專利名稱：一種具有低溫活性和耐鹽性的甘露聚糖酶及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種具有低溫活性和耐鹽性的甘露聚糖酶ManAjb 13及其基因。
背景技術(shù)：
甘露聚糖是一種豐富的半纖維素，由吡喃甘露糖以β -1，4糖苷鍵連接而成，廣泛存在于高等植物中，如豆科植物的種子、魔芋的球莖、蘭科植物的假鱗莖、稱猴桃的莖葉中等。甘露聚糖的降解主要依靠內(nèi)切甘露聚糖酶(β -mannanase ；endo-1, 4-β-D-mannanase, EC 3.2. 1.78)，降解產(chǎn)物為甘露糖或甘露寡糖。根據(jù)氨基酸序列同源性，內(nèi)切甘露聚糖酶主要?dú)w類于糖苷水解酶第5和沈家族，其可來源于細(xì)菌、放線菌及真菌等(Firm et al., Nucleic Acids Res, 2008，36: D281-D288·)。內(nèi)切甘露聚糖酶在飼料、食品、醫(yī)藥、紡織、造紙、石油開采等領(lǐng)域都具有應(yīng)用價(jià)值。飼料中添加甘露聚糖酶，可顯著降低甘露聚糖分子大小，從而改善飼料性能、消除或降低因粘度增加而引起的抗?fàn)I養(yǎng)作用并提高免疫力(Dhawan and Kaur, Crit Rev Biotechnol, 2007，27: 197 - 216.)。具有低溫活性的內(nèi)切甘露聚糖酶制劑可應(yīng)用于低溫生境和低溫加工過程。水產(chǎn)動物體溫隨水溫或氣溫變化而變化，一般在10-20°C(ZhoU et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2009，85: 323 - 333.)。因此，水產(chǎn)飼料中應(yīng)用的內(nèi)切甘露聚糖酶需要在此低溫(10 - 20°C)環(huán)境下具有催化活性。另一方面，大多數(shù)水產(chǎn)動物消化道環(huán)境呈中性(如鯉科魚類)并含中性內(nèi)源蛋白酶，水產(chǎn)飼料中添加的外源內(nèi)切甘露聚糖酶需在中性條件下具有催化活性，并對中性蛋白酶具有抗性。再一方面，海洋魚類適于生長在高鹽環(huán)境中(如石斑魚最佳養(yǎng)殖鹽度為25 - 33)，飼用海洋魚類的內(nèi)切甘露聚糖酶需要具有耐鹽性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有低溫活性和耐鹽性的甘露聚糖酶ManAjbl3。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述甘露聚糖酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發(fā)明所述甘露聚糖酶ManAjb 13可得自鞘氨醇單胞菌(^Sphingobium sp.)。 ManAjbl3的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。甘露聚糖酶ManAjbl3總共含396個氨基酸，其中N端38個氨基酸為其預(yù)測的信號肽序列 “MIARRFSNLPESCGAIRSSFFCAIILLAGCGPLGRPNA”，成熟的甘露聚糖酶 ManAjbl3 含 358個氨基酸。本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了甘露聚糖酶ManAjbl3的編碼基因ffla/H/WJ，其全長1191bp，起始密碼為ATG，終止密碼為TGA。該基因序列如SEQ ID N0. 2所示。經(jīng)BLAST 比對,該甘露聚糖酶基因j》7J編碼的氨基酸序列與GenBank中marinusSGO. 5JP17-172來源的潛在甘露聚糖酶(AEN72408)具有最高的一致性，為56. 2% ；與確證活性的 Cellvibrio Japonicus 來源甘露聚糖酶 Cjmar^6c (2VX4_A)的一致性為 44. 4%。本發(fā)明還提供了包含上述甘露聚糖酶基因力的重組載體，優(yōu)選為 m-MmAjbl3。將本發(fā)明的甘露聚糖酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間， 使其核苷酸序列與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實(shí)施方案，將本發(fā)明的甘露聚糖酶基因插入到質(zhì)粒pETjSa ( + )上的feoRI和損ol限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒m-manAjbl3。本發(fā)明還提供了包含上述甘露聚糖酶基因力的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株BL21 (DE3) /manAjbl3。本發(fā)明制備甘露聚糖酶ManAjbl3的方法按以下步驟進(jìn)行
1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組甘露聚糖酶表達(dá)；
