專利名稱：胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及哺乳動(dòng)物的胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)方法，特別是小鼠胚胎期腎臟的離體器官培養(yǎng)。
背景技術(shù)：
體外器官培養(yǎng)屬于組織培養(yǎng)的一種高級(jí)形式，它能再現(xiàn)器官的發(fā)育過(guò)程，模擬器官在不同狀態(tài)及條件下的功能狀態(tài)，是是了解器官發(fā)育過(guò)程，研究疾病致病機(jī)制及藥物篩選的重要技術(shù)手段。目前腎臟體外器官培養(yǎng)目前有由Mxen L等于1966年發(fā)表于雜志 InternationalJournal of Cancer _t Cell contact and cell adhesion during tissue organization 1966May 15 ； 1 (3) :271-90. —文中，他們利用 3. 5cm 培養(yǎng)皿，放入 2ml 培養(yǎng)基，將孔徑5um左右的聚碳酸脂濾膜漂在培養(yǎng)基上或者用不銹鋼網(wǎng)做支架支撐。然后將小鼠胚胎腎臟放置于濾膜上，置于氣液交界處培養(yǎng)(參見(jiàn)附圖1、圖幻。最新的是2010 年，Jamie A. Davies 在雜志 PLoSOne 中發(fā)表的 A novel, low-volume method for organ culture of embryonic kidneys thatallows development of cortico-medullary anatomical organization 2010Mayl0 ；5 (5) :el0550. 一文提出了小體積培養(yǎng)方法。同樣是利用3. 5cm培養(yǎng)皿，改進(jìn)之處在于利用孔底面積1平方厘米的硅膠圈和22mmX22mm的玻璃片組裝培養(yǎng)孔，將胚胎腎臟直接培養(yǎng)在玻璃片上，加入85ul體積培養(yǎng)基培養(yǎng)，硅膠圈和培養(yǎng)皿之間的空隙用帶抗生素的磷酸鹽緩沖液填充維持培養(yǎng)皿濕度(參見(jiàn)附圖3、圖4)。但是上述兩種方法均受到使用需要使用特殊材料和占用較大空間限制，另外也未考慮到培養(yǎng)基體積和成分變化對(duì)腎臟培養(yǎng)產(chǎn)生的影響，阻礙了胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用以及其在藥物篩選中的運(yùn)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題主要是現(xiàn)有培養(yǎng)方法需要特殊材料和占用空間大的缺陷。本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題提供的技術(shù)方案是提供一種哺乳動(dòng)物胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)方法。該方法包括以下步驟a、在多孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中放入尺寸與之適配的承載片，在培養(yǎng)孔底部構(gòu)建出培養(yǎng)空間；b、將取得的哺乳動(dòng)物胚胎腎臟放置于承載片上，加入培養(yǎng)基，使腎臟處于培養(yǎng)基和空氣的液-氣交界處；c、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后每1到2天進(jìn)行培養(yǎng)基換液。其中，上述方法步驟a所述的多孔培養(yǎng)板為M孔培養(yǎng)板。其中，上述方法中在在使用的多孔培養(yǎng)板的各孔間隙加入濕度平衡液，以減緩培養(yǎng)基揮發(fā)。
