專利名稱：一種分子標(biāo)記鑒定雜交大豆種子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種分子標(biāo)記檢測雜交大豆種子的方法，適用于RN型細(xì)胞質(zhì)雄性不育“三系”育成的雜交大豆審定品種種子純度的鑒定，屬于植物分子標(biāo)記檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
利用雜種優(yōu)勢是大幅度提高大豆單產(chǎn)最有效的措施之一。我國在大豆雜種優(yōu)勢研究領(lǐng)域處于國際領(lǐng)先地位，吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育“三系”于2002年育成并審定了世界上第一個(gè)大豆雜交種“雜交豆1號”，比對照增產(chǎn)20. 9%。之后吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院又育成并審定了雜交豆2號、3號、4號和5號，安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成并審定了雜優(yōu)豆 1和2號，阜陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成并審定了阜雜交豆1號。目前這些雜交種部分已在生產(chǎn)上應(yīng)用，這標(biāo)志著大豆雜種優(yōu)勢利用進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化開發(fā)階段。然而優(yōu)良雜交種的推廣應(yīng)用需要大量優(yōu)質(zhì)的種子，雜交種純度的高低直接影響著雜交大豆的產(chǎn)量和農(nóng)民種植雜交種的積極性。為保護(hù)農(nóng)民的利益，降低因純度低而導(dǎo)致的減產(chǎn)，迫切需要進(jìn)行大豆雜交種純度的檢驗(yàn)工作，并建立一種準(zhǔn)確、簡單、快捷的雜交種純度鑒定方法。大豆種子純度常規(guī)鑒定多采用形態(tài)學(xué)鑒定法和生化鑒定法。形態(tài)學(xué)鑒定法是依靠種子或植株的表型性狀來鑒別不同的個(gè)體，該方法比較直觀、簡便，但由于可直接觀測的農(nóng)藝性狀十分有限，有些性狀要在特定的生育期才能檢測，有些性狀易受環(huán)境條件的影響，從而受到很大限制。關(guān)鍵是如果混雜的材料在表型上與被鑒定雜交種的性狀完全一致，采用這種方法就無法鑒定出偽雜種。生化鑒定法是通過鑒別不同品種基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)之間的特異性差異來鑒定種子純度。該技術(shù)的應(yīng)用對準(zhǔn)確、快速檢驗(yàn)種子純度起了很大的推動作用，但由于其多態(tài)性較低，且有組織和器官特異性，使取材受到嚴(yán)格限制，從而限制了其應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種分子標(biāo)記鑒定雜交大豆種子的方法，解決了現(xiàn)有用于種子純度鑒定鑒定法存在的諸多缺陷，具有省時(shí)、省力、方法簡單，操作方便，鑒定快速，準(zhǔn)確可靠，工作效率高等特點(diǎn)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供一種分子標(biāo)記鑒定雜交大豆種子的方法，包括以下步驟
(1)提取大豆雜交種種子的基因組DNA；以基因組DNA為模版，用引物JLHSSSR1進(jìn)行擴(kuò)
增；
引物序列為
上游引物5，-GCAGCTTGCTCAGAACATCA-3，， 下游引物5，-AAACCCTAACGCCGTTTCTT-3，；
(2)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳；
(3)對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，其中
SSR引物JLHSSSR1產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記為兩條；產(chǎn)生的父本特異標(biāo)記也為兩條；通過應(yīng)用幾HSSSRl對雜交大豆種子的標(biāo)記基因型進(jìn)行分析，只有同時(shí)具有親本特異條帶的單株才是真正的雜交種，缺少其中任意一個(gè)條帶或無親本條帶，均被視為假雜種，檢測得到的純度結(jié)果的平均值即為雜交大豆種子的純度。雜交大豆基因組DNA的提取
