專利名稱：促甲狀腺激素受體基因突變位點檢測試劑盒、使用方法和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及基因突變檢測領域，具體涉及一種促甲狀腺激素受體基因突變位點檢測試劑盒、使用方法和應用。
背景技術(shù)：
甲狀腺的主要生理功能是通過促甲狀腺激素(TSH)作用于甲狀腺細胞膜上的促甲狀腺激素受體(TSHR)來控制的，TSHR屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族的一員，其膜外區(qū)氨基酸末端很長，是決定與TSH及TSAB特異性結(jié)合的主要部分。TSHR的主要功能是與TSH結(jié)合， 通過腺昔酸環(huán)化酶(AC)-CAMP途徑引起一系列生物學反應，促進甲狀腺激素的分泌，提高甲狀腺的攝碘能力并促進甲狀腺激素的合成、釋放，對甲狀腺組織的生長、分化等起著非常重要的作用。許多甲狀腺疾病與TSHR基因突變有關(guān)。由于TSHR基因突變，患者體內(nèi)存在一種特殊免疫球蛋白TSHR抗體(TSHRAb)，根據(jù)抗體與TSHR結(jié)合后產(chǎn)生的效應不同，TSHRAb 分為兩種類型刺激型和抑制型。刺激型為甲狀腺刺激抗體(TSAb)；抑制型為促甲狀腺激素結(jié)合阻斷免疫球蛋白(TB I)和甲狀腺刺激阻斷抗體(TSBAb)。前者結(jié)合到甲狀腺細胞膜上的TSHR上可引起甲狀腺增生和甲狀腺激素的產(chǎn)生和分泌增多，而后者則阻斷TSH與 TSHR結(jié)合，導致甲狀腺萎縮和功能下降。研究發(fā)現(xiàn)，TSHR基因的突變與甲狀腺腺瘤、Grave’ s病、先天性甲狀腺機能亢進癥、先天性甲狀腺功能減退癥等多種甲狀腺疾病相關(guān)，在A Hebrant等的研究 (Genetichyperthyroidism hyperthyroidism due to activating TSHR mutations European Journalof Endocrinology [J], 2011. 164 1-9)中指出 TSHR 上多個易突變基因的位點示意圖(見說明書附1)。在TSHR的突變位點中，有多個突變位點同時與兩種以上的甲狀腺疾病形成相關(guān)，如=TSHR 623位點和631位點的突變均與甲狀腺腺瘤和先天性甲亢相關(guān)，當623位點由Ala突變?yōu)閘ie，則表明與甲狀腺腺瘤形成相關(guān)；當623位點由Ala 突變?yōu)閂al時，則導致甲亢和彌漫性甲狀腺腫。因此TSHR基因突變位點的檢測，一方面可作為臨床對相關(guān)甲狀腺疾病的輔助診斷，另外一方面也可為相關(guān)甲狀腺疾病的預防提供依據(jù)?，F(xiàn)有技術(shù)中對于突變位點的檢測， 主要有兩個層次，一是蛋白質(zhì)層次的間接檢測；二是對遺傳物質(zhì)的直接檢測，包括SSCP、 RFLP, HTX、DGGE, DC、DHPLC、測序等，這些方法各有其優(yōu)缺點，有的需要昂貴的檢測設備，有的操作周期較長，需要2-3天才能出結(jié)果，不適合臨床開展TSHR突變檢測。以熒光定量PCR為代表的基因擴增技術(shù)迅速發(fā)展，它具有快速、特異性、靈敏度高、成本相對低等優(yōu)點，被廣泛應用于臨床檢測的各個方面。熒光定量PCR技術(shù)之所以由于常規(guī)PCR的最大原因是其引人了熒光探針，尤其是以近年來新推出TaqMan-MGB、 TaqMan-LNA探針技術(shù)，這兩種技術(shù)能提高退火溫度，縮短引物探針長度，提高特異性，降低設計難度，因此多被用于一些SNP和高變異病原體的檢測等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種突變位點檢測試劑盒、使用方法和應用，作為臨床對甲狀腺疾病的輔助診斷，為相關(guān)甲狀腺疾病的預防提供依據(jù)。