其中，上述方法步驟b中加入培養(yǎng)基后調(diào)整承載片于培養(yǎng)孔的底部的中心，哺乳動(dòng)物胚胎腎臟或胚胎腎臟原基位于承載片的中部。其中，上述方法c步驟中所述的培養(yǎng)基采用半量遞增的方式換液，即每次換液時(shí)保留上次培養(yǎng)基體積的一半在原培養(yǎng)孔中，然后將比上次培養(yǎng)基體積的一半按體積分?jǐn)?shù)還多增加6% -12%的新鮮培養(yǎng)基加入培養(yǎng)孔。進(jìn)行10天培養(yǎng)時(shí)，第1-2天按上次培養(yǎng)基體積的一半加入，第9-10天按上次培養(yǎng)基體積的一半加入最佳。其中，上述方法步驟a中所述的承載片為透明玻璃圓片。其中，上述方法中所述濕度平衡液為無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水。其中，上述方法中所述胚胎腎臟為分離的胚胎期10 13天的小鼠腎臟原基。其中，上述方法中所述的腎臟放置方式為將腎臟平放。即輸尿管走向面與承載片平面平行的方式放置于承載片上。本發(fā)明方法的有益效果在于使用本發(fā)明方法進(jìn)行胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)無(wú)需昂貴進(jìn)口濾膜或者硅膠圈等進(jìn)口材料，成本大大降低；克服了目前所有方法的占用空間大缺點(diǎn)，使用本發(fā)明放在運(yùn)用利用M孔培養(yǎng)板可以將每個(gè)腎臟培養(yǎng)時(shí)的占用面積由38. 5平方厘米減少到1. 5平方厘米左右，大大提高了空間利用率；具有培養(yǎng)基用量少的優(yōu)點(diǎn)，利用 M孔培養(yǎng)板時(shí)每孔只需150ul左右的培養(yǎng)基培養(yǎng)即可；體系組裝簡(jiǎn)單，操作便捷，只需將處理好的承載片放入培養(yǎng)孔，放置胚胎腎臟，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)即可，簡(jiǎn)單易行且污染環(huán)節(jié)大大減少，有利于培養(yǎng)成功率的提高；培養(yǎng)結(jié)果良好，胚胎腎臟的培養(yǎng)時(shí)間能到10天以上，可提高到12天，并可見(jiàn)輸尿管平滑肌自主性收縮；使用承載片培養(yǎng)導(dǎo)致后續(xù)操作方便，可進(jìn)行原位雜交，免疫熒光等后繼實(shí)驗(yàn)操作操作。本發(fā)明方法還另外提供了一種優(yōu)選的培養(yǎng)基后繼換液方案，使培養(yǎng)效果更好，體外器官發(fā)育更加穩(wěn)定。本發(fā)明方法能大量低成本地獲得穩(wěn)定發(fā)育且便于后繼操作的體外培養(yǎng)腎臟器官，還能滿足大規(guī)模藥物篩選的需求。


圖1、傳統(tǒng)的胚胎腎臟體外器官培養(yǎng)兩種方法的體系示意圖之一。1、培養(yǎng)基；2、聚碳酸脂濾膜；3、.胚胎腎臟原基；4、不銹鋼網(wǎng)支架。圖2、傳統(tǒng)的胚胎腎臟體外器官培養(yǎng)兩種方法的體系示意圖之二。1、培養(yǎng)基；2、聚碳酸脂濾膜；3、.胚胎腎臟原基；4、不銹鋼網(wǎng)支架。圖3、已報(bào)導(dǎo)的小體積胚胎腎臟體外器官培養(yǎng)體系(培養(yǎng)皿)示意圖，示縱剖面。
1、培養(yǎng)基；2、硅膠圈；3、胚胎腎臟原基；4、22mmX22mm玻璃片；5、1XPBS。圖4、已報(bào)導(dǎo)的小體積胚胎腎臟體外器官培養(yǎng)體系(培養(yǎng)皿)示意圖，俯視。1、培養(yǎng)基；2、硅膠圈；3、胚胎腎臟原基；4、22mmX22mm玻璃片；5、1X PBS。圖5、本發(fā)明的培養(yǎng)方法采用的胚胎腎臟體外器官體系示意圖。1、培養(yǎng)基；2、承載片；3、胚胎腎臟；4、培養(yǎng)孔；5、濕度平衡液，6M孔培養(yǎng)板。圖6.本發(fā)明的承載片-多孔平板法的胚胎腎臟體外器官培養(yǎng)裝置1.培養(yǎng)基；
2.承載片；3.胚胎腎臟；圖7.本發(fā)明的承載片-多孔平板法的胚胎腎臟體外器官培養(yǎng)裝置1.培養(yǎng)基； 2.承載片；3.胚胎腎臟；
圖8、本發(fā)明的培養(yǎng)方法使用M孔板時(shí)，優(yōu)化的培養(yǎng)基換液體積方案。圖9、本發(fā)明方法胚胎腎體外培養(yǎng)效果及原位雜交和免疫熒光檢測(cè)。圖中第一、二排顯示的是小鼠胚胎期12. 5天的腎臟進(jìn)行培養(yǎng)十天的效果圖，能看得見(jiàn)明顯的輸尿管分支及腎單位各階段前體結(jié)果的形成。培養(yǎng)效果良好，并可見(jiàn)輸尿管自主性收縮。第三排為分別用原位雜交(in situ)和免疫熒光檢測(cè)腎單位標(biāo)志物PAX8和輸尿管及遠(yuǎn)端小管標(biāo)志物E-cadherin 型鈣粘附蛋白)的表達(dá)，黑色和白色分別顯示陽(yáng)性信號(hào)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了本發(fā)明方法培養(yǎng)的腎臟發(fā)育良好，可應(yīng)用于多種方式檢測(cè)。