專利名稱：酰胺鍵交聯(lián)小分子量pei衍生物、制備方法、用途及復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PEI衍生物、制備方法、用途及復(fù)合物，具體涉及一種酰胺鍵小分子量 PEI交聯(lián)衍生物、制備方法、用途及其復(fù)合物。
背景技術(shù)：
基因療法是在先天和后天的多種疾病治療中的一種有力工具，因?yàn)樗梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)細(xì)胞中的生物活性蛋白的表達(dá)來預(yù)防，治療，甚至治愈疾病?；蛑委熢谄浒l(fā)展過程中遇到了一系列技術(shù)瓶頸，其中最重要的瓶頸之一是基因物質(zhì)安全有效的體內(nèi)輸送。目前常用的基因輸送載體可以分為重組病毒載體及人工合成載體(即非病毒載體)。病毒載體雖然顯示了高的轉(zhuǎn)染效率，但由于病毒的變異會引起潛在的致病危險，并且病毒表面成分會引起人體免疫反應(yīng)，同時病毒的制備和純化困難且攜載基因容量小。因此非病毒基因載體被認(rèn)為是更理想的基因物質(zhì)輸送載體。傳統(tǒng)的生物可降解高分子材料(如PGA、PLA、PLGA)不具有基因內(nèi)吞逃逸功能，所以轉(zhuǎn)染率不高，改性天然高分子如殼聚糖，其結(jié)構(gòu)在設(shè)計改造上具有局限性，而以聚乙烯亞胺(PEI)為代表的能夠幫助基因物質(zhì)內(nèi)吞逃逸的聚陽離子則因高分子量而引起細(xì)胞毒性過大。PEI是目前研究最為廣泛的聚陽離子非病毒載體，分支狀分子量為25 kDa的PEI (PEI 25kDa)轉(zhuǎn)染效率最高，但是PEI 25kDa同時因其烷基骨架無法降解而導(dǎo)致細(xì)胞累計毒性較大。多數(shù)的國內(nèi)外研究集中在可降解的PEI交聯(lián)衍生物。最早俄亥俄州立大學(xué)的Robert J. Lee在結(jié)合化學(xué)雜志上(Bioconjugate Chemistry2001；12:989-9.發(fā)表'Efficient gene transfer using reversibly cross-linked low molecular weight polyethylenimine'的文章，文中用交聯(lián)劑二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)(DSP)、雙硫二丙二亞氨甲基醚(DTBP)分別與小分子量PEI (PEI SOODa)交聯(lián)得到兩個含有二硫鍵PEI衍生物。在中國倉鼠卵巢(CH0 )細(xì)胞中具有與市售高分子量PEI (25KDa)相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染活性，二硫鍵的引入希望該衍生物可以被體內(nèi)的還原試劑谷胱甘肽還原，從而二硫鍵斷開，降解成為沒有細(xì)胞毒性的小分子量PEI，但是文獻(xiàn)中沒有給出具體的細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)。麻省理工學(xué)院的M. Klibanov在藥學(xué)研究雜志上(Pharm. Res. 2005;22:373-80.) 發(fā)表'Cross-linked small polyethylenimines while still nontoxic, deliver DNA efficiently to mammalian cells in vitro and in vivo'的文章，文中合成了酉旨鍵連接的PEI衍生物，發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)染活性都優(yōu)于bPEI 25 KDa。但是這一類酯鍵交聯(lián)的PEI衍生物所含有的伯胺和仲胺易與酯鍵發(fā)生重排反應(yīng)，致使聚陽離子的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。猶他大學(xué)的Sung Wan Kim 在緩控釋雜志(Journal of Controlled Release 2005,103 209 - 219) 發(fā)表〈〈Polyethylenimine with acid-labile linkages as a biodegradable gene carrier》的文章，生成亞胺鍵連接的可降解PEI，其特點(diǎn)是，中性pH 值可穩(wěn)定存在，在酸性條件下(pH=4. 5)亞胺鍵斷開，生成無細(xì)胞毒性的小分量PEI，降低了細(xì)胞毒性，但是其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定(亞胺鍵的引入)，其轉(zhuǎn)染活性也不高(與PEI 25KDa對照)。