本發(fā)明一方面提供了一種促甲狀腺激素受體(TSHR)基因突變位點檢測試劑盒， 所述試劑盒包括針對促甲狀腺激素受體蛋白623位點突變的TSHR 623體系和/或針對促甲狀腺激素受體蛋白631位點突變的TSHR 631體系所述TSHR 623體系包括TSHR 623位點熒光PCR混合液、Taq酶、TSHR野生型陽性對照品、TSHR 623位點突變型陽性對照品；所述TSHR 623位點核酸熒光PCR混合液含有 1)引物、2) 623-野生型探針、3) 623-突變型探針、4) RT-PCR MIX、5)ddH20 ；所述引物能特異性擴增包含TSHR蛋白623位點編碼基因在內(nèi)的一段TSHR基因片段，所述623-野生型探針能特異性識別并結(jié)合未發(fā)生突變的TSHR蛋白623位點編碼基因，所述623-突變型探針能特異性識別并結(jié)合發(fā)生突變的TSHR蛋白623位點編碼基因；所述TSHR 631體系含有TSHR 631位點熒光PCR混合液、Taq酶、TSHR野生型陽性對照品、TSHR 631位點突變型陽性對照品；所述TSHR 631位點核酸熒光PCR混合液含有1)引物、2) 631-野生型探針、3) 631-突變型探針、4) RT-PCR MIX、5) ddH20 ；所述引物能特異性擴增包含TSHR蛋白631位點編碼基因在內(nèi)的一段TSHR基因片段，所述631-野生型探針能特異性識別并結(jié)合未發(fā)生突變的TSHR 蛋白631位點編碼基因，所述631-突變型探針能特異性識別并結(jié)合發(fā)生突變的TSHR蛋白 631位點編碼基因；所述探針均為熒光標記探針。較優(yōu)的，所述TSHR 623體系與TSHR 631體系共用一對引物，即所述623體系與 631體系的引物序列相同，擴增含TSHR蛋白623位點編碼基因和631位點編碼基因在內(nèi)的一段TSHR基因片段。最優(yōu)的，所述引物序列見下表
引物序列
TSHR-F 5' - GTTGCCTTCGTCATCGTC-3' (SEQ ID NO: 1) TSHR-R 5，- GGGCCATGCATATGAAGTC-3，(SEQ ID NO 2 )較優(yōu)的，所述TSHR 623體系的623-突變型探針包括623-1型突變探針、623-2型突變探針以及623-3型突變探針，所述TSHR 623體系和TSHR 631體系的探針序列見下表
探針序列
TSHR 623 體系
TSHR 631 體系
623-野生型探針5' - CCATCCTCTTGGCAAT-3' 623-1型突變探針 623-2型突變探針 623-3型突變探針 631-野生型探針 631-突變型探針
5'- CCATCCTCTTGATAAT-3' 5'-CCATCCTCTTGACAAT-3' 5'- CCATCCTCTTGGAAAT-3' 5'-TGTGTTGATCTTCAC-3' 5' -TGTGTTGATCCTCAC-3'
(SEQ ID NO:3) (SEQ ID N0:4) (SEQ ID N0:5) (SEQ ID N0:6) (SEQ ID NO:7) (SEQ ID N0:8) 更優(yōu)的，623-野生型探針和631-野生型探針的5，端連接有FAM熒光報告基團，3， 端連接有非發(fā)光的淬滅基團；623-突變型探針和631-突變型探針的5’端連接有HEX熒光
5報告基團，3’端連接有非發(fā)光的淬滅基團。最優(yōu)的，所述TSHR 623體系的熒光探針為Taqman-MGB探針，所述TSHR 631體系的熒光探針為Taqman-MGB-LNA探針；探針結(jié)構(gòu)見下表
權(quán)利要求