圖10、用現(xiàn)有方法培養(yǎng)了 10天后免疫熒光檢測(cè)的結(jié)果，示輸尿管(來(lái)源于Jamie A. Davies 在雜志 PLoS One 中發(fā)表的 A novel, low-volume method for organ culture of embryonickidneys that allows development of cortico—medullary anatomical organization 20IOMay 10 ；5 (5) :el0550.)，本發(fā)明方法6天培養(yǎng)的結(jié)果就和其10天的培
養(yǎng)結(jié)果基本一致。圖11、用本發(fā)明方法培養(yǎng)得到的體外培養(yǎng)胚胎腎臟的SiRNA轉(zhuǎn)染效果圖。該圖顯示用EGFP綠色熒光轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎期10. 5和11. 5天取出的腎臟轉(zhuǎn)染CY5紅色熒光標(biāo)記的siRNA效果圖，第一列為鏡下腎臟形態(tài)圖，第二列為綠色熒光表達(dá)圖，第三列為紅色熒光圖，兩張圖顯示了絕大部分細(xì)胞轉(zhuǎn)染進(jìn)了 siRNA。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖通過(guò)具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明提供了一種胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)方法，包括以下步驟a、在多孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中放入尺寸與之適配的承載片，在培養(yǎng)孔底部構(gòu)建出培養(yǎng)空間；b、將取得的哺乳動(dòng)物胚胎腎臟或胚胎腎臟原基放置于承載片上，加入培養(yǎng)基，使腎臟處于培養(yǎng)基和空氣的氣液交界面，僅有一層薄液膜覆蓋在上面，這與現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法一致；即使腎臟上表面有一層液膜，不是完全裸露于空氣中。c、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后每天進(jìn)行培養(yǎng)基換液。本發(fā)明方法步驟a所述的多孔培養(yǎng)板為M孔培養(yǎng)板。本發(fā)明方法在使用的多孔培養(yǎng)板的各孔間隙加入濕度平衡液，以減緩培養(yǎng)基揮發(fā)。本發(fā)明方法步驟b中加入培養(yǎng)基后調(diào)整承載片于培養(yǎng)孔的底部的中心，哺乳動(dòng)物胚胎腎臟或胚胎腎臟原基位于承載片的中部。本發(fā)明方法c步驟中所述的培養(yǎng)基采用半量遞增的方式換液，即每次換液時(shí)保留上次培養(yǎng)基體積的一半在原培養(yǎng)孔中，然后將比上次培養(yǎng)基體積的一半還按體積分?jǐn)?shù)多增加6% -12%的新鮮培養(yǎng)基加入培養(yǎng)孔。優(yōu)選的，第1-2天按上次培養(yǎng)基體積的一半加入；進(jìn)行10天培養(yǎng)時(shí)，第9-10天按上次培養(yǎng)基體積的一半加入最佳。本發(fā)明方法步驟a中所述的承載片可為透明玻璃片。承載片尺寸應(yīng)小于孔徑大小，大小為培養(yǎng)孔的50-80%大小，形狀匹配。最好與培養(yǎng)孔一樣為圓形的透明玻璃圓片。 承載片一般應(yīng)貼在底部。
本發(fā)明方法中所述濕度平衡液為無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水。本發(fā)明方法中所述胚胎腎臟為分離的胚胎期10 13天的小鼠腎臟原基。本發(fā)明方法中所述的腎臟放置方式為將腎臟原基平放，即橫切面放置于承載片上。當(dāng)然，在本領(lǐng)域中，本發(fā)明方法中使用的各種試劑和材料，都應(yīng)為無(wú)菌的，操作也應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。本發(fā)明方法使用的承載片可以是各種材質(zhì)的適于組織細(xì)胞培養(yǎng)的薄片，最常用和最優(yōu)的是透明玻璃圓片。