取一粒雜交大豆種子置于研缽中，加入液氮研磨成粉末，取0. 2g粉末倒入1. 5 ml離心管中，向離心管中加入600ml 65°C預(yù)熱的IXCTAB緩沖液和40ml巰基乙醇；將樣品粉末與緩沖液迅速攪勻使之不成團(tuán)，65°C水浴30分鐘，其間輕搖3-5次；4°C，SOOOrpm離心， 取上清液轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管，加入等體積氯仿-異戊醇(24 1)混勻；室溫，IOOOOrpm離心 lOmin，取上清液；加2 / 3體積的預(yù)冷異丙醇，_20°C沉淀30min ；4°C IOOOOrpm離心5min， 棄上清，加入500 μ 1 70%乙醇洗2次，吸干上清液，室溫晾干，約10分鐘；加入200 μ 1已滅菌的的TE溶液(ρΗ8. 0)，混勻后，即得DNA溶液，置于_20°C保存?zhèn)溆茫?PCR擴(kuò)增反應(yīng)
PCR反應(yīng)體系為10 μ 1，其中包括基因組DNA 30 ng，2.5 mmol · L_1 MgCl2, dNTPs各 0. 2mmol · L-1，引物 0. 5 μ mol · L_1，0. 3U Taq DNA 聚合酶； PCR反應(yīng)程序
首先 94°C 3min;然后 94°C 30s, 46 °C 30s, 72 °C 30s，共 30 個(gè)循環(huán)；最后 72 °C 10 min ；PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行； 凝膠電泳
擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量體積比濃度為8%的垂直板變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上進(jìn)行電泳，恒功率80W電泳，電泳結(jié)束后，將膠版置于固定液中固定20min，蒸餾水沖洗3次，每次至少2 分鐘，銀染30min，顯色后加入固定液固定，再用蒸餾水洗滌凝膠2次，每次至少2分鐘，然后晾干，將晾干的玻璃板置于燈箱上觀察結(jié)果或照相記錄。通過RN型細(xì)胞質(zhì)雄性不育“三系”，吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院目前已經(jīng)育成了雜交豆1 號、2號、3號、4號和5號，共五個(gè)雜交大豆品種，并分別于2002、2006、2009、2010、2011年通過吉林省品種審定委員會審定。這些品種是世界上第一批可商用大豆雜交種。因此，為保證農(nóng)民種植優(yōu)良雜交種產(chǎn)生最大的經(jīng)濟(jì)效益，需要一種準(zhǔn)確、簡單、快捷的雜交種純度鑒定方法對其商用種子的真?zhèn)渭凹兌冗M(jìn)行快速鑒定。本發(fā)明提供1個(gè)能夠在雜交種中同時(shí)產(chǎn)生具有父、母本特異標(biāo)記的條帶，而且?guī)颓逦⒅貜?fù)性好、可靠性強(qiáng)的引物JLHSSSR1作為鑒定RN型細(xì)胞質(zhì)雄性不育“三系”育成的雜交大豆品種種子真?zhèn)蔚奶卣饕铩１景l(fā)明與傳統(tǒng)大豆種子純度鑒定方法相比積極效果在于用SSR標(biāo)記方法鑒定大豆商用雜交種純度，這有利于商用雜交大豆品種種子的質(zhì)量控制，具有如下特點(diǎn)
(1)快速、準(zhǔn)確、可靠，DNA提取及電泳檢測，僅需一個(gè)工作日即可完成；
(2)操作方法簡單，普通實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員就可完成；
(3)所需設(shè)備為普通分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備；
(4)沒有季節(jié)和時(shí)間限制，任何時(shí)間皆可進(jìn)行檢測，省去常規(guī)種子純度鑒定所需土地、 溫度、光照等條件，及植株生長過程中耗費(fèi)的時(shí)間。通過對雜交大豆品種的隨機(jī)群體鑒定，其結(jié)果與田間鑒定相一致。本發(fā)明方法簡便，操作方便，該方法以篩選的特異分子標(biāo)記，可快速、準(zhǔn)確、可靠地通過實(shí)驗(yàn)手段鑒定RN型細(xì)胞質(zhì)雄性不育“三系”育成的雜交大豆審定品種種子純度，降低大豆雜交種銷售過程中，因種子純度不夠而可能招致減產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。