1.一種促甲狀腺激素受體基因突變位點檢測試劑盒，所述試劑盒包括針對促甲狀腺激素受體蛋白623位點突變的TSHR 623體系和/或針對促甲狀腺激素受體蛋白631位點突變的TSHR 631體系所述TSHR 623體系包括TSHR 623位點熒光PCR混合液、Taq酶、TSHR野生型陽性對照品、TSHR 623位點突變型陽性對照品；所述TSHR 623位點核酸熒光PCR混合液含有1)引物、2) 623-野生型探針、3) 623-突變型探針、4) RT-PCR MIX、5)ddH20 ；所述引物能特異性擴增包含TSHR蛋白623位點編碼基因在內(nèi)的一段TSHR基因片段，所述623-野生型探針能特異性識別并結(jié)合未發(fā)生突變的TSHR蛋白623位點編碼基因，所述623-突變型探針能特異性識別并結(jié)合發(fā)生突變的TSHR蛋白623位點編碼基因；所述TSHR 631體系含有TSHR 631 位點熒光PCR混合液、Taq酶、TSHR野生型陽性對照品、TSHR 631位點突變型陽性對照品； 所述TSHR 631位點核酸熒光PCR混合液含有1)引物、2) 631-野生型探針、3) 631-突變型探針、4)RT-PCR MIX、5)ddH20 ；所述引物能特異性擴增包含TSHR蛋白631位點編碼基因在內(nèi)的一段TSHR基因片段，所述631-野生型探針能特異性識別并結(jié)合未發(fā)生突變的TSHR蛋白631位點編碼基因，所述631-突變型探針能特異性識別并結(jié)合發(fā)生突變的TSHR蛋白631 位點編碼基因；所述探針均為熒光標記探針。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述623體系與631體系的引物序列相同，擴增含TSHR蛋白623位點編碼基因和631位點編碼基因在內(nèi)的一段TSHR基因片段。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述引物序列為SEQID N0:1 2。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述TSHR623體系的623-野生型探針序列為SEQ ID NO 3,所述623-突變型探針包括623-1型突變探針、623-2型突變探針和 623-3型突變探針，探針序列分別為SEQ ID NO :4 6 ；所述TSHR 631體系的631-野生型探針序列為SEQ ID NO :7，所述631-突變型探針序列為SEQ ID NO :8。
5.如權(quán)利要求1或4所述的試劑盒，其特征在于，所述623-野生型探針和631-野生型探針的5’端連接有FAM熒光報告基團，3’端連接有非發(fā)光的淬滅基團；所述623-突變型探針和631-突變型探針的5’端連接有HEX熒光報告基團，3’端連接有非發(fā)光的淬滅基團。
6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述TSHR623體系的熒光探針為 Taqman-MGB探針，所述TSHR 631體系的熒光探針為iTaqman-MGB-LNA探針。
7.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述TSHR623體系和TSHR 631體系的野生型陽性對照品為含有SEQ ID NO :9基因序列的質(zhì)粒；所述TSHR 623位點突變型陽性對照品與TSHR 631位點突變型陽性對照品均為含有SEQ ID NO :10基因序列的質(zhì)粒。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述質(zhì)粒為pMDIS-T。
9.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的擴增程序為37°C2min ； 94°C 2min ；93°C 15sec、60°C 60sec 40 個循環(huán)。