承載片使用前應(yīng)進(jìn)行充分的清洗和滅菌處理，在需要的情況下，可以用合適的基質(zhì)預(yù)處理，如多聚賴氨酸，明膠或者膠原等。本發(fā)明方法中使用的多孔培養(yǎng)板可以是常規(guī)的能應(yīng)用于細(xì)胞組織培養(yǎng)的普通M 孔板，其孔最好是底面積在1 3平方厘米的平底圓孔。最常見(jiàn)的是標(biāo)準(zhǔn)的M孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，材質(zhì)是玻璃或者塑料均可。本發(fā)明方法中使用的濕度平衡液必須無(wú)菌，無(wú)毒。最好用無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水，根據(jù)使用多孔培養(yǎng)板確定用量，一般的標(biāo)準(zhǔn)M孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板使用的濕度平衡液體積應(yīng)大于200ul，最好是500ul。本發(fā)明方法中使用的胚胎腎臟一般為實(shí)驗(yàn)用的小鼠的胚胎。實(shí)驗(yàn)小鼠胚胎腎臟可以為胚胎期10 13天的腎臟原基(腎臟原基是本領(lǐng)域就發(fā)育早期的胚胎腎臟的一種通用叫法)。而每個(gè)承載片上可放置1 4個(gè)胚胎腎臟，即1個(gè)孔中最多可培養(yǎng)4個(gè)小鼠胚胎腎臟。胚胎腎臟最好平放，即按橫切面水平放置于承載片上以便腎臟原基能發(fā)育成形態(tài)良好的腎臟。在實(shí)際操作過(guò)程中，只要輸尿管還在，放下去就是平放的。本發(fā)明方法中使用培養(yǎng)基可為本領(lǐng)域通用的各種細(xì)胞培養(yǎng)基，比如dulbecco’ s modifiedeagle，s medium (DMEM，通用的培養(yǎng)基，如商家hvitrogen貨號(hào)11965的產(chǎn)品，或也可參考網(wǎng)上公開(kāi)的http //baike. baidu. com/view/3501452. htm 記載的 DMEM(H)細(xì)胞培養(yǎng)基(粉末型)成分配制)或者fegle，s minimal essential medium(EMEM，通用的培養(yǎng)基，配方公知。然后在選擇的培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)為5-20%的FBS(胎牛血清)或者 F12營(yíng)養(yǎng)因子anvitrogen公司產(chǎn)品，品名營(yíng)養(yǎng)因子混合物，貨號(hào)21700)，一般還可添加按終度0. lmg/ml添加抗生素penicillin或str印tomycin(青霉素或鏈霉素)防止污染。本發(fā)明方法中的培養(yǎng)條件為通用細(xì)胞培養(yǎng)條件。一般溫度為36°C 38°C;最好在 37°C下，體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)。本發(fā)明方法中使用的培養(yǎng)基可每隔M 48小時(shí)，去掉舊培養(yǎng)基并加入等體積新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。還可以采用的優(yōu)選的換液方式是采用半量遞增的方式換液，即每次換液時(shí)保留上次培養(yǎng)基體積的一半在原培養(yǎng)孔中，然后將比上次培養(yǎng)基體積的一半還按體積分?jǐn)?shù)多增加 6% -12%的新鮮培養(yǎng)基加入培養(yǎng)孔。若用標(biāo)準(zhǔn)M孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)的M孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板時(shí)，培養(yǎng)基體積可用每孔130-170ul，最佳的體積應(yīng)為每孔150ul。那么是換液時(shí)將比上次培養(yǎng)基體積的一半多2 IOul的新鮮培養(yǎng)基加入培養(yǎng)孔。優(yōu)選5 10ul，最佳為 8ul。實(shí)施例一使用本發(fā)明方法培養(yǎng)Balb/c小鼠胚胎期11. 5天腎臟。1、準(zhǔn)備承載片用直徑12mm的玻璃圓蓋片作為承載片，購(gòu)買于海門市華凱實(shí)驗(yàn)玻璃儀器有限公司。