守序列的選擇 從DNA序列數(shù)據(jù)庫中下載已經(jīng)公布的單核細(xì)胞增生李斯特菌^ilJ基因和胎兒彎桿菌16S rDNA基因序列,分別用基因序列分析軟件進(jìn)行序列比對,選擇兩個基因高度保守的靶序列, 其中單核細(xì)胞增生李斯特菌hlj基因擴增的靶序列為<210>5;胎兒彎桿菌16S rDNA基因擴增的靶序列為<210>6 ;
(2)、特異性引物的設(shè)計及合成
根據(jù)選擇的單核細(xì)胞增生李斯特菌hlj基因和胎兒彎桿菌16S rDNA基因的靶序列, 用PCR引物設(shè)計軟件分別進(jìn)行引物的設(shè)計,將設(shè)計的引物進(jìn)行最佳配對篩選試驗,得到2對最佳引物P1、P2及P3、P4,用全自動DNA合成儀進(jìn)行引物的合成,其中Pl和P2引物擴增 hlj基因片段,擴增長度為320 bp,P3和P4引物擴增胎兒彎桿菌16S rDNA基因片段,擴增長度為763 bp,所述引物序列為 Pl <210>1 ; P2 <210>2 ; P3 <210>3 ; P4: <210>4。一種單核細(xì)胞增生性李斯特菌的檢測試劑的應(yīng)用方法,其特征在于主要包括以下步驟(1)、樣品的處理:
取一定量的流產(chǎn)胎兒或胎盤病料,先用剪刀將其剪碎,再研磨至糊狀,滅菌,倒入 Eppendorf管中,置于冰上待用;
(2)、病料樣品DNA的提取
(3)、二聯(lián)PCR反應(yīng)
采用50 μ PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系的組成為10XPCR緩沖液5PL,25mmol/L MgCl2 5μ ,2. 5mmol/L dNTP 4μ , PI、Ρ2、Ρ3、和 Ρ4 (25pmol/^L)各 μ ,病料樣品中提取的DNA 2 6 μ ,Taq DNA聚合酶(5U/^L) 0. 3μ ,補加去離子水至50 μ 。最佳循環(huán)參數(shù)均為 96°C,150 s ;94°C,40 s;72°C,80 s;52°C,50 s,最后 72°C延伸 lOmin。(4)、結(jié)果判定
取二聯(lián)PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上,電泳后并用溴化乙錠染色,然后在紫外光透射儀下觀察拍照,以標(biāo)準(zhǔn)DNA marker (D,L-2000)作參考。若電泳后,若瓊脂糖凝膠中同時出現(xiàn)2 條核酸帶,其中一條片段大小為320 bp,另一條片段大小為763 bp,說明病料樣品中同時含有單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌;如果僅出現(xiàn)320 bp大小的核酸片段,則表明病料樣品中含有單核細(xì)胞增生李斯特菌;如果僅出現(xiàn)763 bp大小的核酸片段,則表明病料樣品中含有胎兒彎桿菌;若不出現(xiàn)任何核酸片段,則表明病料樣品中不含有單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌。步驟(1)中樣品的處理主要過程如下取一定量的流產(chǎn)胎兒或胎盤病料,先用剪刀將其剪碎,再用試管式研磨器用力研磨至糊狀,加適量的滅菌的PBSJgjA 1.5mL的 Eppendorf管中,置于冰上待用。步驟(2)中病料樣品DNA的提取主要過程如下取1. 5mL處理好的病料樣品溶液, 加入IOOPL 10% SDS和15μ 的蛋白酶K(20mg/mL),混勻,于37°C溫育30 min,然后再加入 100 μ 5mol/L NaCl,充分混勻。再加入80μ CTAB/NaCl溶液,混勻后再65°C溫育lOmin。 最后加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻,12000r/min離心5min,轉(zhuǎn)入一只新管中,加入2 體積的異丙醇,輕輕混合,12000r/min離心IOmin。將沉淀用ImL的70%乙醇洗滌后,離心棄乙醇.在室溫下干燥,在干燥的沉淀中加入適量的TE溶液。步驟(4)結(jié)果判定中所述過程具體是取IOPL二聯(lián)PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上, 75V電泳1小時,用溴化乙錠染色。本發(fā)明所述的快速檢測并鑒別單核細(xì)胞增生李斯特菌與胎兒彎桿菌性流產(chǎn)的二聯(lián)PCR檢測技術(shù)的由以下步驟組成