綜上所述，目前沒有酰胺作為可降解連接鍵的PEI類衍生物的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種酰胺鍵小分子量PEI交聯(lián)衍生物、制備方法、用途及其復(fù)合物。本發(fā)明制備的含有酰胺鍵結(jié)構(gòu)的可降解小分子量PEI 交聯(lián)衍生物具有高的轉(zhuǎn)染活性和較小的細(xì)胞毒性，在不同的細(xì)胞中均具有較好的生物活性，是高效、低毒的基因物質(zhì)載體，用于輸送基因物質(zhì)。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的
權(quán)利要求
1. 一種酰胺鍵交聯(lián)小分子量PEI交聯(lián)衍生物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酰胺鍵交聯(lián)小分子量PEI交聯(lián)衍生物，其特征在于，所述酰胺鍵小分子量PEI交聯(lián)衍生物的基本構(gòu)建單元為小分子量PEI，所述小分子量PEI的分子量為 800Dao
3.一種制備權(quán)利要求1所述的酰胺鍵交聯(lián)小分子量PEI交聯(lián)衍生物的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)將小分子量PEI與丁二酰氯按摩爾比為3:2的比例加入三乙胺-氯仿體系中；(b)攪拌、搖動或震蕩反應(yīng)體系，使之發(fā)生縮合反應(yīng)，即得所述小分子量PEI交聯(lián)衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酰胺鍵交聯(lián)小分子量PEI交聯(lián)衍生物的制備方法，其特征在于，所述小分子量PEI的分子量為800Da。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的酰胺鍵交聯(lián)小分子量PEI交聯(lián)衍生物的制備方法，其特征在于，還包括分離純化的步驟將所述小分子量PEI交聯(lián)衍生物用超純水溶解后，置于活化后的透析袋中透析；透析結(jié)束后，用微孔濾膜過濾，凍干。
6.如權(quán)利要求5所述的酰胺鍵交聯(lián)小分子量PEI交聯(lián)衍生物的制備方法，其特征是，所述透析袋的截留分子量為3500Da。
7.如權(quán)利要求5所述的酰胺鍵交聯(lián)小分子量PEI交聯(lián)衍生物的制備方法，其特征是，所述透析的時間為12 48小時。
8.如權(quán)利要求5所述的酰胺鍵交聯(lián)小分子量PEI交聯(lián)衍生物的制備方法，其特征是，所述微孔濾膜的孔徑為0. 22 0. 4ο μ m
9.一種權(quán)利要求1所述的酰胺鍵夂聯(lián)小分子量PEI交聯(lián)衍生物在制備用于輸送基因物質(zhì)載體中的用途。
10.一種復(fù)合物，其特征在于，該復(fù)合物是采用包括如下步驟的方法制備而得將權(quán)利要求1所述酰胺鍵交聯(lián)小分子量PEI交聯(lián)衍生物溶液加入到質(zhì)粒溶液中，混合，室溫下孵育，即得。
11.如權(quán)利要求10所述的復(fù)合物，其特征在于，所述質(zhì)粒為DNA質(zhì)粒。
12.如權(quán)利要求10所述的復(fù)合物，其特征在于，所述孵育的時間為30 120min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酰胺鍵小分子量PEI交聯(lián)衍生物、制備方法、用途及復(fù)合物。所述衍生物結(jié)構(gòu)式為，其中，n為1～20，m為1～20。所述酰胺鍵小分子量PEI交聯(lián)衍生物的制備方法包括如下步驟將小分子量PEI與丁二酰氯按摩爾比為3:2的比例加入三乙胺-氯仿體系中；攪拌、搖動或震蕩反應(yīng)體系，使之發(fā)生縮合反應(yīng)，即得所述小分子量PEI交聯(lián)衍生物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的含有酰胺鍵結(jié)構(gòu)的可降解小分子量PEI交聯(lián)衍生物具有高的轉(zhuǎn)染活性和較小的細(xì)胞毒性，在不同的細(xì)胞中均具有較好的生物活性，是高效、低毒的基因物質(zhì)載體，用于輸送基因物質(zhì)。
文檔編號C12N15/63GK102432877SQ20111032708
公開日2012年5月2日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者何沐, 吳飛, 廖美玲, 蘇靖, 袁偉恩, 趙仲, 金拓 申請人:上海交通大學(xué)