10.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒以H2O為檢測樣品的檢測結(jié)果應為陰性；以TSHR 623位點野生型陽性對照品為檢測樣品在FAM通道檢測Ct值彡35， 在HEX通道檢測為UNDET或40 ；以TSHR 623位點突變型陽性對照品為檢測樣品在FAM通道檢測為UNDET或40，在HEX通道檢測Ct值彡35 ；以TSHR 631位點野生型陽性對照品檢測樣品在FAM通道檢測Ct值彡35，在HEX通道檢測為UNDET或40 ；以TSHR 631位點突變型陽性對照品為檢測樣品在FAM通道檢測為UNDET或40，在HEX通道檢測Ct值< 35 ；所述試劑盒用于檢測時針對TSHR 623位點的檢測FAM通道檢測Ct值彡38，HEX通道檢測為UNDET，則待測樣品為TSHR 623位點野生型；FAM通道檢測為UNDET，HEX通道檢測Ct值彡38，則待測樣品為 TSHR 623位點突變型；針對TSHR 631位點的檢測FAM通道檢測Ct值彡38，HEX通道檢測為UNDET，則待測樣品為TSHR 631位點野生型；FAM通道檢測為UNDET，HEX通道檢測Ct值 (38，則待測樣品為TSHR 631位點突變型。
11.如權(quán)利要求1-10任一權(quán)利要求所述的促甲狀腺激素受體基因突變位點檢測試劑盒的使用方法，步驟如下1)待測DNA樣品的制備采用經(jīng)典的基因組DNA提取方法或是商品化的基因組提取試劑盒，從樣本中提取基因組DNA備用；2)配置試劑每管取熒光PCR檢測混合液與Taq酶，振蕩混勻，獲得熒光PCR檢測混合液與Taq酶的共混液；3)加樣每支PCR管取步驟2、制備的熒光PCR檢測混合液與Taq酶的共混液，然后將待測DNA樣品、ddH20、TSHR野生型陽性對照品、TSHR突變型陽性對照品分別加入裝有所述共混液的各支PCR管中，蓋好管蓋，組成PCR反應體系；4)PCR擴增對步驟3)的PCR反應體系進行PCR擴增；5)熒光PCR檢測單點熒光檢測在60°C，選用FAM和HEX通道，基線調(diào)整取6-15個循環(huán)的熒光信號，閾值設定原則以閾值線剛好超過H2O檢測熒光曲線的最高點，讀取各PCR管的Ct值；6)結(jié)果分析按照權(quán)利要求9所述的條件進行檢測結(jié)果判斷。
12.如權(quán)利要求11所述的使用方法，其特征在于，步驟幻的配置試劑具體為每管取 36 μ 1熒光PCR檢測混合液與0. 4 μ 1 Taq酶，振蕩混勻，3000rpm離心，獲得熒光PCR檢測混合液與Taq酶的共混液。
13.如權(quán)利要求11所述的使用方法，其特征在于，步驟3)的加樣具體為每支PCR管取 36 μ 1步驟2)制備的熒光PCR檢測混合液與Taq酶的共混液，然后將待測DNA樣品、ddH20、 TSHR野生型陽性對照品、TSHR突變型陽性對照品各4μ 1分別加入所述共混液中，蓋好管蓋，組成40 μ 1的PCR反應體系。
14.如權(quán)利要求1-10任一權(quán)利要求所述的促甲狀腺激素受體基因突變位點檢測試劑盒在制備輔助診斷或預防甲狀腺疾病的試劑中的應用。
15.如權(quán)利要求14所述的應用，其特征在于，所述甲狀腺疾病選自甲狀腺腺瘤、先天性甲亢或彌漫性甲狀腺腫。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促甲狀腺激素受體基因突變位點檢測試劑盒及其使用方法和應用，本發(fā)明的試劑盒包括1)熒光PCR檢測混合液2)Taq酶3)TSHR野生型陽性對照品4)TSHR突變型陽性對照品5)ddH2O，本發(fā)明的試劑盒通過熒光定量PCR法對TSHR蛋白623位點和/或631位點的編碼基因進行檢測，判斷是否有所述編碼基因的突變，進而判斷是否存在甲狀腺激素受體蛋白623位點和/或631位點突變。該蛋白位點的突變可以用于甲狀腺疾病的輔助診斷和預防，具有實時檢測、定量和高通量檢測等特點，且操作簡便、靈敏度高、特異性好。
文檔編號C12Q1/68GK102344966SQ20111032275
公開日2012年2月8日 申請日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者丁鋼強, 朱勤瑋, 朱文明, 朱旭平, 樓曉明, 邵俊斌 申請人:上海之江生物科技股份有限公司, 浙江省疾病預防控制中心