專利名稱：摩氏摩根菌及在制備(s)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物新菌株及其應(yīng)用，特別涉及一種摩氏摩根菌 ZJB09203 (Morganella morganii ZJB09203)及在制備(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)如式⑴所示。(S)-2_羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸脫羧生成(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，再經(jīng)水解和加氫還原等 2步反應(yīng)即可合成普瑞巴林。普瑞巴林化學(xué)名為(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是γ-氨基丁酸(GABA)的三位異丁基取代物，通過調(diào)節(jié)鈣通道減少鈣離子進(jìn)入神經(jīng)末梢，減少谷氨酸和去甲腎上腺素等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的過度釋放。由于神經(jīng)病理性疼痛、癲癇均與神經(jīng)元過度興奮、神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加相關(guān)，普瑞巴林能夠有效抑制該過程，從而產(chǎn)生治療作用。與撲癇酮、卡馬西平、苯妥英鈉等傳統(tǒng)神經(jīng)病理性疼痛和癲癇治療藥物相比，普瑞巴林具有劑量低、副作用小、持續(xù)時間長和耐受性強(qiáng)等顯著優(yōu)勢。
權(quán)利要求
1.摩氏摩根菌ZJB09203(Morganella morganii ZJB09203)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期2011年5月19日，保藏編號CCTCC M 2011175。
2.如權(quán)利要求1所述的摩氏摩根菌ZJB09203，其特征在于所述摩氏摩根菌ZJB09203 的16S rDNA序列為TAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGGG60CGGTAACAGGGAGAAGCTTGCTTCTCTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTATG120GGGATCTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAATGTC180TCCGGACCAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCACCATCAGATGAACCCATATGGGATTA240GCTTGTAGGTGAGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGA300TCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATA360TTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGT420TGTAAAGTACTTTCAGTCGGGAGGAAGGTGTTAAGGTTAATAACCTTGACAATTGACGTT480ACCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCA540AGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTGATTGAGTCAGATGTG600AAATCCCCGGGCTTAACCCGGGAATTGCATCTGATACTGGTCAGCTAGAGTCTTGTAGAG660GGGGGTAGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGGTGGC720GAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG780ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAG840GCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTA900AAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATG960CAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTG1020CCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTT1080GGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGCGTGATGGCGGGA1140ACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCAT1200GGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGGGAAGCGACCCT1260GCGAAGGCAAGCGGAACTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCAAC1320TCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCG1380GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTT1440AACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGCAACAAGG1500TAACCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTA1537
3.如權(quán)利要求1所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯為底物，以摩氏摩根菌ZJB09203培養(yǎng)獲得的酶為酶源，20 45°C下，調(diào)節(jié)pH值至6. 5 9. 0，于水中轉(zhuǎn)化反應(yīng)4 48h，得轉(zhuǎn)化液分離純化制得(S) -2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，所述摩氏摩根菌ZJB09203以濕菌體質(zhì)量計(jì)為50 200g/L水，所述底物初始濃度為 10 300g/L 水。
5.如權(quán)利要求4所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述酶源為摩氏摩根菌ZJB09203含菌細(xì)胞菌懸液。
6.如權(quán)利要求4所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述pH值以如下酸性物質(zhì)來調(diào)節(jié)lmol/L鹽酸水溶液、lmol/L硫酸水溶液、lmol/L醋酸水溶液、lmol/L磷酸水溶液、lmol/L硝酸水溶液或 lmol/L硼酸水溶液。
7.如權(quán)利要求4所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述pH值以如下堿性物質(zhì)來調(diào)節(jié)lmol/L氫氧化鈉水溶液、lmol/L氫氧化鈣水溶液、lmol/L氫氧化鉀水溶液、lmol/L氫氧化鎂水溶液或lmol/ L碳酸鈣水溶液。
8.如權(quán)利要求5所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述摩氏摩根菌ZJB09203含菌細(xì)胞菌懸液按以下步驟獲得(1)斜面培養(yǎng)將摩氏摩根菌ZJB09203接種于斜面培養(yǎng)基，20 42°C培養(yǎng)16 48h，獲得斜面菌體，所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成(g/L)為牛肉膏5. 0，蛋白胨10. 0，NaCl 5. 0，溶劑為水；( 種子培養(yǎng)用接種環(huán)從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌體接種于種子培養(yǎng)基， 25 37°C培養(yǎng)14 35h，獲得種子液，所述種子培養(yǎng)基終濃度組成(g/L)為葡萄糖8 25，牛肉膏10 18，蛋白胨6 16，氯化鈉1 4，磷酸氫二鉀1. 0 3. 0，磷酸二氫鉀1. 0 3. 0，溶劑為水；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子液以接種量3 15%接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶裝液量 10 30%，20 40°C，100 300rpm，搖床培養(yǎng)48 72h，獲得含菌細(xì)胞發(fā)酵液，發(fā)酵液離心分離，棄去上清液，沉淀用生理鹽水洗滌，收集濕菌體并懸浮于純水中，獲得所述摩氏摩根菌ZJB09203含菌細(xì)胞菌懸液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成(g/L)為葡萄糖5 20，酵母粉5 15，蛋白胨5 10，氯化鈉1 5，磷酸氫二鉀0.5 2.0，磷酸二氫鉀0 2.0，硫酸鎂0. 1 0.5，橄欖油1 3，pH 6.0 8. 5，溶劑為水。
9.如權(quán)利要求4所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于所述的轉(zhuǎn)化液分離純化方法為將轉(zhuǎn)化液離心分離， 取上清液，在80°C回流加熱進(jìn)行脫羧反應(yīng)5h，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液冷卻至室溫，離心，取上層物質(zhì)干燥，制得(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
10.如權(quán)利要求3所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用按以下步驟進(jìn)行以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯為底物，以摩氏摩根菌ZJB09203含菌細(xì)胞菌懸液為酶源，20 36°C下，pH值 7. 0 8. 5，于純水中轉(zhuǎn)化反應(yīng)14 36h，轉(zhuǎn)化液離心分離，取上清液，在80°C回流加熱進(jìn)行脫羧反應(yīng)5h，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液冷卻至室溫，離心，取上層物質(zhì)干燥，制得(S) -2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，所述底物初始濃度為10 250g/L水，所述摩氏摩根菌ZJB09203 以濕菌體質(zhì)量計(jì)為80 200g/L水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種摩氏摩根菌ZJB09203(Morganella morganii ZJB09203)及其在微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯為底物，以摩氏摩根菌ZJB09203培養(yǎng)獲得的酶為酶源，20～45℃下，調(diào)節(jié)pH值至6.5～9.0，于水中轉(zhuǎn)化反應(yīng)4～48h，轉(zhuǎn)化液分離純化制得(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸；本發(fā)明摩氏摩根菌ZJB09203新菌株穩(wěn)定性好，能夠耐受高濃度的底物和產(chǎn)物，且立體選擇性嚴(yán)格，產(chǎn)物光學(xué)純度大于95％。
文檔編號C12N1/20GK102382785SQ201110318750
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月19日
發(fā)明者傅德進(jìn), 沈寅初, 鄭仁朝, 鄭裕國 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)