1、選擇單核細(xì)胞增生李斯特菌hlj和胎兒彎桿菌16SrDNA基因的靶序列,基因保守序列;
2、用primerpremier 5. 0軟件分別設(shè)計InlJ基因和16S rDNA基因特異性引物;
3、引物的合成采用乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法,使用全自動DNA合成儀進(jìn)行特異性引物的合成;
4、將合成的多對引物進(jìn)行最佳配對篩選試驗,確定候選引物;
5、經(jīng)過大量的PCR條件優(yōu)化,特異性、敏感性、重復(fù)性試驗,得到本發(fā)明所述的特異性強、擴增效率高、不相互干擾的引物,并建立快速檢測并能鑒別鑒別單核細(xì)胞增生李斯特菌與胎兒彎桿菌性流產(chǎn)的二聯(lián)PCR檢測技術(shù)。
本發(fā)明與常規(guī)的檢測技術(shù)相比具有如下優(yōu)點
本發(fā)明建立的鑒別單核細(xì)胞增生李斯特菌與胎兒彎桿菌性流產(chǎn)的分子試劑及方法具有快速、特異性強、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點,適合具備一定條件的動物疫病診斷和防控單位的應(yīng)用。本發(fā)明另一個優(yōu)點是通過聯(lián)合PCR技術(shù)可以快速、有效地鑒別單核細(xì)胞增生李斯特菌與胎兒彎桿菌性流產(chǎn),與常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)、生化試驗和免疫學(xué)檢測相比,具有省時、 省力的優(yōu)點。
圖1為電泳后樣品中同時含有單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌的實驗結(jié)果示意圖,M :D, L-2000, S :Sample。圖2為電泳后樣品中含有單核細(xì)胞增生李斯特菌的實驗結(jié)果示意圖,Μ: D, L-2000, S Sample ο圖3為電泳后樣品中含有含胎兒彎桿菌的實驗結(jié)果示意圖,M :D,L-2000,S Sample0圖4為電泳后樣品中不含有單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌的實驗結(jié)果示意圖,M :D, L-2000, S :Sample。圖5為27份牛羊流產(chǎn)臨床病料樣品檢測結(jié)果,其中M :D, L-2000 (2000,1000,750,500,250,100),其中 1 27 27 份臨床病料。
具體實施例方式實施例1
參照圖1一圖5,本實施例分以下步驟操作
1、單核細(xì)胞增生李斯特菌hlj基因和胎兒彎桿菌16S rDNA基因保守靶序列的選擇從GenBank中下載已經(jīng)公布的李斯特菌屬hlj基因(GenBank登錄號EU817301 EU817320, EU262930 E似6四33等)和胎兒彎桿菌16S rDNA基因序列(GenBank登錄號 AY621110, AJ306569, AJ306568, AF482990, AB301966, AB301967 等),將其轉(zhuǎn)化為擴展名為.seq文件后,分別用DNAstar進(jìn)行序列比對,選擇沒有發(fā)生基因變異、插入和缺失的高度保守序列,分別作為兩個基因保守的靶序列。2、特異性引物的設(shè)計及合成
將選擇的單核細(xì)胞增生李斯特菌hlj基因和胎兒彎桿菌16S rDNA基因的靶序列分別輸入primer premier 5. 0軟件程序中,分別設(shè)計兩種基因的特異性引物。^ilJ基因引物設(shè)計具體的要求為G+C含量為45 55%,引物長度18 22ntjm值72 80°C,擴增產(chǎn)物長度600 800 bp。16S rDNA基因引物設(shè)計要求與hlj基因大致相同,但擴增產(chǎn)物長度控制在300 400 bp之間。將得到的引物序列進(jìn)行引物之間的最佳配對篩選試驗,得到候選的引物對,采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法,用全自動DNA合成儀進(jìn)行候選引物的合成。3、單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌基因組DNA的提取