圖1為本發(fā)明特異性SSR標(biāo)記篩選示意其中，Pl 父本；P2 母本；Fl 雜交種JLHSSSR1—JLHSSSR11 篩選用SSR引物； 圖2為本發(fā)明標(biāo)記幾HYSSRl擴(kuò)增鑒定雜交大豆品種雜交豆1號種子純度實(shí)施例示意
其中，被檢測種子；其中 2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21、23、24、 25、27、30 為真雜交種；1、3、9、20、22、26、28、29 ；
圖3為本發(fā)明標(biāo)記幾HYSSRl擴(kuò)增鑒定雜交大豆品種雜交豆2號種子純度實(shí)施例示意
圖
其中，1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15、17、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29為真雜交種；8、16、19為假雜交種；
圖4為本發(fā)明標(biāo)記JLHYSSR1擴(kuò)增鑒定雜交大豆品種雜交豆3號種子純度實(shí)施例示意
其，1、2、3、5、6、7、8、9、11、12、15、16、17、18、19、20、21、22、23、28、30、33 為真雜交種； 4、10、13、14、24、25、26、27、29、31、32 為假雜交種；
圖5為本發(fā)明標(biāo)記JLHYSSR1擴(kuò)增鑒定雜交大豆品種雜交豆4號種子純度實(shí)施例示意
圖
其中，1、2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、14、16、18、19、20、22、23、24、25、27 為真雜交種； 7、8、15、17、21、26、28 為假雜交種；
圖6為本發(fā)明標(biāo)記JLHYSSR1擴(kuò)增鑒定雜交大豆品種雜交豆5號種子純度實(shí)施例示意
其中，3、6、7、9、10、11、12、13、14、16、21 為真雜交種；1、2、4、5、8、15、17、18、19、20 為假
雜交種。
具體實(shí)施例方式下面通過基于PCR技術(shù)的SSR標(biāo)記分析實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實(shí)施例1
實(shí)驗(yàn)材料為雜交大豆種子及其各自親本材料種子。實(shí)驗(yàn)方法為提取上述實(shí)驗(yàn)材料的基因組DNA，采用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，統(tǒng)計(jì)結(jié)果并篩選特征引物，用特征引物對要檢測的雜交種進(jìn)行純度鑒定。大豆種子基因組DNA提取
(1)取一粒雜交大豆種子置于研缽中，加入液氮研磨成粉末，取0. 2g粉末倒入1. 5 ml 離心管中；(2)向離心管中加入600ml 65°C預(yù)熱的 IXCTAB 緩沖液(50 mM Tris-Cl pH8. 0,0. 7 M NaCl，10 mM EDTA pH8. 0，1% CTAB )和40ml巰基乙醇；將樣品粉末與緩沖液迅速攪勻使之不成團(tuán)，65°C水浴30分鐘，其間輕搖3-5次；
(3)4°C，SOOOrpm離心，取上清液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，加入等體積氯仿-異戊醇(24 1) 混勻，室溫，IOOOOrpm離心IOmin ；
(4)取上清液；加2/ 3體積的預(yù)冷異丙醇，-20°C沉淀30min ；4°C IOOOOrpm離心 5min ；
(5)棄上清，加入500μ 1 70%乙醇洗DNA，IOOOOrpm離心5min ；倒掉上清液，重復(fù)洗一次，吸干上清液，室溫晾干，約IOmin ；
(6)加入200μ 1已滅菌的的TE溶液(ρΗ8. 0)，混勻后，即為DNA溶液，置于_20°C保存分子標(biāo)記分析