首先，用蒸餾水配制體積分?jǐn)?shù)為的鹽酸溶液，在室溫?fù)u動(dòng)清洗圓蓋片一個(gè)小時(shí)。用蒸餾水清洗后，放入體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精溶液中，搖動(dòng)清洗過(guò)夜。用IOcm 玻璃平皿盛放清洗后的圓蓋片，浙干液體后放入高溫蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121°C滅菌20分鐘。烘干后置于超凈工作臺(tái)備用。2、組裝培養(yǎng)裝置用無(wú)菌的鑷子夾取處理好的圓蓋片放置于無(wú)菌的M孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中中。無(wú)菌的M孔培養(yǎng)板為購(gòu)置于Costar (康寧公司，美國(guó))的35M型組織培養(yǎng)板。3、獲得胚胎期11. 5天小鼠腎臟以受孕Balb/c母鼠，來(lái)源于四川大學(xué)華西醫(yī)院基因工程小鼠中心SPF級(jí)(無(wú)特殊病原菌)動(dòng)物房，陰道見(jiàn)栓當(dāng)天為0. 5天開(kāi)始計(jì)算胚胎發(fā)育時(shí)間，在第11. 5天從動(dòng)物飼養(yǎng)房取出孕鼠。引頸法處死孕鼠后，用酒精消毒孕鼠及解剖器械。取出小鼠胚胎后于冰上預(yù)冷的解剖液(IX PBS，HBSS或者DMEM)中解剖，體視鏡下取出腎臟原基，用200ul吸頭轉(zhuǎn)移到裝有培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS) 1. 5ml的EP管中。4、在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用200ul的移液器轉(zhuǎn)移腎臟原基到培養(yǎng)孔，每孔一個(gè)。用移液器吸走培養(yǎng)孔中殘余培養(yǎng)基并加入150ul培養(yǎng)基。用酒精燈高溫滅菌尖鑷子，待冷后移動(dòng)輕輕移動(dòng)腎臟原基至園蓋片中部，并調(diào)整園蓋片位置使得腎臟原基位于培養(yǎng)孔正中。培養(yǎng)體系的構(gòu)建參見(jiàn)圖5、圖6、圖7的示意圖。5、小心將種好的腎臟放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱于37°C，5% CO2中培養(yǎng)M小時(shí)。6、用移液器將培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基全部轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)換液孔，再用移液器回吸75ul培養(yǎng)基到培養(yǎng)孔，并丟棄剩余培養(yǎng)基。7、加入75+5ul的新鮮培養(yǎng)基到培養(yǎng)孔，混勻后于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時(shí)。8、然后同步驟6和7進(jìn)行半量遞增換液留SOul原培養(yǎng)基+SOul新培養(yǎng)基。9、每隔M小時(shí)換液。換液體積方案如圖8所示。10、培養(yǎng)10天效果(附圖9)。圖9中第一、二排顯示的是小鼠胚胎期12. 5天的腎臟進(jìn)行培養(yǎng)十天中每天的情況，能看得見(jiàn)明顯的輸尿管分支及腎單位各階段前體結(jié)果的形成，并可第七、八天開(kāi)始出現(xiàn)輸尿管平滑肌自主性收縮，說(shuō)明了輸尿管感受到液體刺激進(jìn)行排尿，和生理狀況一樣，說(shuō)明培養(yǎng)腎臟接近體內(nèi)情況，有部分生理功能。而且的輸尿管分支和腎單位還能充分的形成，如圖9的136小時(shí)可見(jiàn)輸尿管分支很充分，另免疫熒光結(jié)果顯示的輸尿管分支也很充分，結(jié)果與最新報(bào)道的培養(yǎng)方法的十天的結(jié)果(圖10)相似，質(zhì)量相近。第三排為分別用原位雜交和免疫熒光檢測(cè)腎單位標(biāo)志物PAX8和輸尿管及遠(yuǎn)端小管標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，黑色和白色分別顯示陽(yáng)性信號(hào)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了本發(fā)明方法培養(yǎng)的腎臟發(fā)育良好，可應(yīng)用于多種方式檢測(cè)。