3)回收并純化所表達(dá)的甘露聚糖酶ManAjbl3。其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞BL21 (DE3 )，得到重組菌株BL21 (DE3) /manAjbl3。本發(fā)明的甘露聚糖酶ManAjbl3的最適pH值為6. 5 ；最適溫度為40°C，在10°C和 20°C下分別具有 20%和 55%的酶活；在反應(yīng)體系中加入2M的NaCl，仍然具有80%的酶活； 經(jīng)2M的NaCl (pH6. 5)在37°C下處理60min，活力無損失；經(jīng)胰蛋白酶和蛋白酶K在37°C 處理Ih后，仍能分別保持106. 9%和98. 4%的酶活；可水解木薯粉、玉米粉、麩皮和豆粕。以上性質(zhì)表明甘露聚糖酶ManAjbl3可作為一種添加劑應(yīng)用于水產(chǎn)飼料和食品行業(yè)。


圖1 在大腸桿菌中表達(dá)的重組甘露聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，M 低分子量蛋白質(zhì)Marker ；1 純化的重組甘露聚糖酶。圖2重組甘露聚I套酶的最適PH。
圖3重組甘露聚I套酶的PH穩(wěn)定性。
圖4重組甘露聚I套酶的最適溫度。
圖5重組甘露聚I套酶的熱穩(wěn)定性。
圖6NaCl對重組甘露聚糖酶酶活性的影響。
圖7重組甘露聚I套酶在NaCl中的穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)材料和試劑
1、菌株及載體鞘氨醇單胞菌sp.)來源于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心 ACCC 01037 ；大腸桿菌表達(dá)載體 pET-28a( + )及菌株fecAericAia coli BL21 (DE3) 購于Novagen公司。2、酶類及其它生化試劑限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、連接酶和dNTP購自TaKaRa 公司；角豆膠和甘露糖購自Sigma公司；其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。
3、培養(yǎng)基
LB 培養(yǎng)基=Peptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 10g，加蒸餾水至 1000ml，pH 自然 (約為7)。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2. 0% (w/v)瓊脂。說明以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。實(shí)施例1 鞘氨醇單胞菌甘露聚糖酶基因的克隆
提取鞘氨醇單胞菌基因組DNA:將液體培養(yǎng)2d的菌液離心取菌體，加入ImL溶菌酶，37°C處理60min，再加入裂解液，70°C水浴裂解60min，每隔IOmin混勻一次，在4°C下 IOOOOrpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇， 于室溫靜置5min后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于_20°C備用。根據(jù)糖苷水解酶第沈家族的保守氨基酸序列([N/T/E] -G- [E/G] -ff- [F/Y] -W-W-G 和 Y-P- [G/V] - [D/A] - [E/NS] -Y-V-D )設(shè)計(jì)合成了簡并引物 GH26F 和(表 1)。表1.甘露聚糖酶基因的克隆與表達(dá)引物
權(quán)利要求
1.一種具有低溫活性和耐鹽性的甘露聚糖酶ManAjbl3，其特征在于其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的具有低溫活性和耐鹽性的甘露聚糖酶ManAjbl3的甘露聚糖酶基因manAjbl3，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種包含權(quán)利要求4所述甘露聚糖酶基因的重組載體。
4.一種包含權(quán)利要求4所述甘露聚糖酶基因的重組菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有低溫活性和耐鹽性的甘露聚糖酶ManAjb13及其基因。來源于鞘氨醇單胞菌(Sphingobiumsp.)的甘露聚糖酶ManAjb13的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，且本發(fā)明提供了編碼上述甘露聚糖酶的編碼基因manAjb13，甘露聚糖酶基因manAjb13的重組載體和甘露聚糖酶基因manAjb13的重組菌株。本發(fā)明的甘露聚糖酶具有以下性質(zhì)最適pH6.5；最適溫度為40℃，在10℃和20℃下分別具有~20%和~55%的酶活；在反應(yīng)體系中加入2M的NaCl，仍然具有80%的酶活；經(jīng)2M的NaCl(pH6.5)在37℃下處理60min，活力無損失；良好的蛋白酶抗性；較好的水解各種自然底物的能力。本發(fā)明的甘露聚糖酶ManAjb13可作為一種添加劑應(yīng)用于水產(chǎn)飼料及食品行業(yè)中。
文檔編號C12N15/63GK102311944SQ20111032625
公開日2012年1月11日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者周峻沛, 唐湘華, 李俊俊, 潘璐, 王鳳, 許波, 高雅潔, 黃遵錫 申請人:云南師范大學(xué)