用液體培養(yǎng)基對標(biāo)準(zhǔn)的單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),然后取 1. 5mL培養(yǎng)物12000rpm離心anin,在沉淀中加入200 μ 的TE (ρΗ8. 0)緩沖液,反復(fù)吹打使之重新懸浮,加入IOOPL 10%SDS和15μ 的蛋白酶K (20mg/mL),混勻,于37°C溫育30min。然后再加入IOOPL 5mol/L NaCl,充分混勻,再加入80μ CTAB/NaCl溶液,混勻后再65°C 溫育lOmin。再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻,12000r/min離心5min,轉(zhuǎn)入一只新管中,加入2體積的異丙醇,輕輕混合直到DNA沉淀下來,沉淀可稍加離心。沉淀用ImL的 70%乙醇洗滌后,離心棄乙醇.在干燥的沉淀中加入適量的TE溶液溶解基因組DNA。4、單項PCR反應(yīng)條件的確定
采用50μ PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系的組成為10\ 0 緩沖液5口1^,25讓01/1 MgCl2 4 μ , 2. 5mmol/L dNTP 4 μ ,Ρ1、Ρ2或P3、P4(25 pmol/^L)各 μ ,提取的單核細(xì)胞增生李斯特菌或胎兒彎桿菌基因組DNA 2μ , Taq DNA聚合酶(1. 5U/^L) WL,補加去離子水至50μ 。 最佳循環(huán)參數(shù)為 96°C,150 s ;94°C,40 s ;72°C,80 s ;52°C,60 s,最后 72°C延伸 IOmin 5、二聯(lián)PCR的建立及條件的優(yōu)化 5. 1 二聯(lián)PCR的建立
采用50μ PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系的組成為10\ 0 緩沖液5口1^,25讓01/1 MgCl2 5μ ,2. 5mmol/L dNTP 4μ ,Ρ1、Ρ2、Ρ3 和 Ρ4 (25 pmol/^L)各 μ ,單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組和胎兒彎桿菌DNA各2 PL,Taq DNA聚合酶(5U/^L)0. 3μ ,補加去離子水至50 μ 。 最佳循環(huán)參數(shù)為 96°C,150 s ;94°C,40 s;72°C,80 s;52°C,50 s,最后 72°C延伸 IOmin005.2 二聯(lián)PCR擴增條件優(yōu)化
分別以單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌基因組DNA為模板,在聯(lián)合RT-PCR中對 hiJ基因和胎兒彎桿菌16S rDNA基因各自的引物量進(jìn)行優(yōu)化。實驗分兩步進(jìn)行第一步, 先測定hiJ基因單項PCR的最佳引物量;第二步,在二聯(lián)PCR反應(yīng)體系中分別加入hiJ基因最佳引物量及不同濃度的16S rDNA基因引物,進(jìn)行二聯(lián)PCR,以篩選出^ilJ-16S rDNA基因二聯(lián)PCR反應(yīng)體系中16S rDNA基因引物的最佳工作濃度和最佳的二聯(lián)PCR擴增模式。6、二聯(lián)PCR特異性、敏感性試驗
將沙門氏桿菌、布魯氏桿菌、衣原體、弓形蟲、單核細(xì)胞增生李斯特菌的基因組DNA、 PBS作為PCR模板,置于上述hi J-16S rDNA基因二聯(lián)PCR擴增系統(tǒng)中進(jìn)行擴增,觀察并記錄試驗結(jié)果。與此同時,用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,直接對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序,以驗證擴增的特異性。將單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌分別在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng), 在計數(shù)板上進(jìn)行細(xì)菌計數(shù),然后進(jìn)行KT1 10_12稀釋倍數(shù)稀釋,然后分別提取不同稀釋度的單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌基因組DNA,并加入已建立的二聯(lián)PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴增,以檢測其敏感度。7、二聯(lián)PCR穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗
將同一稀釋度的單核細(xì)胞增生李斯特菌盒胎兒彎桿菌提取的基因組DNA分為6管,按照上述優(yōu)化過的反應(yīng)條件做6個平行的反應(yīng),并重復(fù)6次,來測定二聯(lián)PCR反應(yīng)的穩(wěn)定性、 重復(fù)性。8、二聯(lián)PCR產(chǎn)物的檢測
取10 μ 1 二聯(lián)PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上,75V電泳1小時,用溴化乙錠染色,然后在紫外光透射儀下觀察拍照,以標(biāo)準(zhǔn)DNA marker (D,L-2000)作參考,記錄并分析結(jié)果。若電泳后,若瓊脂糖凝膠中同時出現(xiàn)2條核酸帶,其中一條片段大小約為320 bp,另一條片段大小約為763 bp,說明病料樣品中同時含有單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌(圖1);如果僅出現(xiàn)320 bp大小的核酸片段,則表明病料樣品中含有單核細(xì)胞增生李斯特菌(圖2);如果僅出現(xiàn)763 bp大小的核酸片段(圖3),則表明病料樣品中含有胎兒彎桿菌;若不出現(xiàn)任何核酸片段,則表明病料樣品中不含有單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌(圖4)。
實施例2
本實施例與實施實施例1不同地方在于 1、二聯(lián)PCR試劑標(biāo)準(zhǔn)化
根據(jù)上述試驗結(jié)果,按照反應(yīng)條件優(yōu)化,對試劑進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。標(biāo)準(zhǔn)化試劑組成為
權(quán)利要求
1.一種單核細(xì)胞增生性李斯特菌與胎兒彎桿菌的檢測試劑,其特征在于包含能擴增單核細(xì)胞增生性李斯特菌hiJ基因和胎兒彎桿菌16S rDNA基因的2對特異性引物,其中 Pl和P2引物擴增hlj基因片段,擴增長度為320 bp ;P3和P4引物擴增胎兒彎桿菌16S rDNA基因片段,擴增長度為763 bp ;所述引物序列為Pl <210>1 ; P2 <210>2 ; P3 <210>3 ; P4: <210>4。
2.—種單核細(xì)胞增生性李斯特菌與胎兒彎桿菌檢測試劑的制備方法,其特征在于主要包括以下步驟(1)、單核細(xì)胞增生李斯特菌hlj基因和胎兒彎桿菌16SrDNA基因保守序列的選擇 從DNA序列數(shù)據(jù)庫中下載已經(jīng)公布的單核細(xì)胞增生李斯特菌^ilJ基因和胎兒彎桿菌16S rDNA基因序列,分別用基因序列分析軟件進(jìn)行序列比對,選擇兩個基因高度保守的靶序列, 其中單核細(xì)胞增生李斯特菌hlj基因擴增的靶序列為<210>5;胎兒彎桿菌16S rDNA基因擴增的靶序列為<210>6 ;(2)、特異性引物的設(shè)計及合成根據(jù)選擇的單核細(xì)胞增生李斯特菌hlj基因和胎兒彎桿菌16S rDNA基因的靶序列, 用PCR引物設(shè)計軟件分別進(jìn)行引物的設(shè)計,將設(shè)計的引物進(jìn)行最佳配對篩選試驗,得到2對最佳引物P1、P2及P3、P4,用全自動DNA合成儀進(jìn)行引物的合成,其中Pl和P2引物擴增 hlj基因片段,擴增長度為320 bp,P3和P4引物擴增胎兒彎桿菌16S rDNA基因片段,擴增長度為763 bp,所述引物序列為 Pl <210>1 ; P2 <210>2 ; P3 <210>3 ; P4: <210>4。
3.—種單核細(xì)胞增生性李斯特菌的檢測試劑的應(yīng)用方法,其特征在于主要包括以下步驟(1)、樣品的處理:取一定量的流產(chǎn)胎兒或胎盤病料,先用剪刀將其剪碎,再研磨至糊狀,滅菌,倒入 Eppendorf管中,置于冰上待用;(2)、病料樣品DNA的提??;(3)、二聯(lián)PCR反應(yīng)采用50 μ PCR反應(yīng)體系,PCR反應(yīng)體系的組成為10XPCR緩沖液5PL,25mmol/L MgCl2 5μ ,2. 5mmol/L dNTP 4μ , PI、Ρ2、Ρ3、和 Ρ4 (25pmol/^L)各 μ ,病料樣品中提取的DNA 2 6 μ , Taq DNA聚合酶(5U/^L)0. 