SSR反應(yīng)體系為10 μ 1，其中包括基因組DNA 30 ng，2.5 mmol · L-I MgCl2, dNTPs各 0. 2mmol · L-1，引物 0. 5 μ mol · L_1，0. 3U Taq DNA 聚合酶。PCR 反應(yīng)程序首先 94°C 3min;然后 94°C 30s，46°C 30s, 72°C 30s，共 30 個(gè)循環(huán)；最后72°C 10 min00 PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量體積比濃度為8%的垂直板變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上進(jìn)行電泳，恒功率80W電泳；電泳結(jié)束后，將膠版置于固定液(10%冰乙酸)中固定20min ；蒸餾水沖洗3次，每次至少2分鐘；將膠板移至染色液(2升雙蒸水預(yù)冷，臨用時(shí)加2克硝酸銀，3 ml 37%甲醛)中，銀染30min ；然后將膠板放入雙蒸水中5_10秒，迅速取出并浙水，膠板放入預(yù)冷的顯影液(2L雙蒸水中溶解60克碳酸鈉，冷卻至10-12°C，用時(shí)加入3 ml 37%甲醛， 400 μ 1硫代硫酸鈉溶液)中，輕搖至電泳條帶清晰顯示出來；顯色后加入固定液固定；再用蒸餾水洗滌凝膠2次，每次至少2分鐘，然后晾干；將晾干的玻璃板置于燈箱上觀察結(jié)果或照相記錄。篩選純度鑒定的特征引物
從所用的引物中篩選出能夠在雜交種中同時(shí)產(chǎn)生父、母本特異標(biāo)記條帶，且?guī)颓逦?重復(fù)性好、可靠性強(qiáng)的引物1對，命名為幾HYSSRl，作為雜交大豆種子真實(shí)性或/和品種純度鑒定的引物，見圖1。JLHYSSR1引物序列為 F GCAGCTTGCTCAGAACATCA R:AAACCCTAACGCCGTTTCTT
SSR引物JLHSSSR1產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記為兩條；產(chǎn)生的父本特異標(biāo)記也為兩條。用特征引物對雜交種進(jìn)行純度鑒定
應(yīng)用上述特征引物，對通過需要檢測的雜交大豆種子進(jìn)行純度鑒定，步驟同1-3。只有同時(shí)具有親本特異條帶的單株才是真正的雜交種，缺少其中任意一個(gè)條帶或無親本條帶均被視為假雜種，檢測得到的純度結(jié)果的平均值即為雜交種的純度。此引物在多次重復(fù)中表現(xiàn)穩(wěn)定，與大田鑒定數(shù)據(jù)相一致可以準(zhǔn)確地鑒定大豆雜交種的純度。其中SSR引物代號JLHSSSR1的含義是“幾”代表吉林；“HS”代表Hybrid Soybean ;“1”代表本引物編號。試驗(yàn)例1驗(yàn)證實(shí)施例鑒定雜交大豆品種雜交豆1號種子純度 (1)雜交大豆種子基因組DNA提取
其過程是將雜交大豆品種雜交豆1號種子置于研缽中，加入液氮研磨成粉末，取0. 2g 粉末倒入1.5 ml離心管中；向離心管中加入600ml 65°C預(yù)熱的1 XCTAB緩沖液(50 mM Tris-Cl ρΗ8· 0,0. 7 M NaCl, 10 mM EDTA ρΗ8· 0，1% CTAB )禾口 40ml 巰基乙醇；將樣品粉末與緩沖液迅速攪勻使之不成團(tuán)，65°C水浴30分鐘，其間輕搖3-5次；4°C，SOOOrpm離心， 取上清液轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管，加入等體積氯仿-異戊醇(24 1)混勻，室溫，IOOOOrpm離心 IOmin ；取上清液；加2 / 3體積的預(yù)冷異丙醇，_20°C沉淀30min ；4°C IOOOOrpm離心5min ； 棄上清，加入500 μ 1 70%乙醇洗DNA，IOOOOrpm離心5min ；倒掉上清液，重復(fù)洗一次，吸干上清液，室溫晾干，約IOmin ；加入200 μ 1已滅菌的TE溶液(ρΗ8. 0)，混勻后，即為DNA溶液，置于_20°C保存?zhèn)溆谩?2 ) JLHSSSR1 弓 | 物 PCR 擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系為10 μ 1，其中包括基因組DNA 30 ng，2.5 mmol · L_1 MgCl 2, dNTPs各 0. 2mmol · L-1，引物 0. 5 μ mol · L_1，0. 3U Taq DNA 聚合酶。PCR 反應(yīng)程序首先 94°C 3min;然后 94°C 30s,46°C 30s,72°C 30s，共 30 個(gè)循環(huán)；最后72°C 10 min0 PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。( 3 )擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析
擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量體積比濃度為8%的垂直板變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上進(jìn)行電泳，恒功率80W電泳；電泳結(jié)束后，將膠版置于固定液(10%冰乙酸)中固定20min ；蒸餾水沖洗3 次，每次至少2分鐘；將膠板移至染色液(2升雙蒸水預(yù)冷，臨用時(shí)加2克硝酸銀，3 ml 37% 甲醛)中，銀染30min;然后將膠板放入雙蒸水中5-10秒，迅速取出并浙水，膠板放入預(yù)冷的顯影液(2L雙蒸水中溶解60克碳酸鈉，冷卻至10-12°C，用時(shí)加入3 ml 37%甲醛，400μ 1硫代硫酸鈉溶液)中，輕搖至電泳條帶清晰顯示出來；顯色后加入固定液固定；再用蒸餾水洗滌凝膠2次，每次至少2分鐘，然后晾干；將晾干的玻璃板置于燈箱上觀察結(jié)果并照相記錄。(4)雜交大豆種子純度計(jì)算
本試驗(yàn)例共選取30粒雜交大豆種子進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果見圖2。通過對種子基因組DNA 擴(kuò)增帶型進(jìn)行分析，22粒種子擴(kuò)增結(jié)果同時(shí)具有親本特異條帶，認(rèn)定其為真雜交種；8粒種子DNA擴(kuò)增結(jié)果為缺少其中任意一個(gè)親本條帶，認(rèn)定其為假雜交種，計(jì)算檢測結(jié)果得出，本實(shí)施例中大豆雜交種的純度為73. 33%，與常規(guī)鑒定數(shù)據(jù)相一致。試驗(yàn)例2
驗(yàn)證實(shí)施例鑒定雜交大豆品種雜交豆2號種子純度
(1)雜交大豆種子基因組DNA提取，同試驗(yàn)例1；
(2)JLHSSSR1引物PCR擴(kuò)增，方法同試驗(yàn)例1 ；
(3)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析，方法同試驗(yàn)例1；
(4)雜交大豆種子純度計(jì)算，方法同試驗(yàn)例1；
本試驗(yàn)例共選取29粒雜交大豆種子進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果見圖3。通過對種子基因組DNA 擴(kuò)增帶型進(jìn)行分析，26粒種子擴(kuò)增結(jié)果同時(shí)具有親本特異條帶，認(rèn)定其為真雜交種；3粒種子DNA擴(kuò)增結(jié)果為缺少其中任意一個(gè)親本條帶或無親本條帶，認(rèn)定其為假雜交種，計(jì)算檢測結(jié)果得出，本實(shí)施例中大豆雜交種的純度為89. 66%，與常規(guī)鑒定數(shù)據(jù)相一致。
試驗(yàn)例3
驗(yàn)證實(shí)施例鑒定雜交大豆品種雜交豆3號種子純度
(1)雜交大豆種子基因組DNA提取，方法同試驗(yàn)例1；
(2)JLHSSSR1引物PCR擴(kuò)增，方法同試驗(yàn)例1 ；
(3)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析，方法同試驗(yàn)例1；
(4)雜交大豆種子純度計(jì)算，方法同試驗(yàn)例1；
本試驗(yàn)例共選取33粒雜交大豆種子進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果見圖4。通過對種子基因組DNA 擴(kuò)增帶型進(jìn)行分析，22粒種子擴(kuò)增結(jié)果同時(shí)具有親本特異條帶，認(rèn)定其為真雜交種；11粒種子DNA擴(kuò)增結(jié)果為缺少其中任意一個(gè)親本條帶或無親本條帶，認(rèn)定其為假雜交種，計(jì)算檢測結(jié)果得出，本實(shí)施例中大豆雜交種的純度為66. 67%，與常規(guī)鑒定數(shù)據(jù)相一致。試驗(yàn)例4
驗(yàn)證實(shí)施例鑒定雜交大豆品種雜交豆4號種子純度