經(jīng)多次試驗(yàn)，利用上述方法使用E12. 5天的腎臟進(jìn)行體外培養(yǎng)幾乎是100%成功率，而Ell. 5天則有75%左右的成功率，一個(gè)孔可培養(yǎng)培養(yǎng)1個(gè)到4個(gè)腎臟，一般采用1個(gè)孔1個(gè)的方式，24孔平板所有孔用完至少可培養(yǎng)M個(gè)，最佳是使用8個(gè)內(nèi)圈的孔進(jìn)行培養(yǎng)。 24孔板(13cmX8. 5cmX2. 5cm養(yǎng)M個(gè)即約11立方厘米空間1個(gè)腎臟，而現(xiàn)有技術(shù)最小是一般3. 5cmX3. 5cmX2. 5cm養(yǎng)一個(gè)，即 31立方厘米空間1個(gè)腎臟，另外本方案M個(gè)腎臟在一起可聯(lián)系同環(huán)境同時(shí)操作，生長(zhǎng)一致性更好，也更便于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模藥物篩選。實(shí)施例二本發(fā)明培養(yǎng)方法得到的胚胎腎臟的轉(zhuǎn)染
1、準(zhǔn)備承載片直徑12mm的玻璃圓蓋片作承載片，購(gòu)買于海門市華凱實(shí)驗(yàn)玻璃儀器有限公司。首先，用蒸餾水配制體積分?jǐn)?shù)為的鹽酸溶液，在室溫?fù)u動(dòng)清洗圓蓋片一個(gè)小時(shí)。用蒸餾水清洗后，放入體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精溶液中，搖動(dòng)清洗過(guò)夜。用IOcm玻璃平皿盛放清洗后的圓蓋片，浙干液體后放入高溫蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121°C滅菌20分鐘。烘干后置于超凈工作臺(tái)備用。2、組裝培養(yǎng)裝置用無(wú)菌的鑷子夾取處理好的圓蓋片放置于無(wú)菌的M孔培養(yǎng)板中。無(wú)菌的M孔培養(yǎng)板為購(gòu)置于Costar公司的35M型號(hào)組織培養(yǎng)板。3、獲得胚胎期11. 5天小鼠腎臟以EGFP轉(zhuǎn)基因母鼠(需要簡(jiǎn)要說(shuō)明該鼠的來(lái)源。(增強(qiáng)的綠色熒光蛋白EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠由美國(guó)The Jackson Laboratory構(gòu)建，貨號(hào) 003115)陰道見(jiàn)栓當(dāng)天為0.5天開(kāi)始計(jì)算胚胎發(fā)育時(shí)間，在第11. 5天從動(dòng)物飼養(yǎng)房取出孕鼠。引頸法處死孕鼠后，用酒精消毒孕鼠及解剖器械。取出小鼠胚胎后于冰上預(yù)冷的解剖液(IX PBS, HBSS或者DMEM)中解剖，體視鏡下取出腎臟原基，用200ul吸頭轉(zhuǎn)移到裝有培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS) 1. 5ml 的 EP 管中。4、用49ul培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移腎臟到200ul PCR管中，在避強(qiáng)光環(huán)境下加入Iul 20umol/ L修飾后的Cy5-siRNA(siRNA序列為GCUCUUACGAUGAUA，由廣州銳博生物合成并提供商品化修飾)。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)。5、在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用200ul的移液器轉(zhuǎn)移腎臟原基到培養(yǎng)孔，每孔一個(gè)。用移液器吸走殘余培養(yǎng)基并加入150ul培養(yǎng)基。用酒精燈高溫滅菌尖鑷子，待冷后移動(dòng)輕輕移動(dòng)腎臟原基至園蓋片中部，并調(diào)整園蓋片位置使得腎臟原基位于培養(yǎng)孔正中。6、小心將種好的腎臟放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱于37°C，5% CO2中培養(yǎng)1天后，用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照，可檢測(cè)很高的轉(zhuǎn)染效率。效果見(jiàn)圖11。