3μ ,補加去離子水至50 PL ;最佳循環(huán)參數(shù)均為 96°C,150 s;94°C,40 s;72°C,80 s;52°C,50 s,最后 72°C延伸 IOmin ;(4)、結(jié)果判定取二聯(lián)PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上,電泳后并用溴化乙錠染色,然后在紫外光透射儀下觀察拍照,以標(biāo)準(zhǔn)DNA marker (D, L-2000)作參考,若電泳后,若瓊脂糖凝膠中同時出現(xiàn)2條核酸帶,其中一條片段大小為320 bp,另一條片段大小為763 bp,說明病料樣品中同時含有單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌;如果僅出現(xiàn)320 bp大小的核酸片段,則表明病料樣品中含有單核細(xì)胞增生李斯特菌;如果僅出現(xiàn)763 bp大小的核酸片段,則表明病料樣品中含有胎兒彎桿菌;若不出現(xiàn)任何核酸片段,則表明病料樣品中不含有單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌。
4.如權(quán)利要求3所述的單核細(xì)胞增生性李斯特菌的檢測試劑的應(yīng)用方法,其特征在于步驟(1)中樣品的處理主要過程如下取一定量的流產(chǎn)胎兒或胎盤病料,先用剪刀將其剪碎,再用試管式研磨器用力研磨至糊狀,加適量的滅菌的PBSjgjA 1. 5mL的Eppendorf管中,置于冰上待用。
5.如權(quán)利要求3或4所述的單核細(xì)胞增生性李斯特菌的檢測試劑的應(yīng)用方法,其特征在于步驟(2)中病料樣品DNA的提取主要過程如下取1. 5mL處理好的病料樣品溶液,加入 ΙΟΟμ 10% SDS和15μ 的蛋白酶K (20mg/mL),混勻,于37°C溫育30 min,然后再加入100 μ 5mol/L NaCl,充分混勻,再加入80μ CTAB/NaCl溶液,混勻后再65°C溫育lOmin,最后加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻,12000r/min離心5min,轉(zhuǎn)入一只新管中,加入2體積的異丙醇,輕輕混合,12000r/min離心lOmin,將沉淀用ImL的70%乙醇洗滌后,離心棄乙醇,在室溫下干燥,在干燥的沉淀中加入適量的TE溶液。
6.如權(quán)利要求3或4所述的單核細(xì)胞增生性李斯特菌的檢測試劑的應(yīng)用方法,其特征在于步驟(4)結(jié)果判定中所述過程具體是取IOPL 二聯(lián)PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上,75V 電泳1小時,用溴化乙錠染色。
7.如權(quán)利要求5所述的單核細(xì)胞增生性李斯特菌的檢測試劑的應(yīng)用方法,其特征在于步驟(4)結(jié)果判定中所述過程具體是取IOPL 二聯(lián)PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上,75V電泳 1小時,用溴化乙錠染色。
全文摘要
本發(fā)明公開了單核細(xì)胞增生性李斯特菌與胎兒彎桿菌的檢測試劑,包含能擴增單核細(xì)胞增生性李斯特菌InlJ基因和胎兒彎桿菌16SrDNA基因的2對特異性引物;公開了其制備方法單核細(xì)胞增生李斯特菌InlJ基因和胎兒彎桿菌16SrDNA基因保守序列的選擇;特異性引物的設(shè)計及合成。還公開了應(yīng)用方法包括樣品的處理;病料樣品DNA的提??;二聯(lián)PCR反應(yīng);結(jié)果判定。本發(fā)明建立的鑒別單核細(xì)胞增生李斯特菌與胎兒彎桿菌性流產(chǎn)的分子試劑及方法具有快速、特異性強、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點,通過聯(lián)合PCR技術(shù)可以快速、有效地鑒別單核細(xì)胞增生李斯特菌與胎兒彎桿菌性流產(chǎn),具有省時、省力的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/04GK102363811SQ201110359470
公開日2012年2月29日 申請日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者丁波, 喬軍, 孟慶玲, 張再超, 楊麗紅, 田振中, 蔡擴軍, 陳創(chuàng)夫 申請人:石河子大學(xué)