權(quán)利要求
1.哺乳動(dòng)物胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟a、在多孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中放入尺寸與之適配的承載片，在培養(yǎng)孔底部構(gòu)建出培養(yǎng)空間；b、將取得的哺乳動(dòng)物胚胎腎臟放置于承載片上，加入培養(yǎng)基，使腎臟處于培養(yǎng)基和空氣的氣-液交界處；c、36°C 38°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后每1到2天進(jìn)行培養(yǎng)基換液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)方法，其特征在于步驟a 所述的多孔培養(yǎng)板為M孔培養(yǎng)板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)方法，其特征在于在使用多孔培養(yǎng)板的各孔間隙加入濕度平衡液，以減緩培養(yǎng)基揮發(fā)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)方法，其特征在于步驟 b中加入培養(yǎng)基后調(diào)整承載片于培養(yǎng)孔的底部的中心，哺乳動(dòng)物胚胎腎臟位于承載片的中部。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)方法，其特征在于步驟c 中所述的培養(yǎng)基采用半量遞增的方式換液，即每次換液時(shí)保留上次培養(yǎng)基體積的一半在原培養(yǎng)孔中，然后將比上次培養(yǎng)基體積的一半按體積分?jǐn)?shù)還多增加6%-12%的新鮮培養(yǎng)基加入培養(yǎng)孔。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)方法，其特征在于步驟a 所述的承載片為透明玻璃圓片。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)方法，其特征在于所述濕度平衡液為無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)方法，其特征在于所述胚胎腎臟為分離的胚胎期10 13天的小鼠腎臟原基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)方法，其特征在于將腎臟平放。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及哺乳動(dòng)物的胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)方法，特別是小鼠胚胎期腎臟的離體器官培養(yǎng)。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題主要是現(xiàn)有培養(yǎng)方法需要特殊材料和占用空間大的缺陷。本發(fā)明技術(shù)方案是胚胎腎臟的體外器官培養(yǎng)方法，包括以下步驟a、在多孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中放入尺寸與之適配的承載片，在培養(yǎng)孔底部構(gòu)建出培養(yǎng)空間；b、將取得的哺乳動(dòng)物胚胎腎臟或胚胎腎臟原基放置于承載片上，加入培養(yǎng)基，使腎臟處于培養(yǎng)基和空氣的交界處；c、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后每1到2天進(jìn)行培養(yǎng)基換液。使用本發(fā)明方法能大量低成本地獲得穩(wěn)定發(fā)育且便于后繼操作的體外培養(yǎng)腎臟器官，還能滿足大規(guī)模藥物篩選的需求。
文檔編號(hào)C12N5/073GK102391983SQ20111034524
公開(kāi)日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月4日
發(fā)明者呂小巖, 周欽, 孫環(huán), 陳鐵林, 魏于全 申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西醫(yī)院