(1)雜交大豆種子基因組DNA提取，方法同試驗(yàn)例1；
(2)JLHSSSR1引物PCR擴(kuò)增，方法同試驗(yàn)例1 ；
(3)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析，方法同試驗(yàn)例1；
(4)雜交大豆種子純度計(jì)算，方法同試驗(yàn)例1；
本試驗(yàn)例共選取28粒雜交大豆種子進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果見圖5。通過對種子基因組DNA 擴(kuò)增帶型進(jìn)行分析，21粒種子擴(kuò)增結(jié)果同時(shí)具有親本特異條帶，認(rèn)定其為真雜交種；7粒種子DNA擴(kuò)增結(jié)果為缺少其中任意一個(gè)親本條帶或無親本條帶，認(rèn)定其為假雜交種，計(jì)算檢測結(jié)果得出，本實(shí)施例中大豆雜交種的純度為75. 00%，與常規(guī)鑒定數(shù)據(jù)相一致。試驗(yàn)例5
驗(yàn)證實(shí)施例鑒定雜交大豆品種雜交豆5號種子純度
(1)雜交大豆種子基因組DNA提取，方法同試驗(yàn)例1；
(2)JLHSSSR1引物PCR擴(kuò)增，方法同試驗(yàn)例1 ；
(3)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析，方法同試驗(yàn)例1；
(4)雜交大豆種子純度計(jì)算，方法同試驗(yàn)例1；
本試驗(yàn)例共選取21粒雜交大豆種子進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果見圖6。通過對種子基因組DNA 擴(kuò)增帶型進(jìn)行分析，11粒種子擴(kuò)增結(jié)果同時(shí)具有親本特異條帶，認(rèn)定其為真雜交種；10粒種子DNA擴(kuò)增結(jié)果為缺少其中任意一個(gè)親本條帶或無親本條帶，認(rèn)定其為假雜交種，計(jì)算檢測結(jié)果得出，本實(shí)施例中大豆雜交種的純度為52. 38%，與常規(guī)鑒定數(shù)據(jù)相一致。
權(quán)利要求
1.用于鑒定雜交大豆種子純度的引物JLHSSSR1，其特征在于引物序列為上游引物5，-GCAGCTTGCTCAGAACATCA-3，，下游引物5’ -AAACCCTAACGCCGTTTCTT-3，。
2.一種分子標(biāo)記鑒定雜交大豆種子純度的方法，包括以下步驟(1)提取大豆雜交種種子的基因組DNA；以基因組DNA為模版，用引物JLHSSSR1進(jìn)行擴(kuò)增；(2)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳；(3)對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，其中SSR引物JLHSSSR1產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記為兩條；產(chǎn)生的父本特異標(biāo)記也為兩條；通過應(yīng)用幾HSSSRl對雜交大豆種子的標(biāo)記基因型進(jìn)行分析，只有同時(shí)具有親本特異條帶的單株才是真正的雜交種，缺少其中任意一個(gè)條帶或無親本條帶，均被視為假雜種，檢測得到的純度結(jié)果的平均值即為雜交大豆種子的純度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述分子標(biāo)記鑒定雜交大豆種子純度的方法，其特征在于雜交大豆基因組DNA的提取取一粒雜交大豆種子置于研缽中，加入液氮研磨成粉末，取0. 2g粉末倒入1. 5 ml離心管中，向離心管中加入600ml 65°C預(yù)熱的IXCTAB緩沖液和40ml巰基乙醇；將樣品粉末與緩沖液迅速攪勻使之不成團(tuán)，65°C水浴30分鐘，其間輕搖3-5次；4°C，SOOOrpm離心， 取上清液轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管，加入等體積氯仿-異戊醇(24 1)混勻；室溫，IOOOOrpm離心 lOmin，取上清液；加2 / 3體積的預(yù)冷異丙醇，_20°C沉淀30min ；4°C IOOOOrpm離心5min， 棄上清，加入500 μ 1 70%乙醇洗2次，吸干上清液，室溫晾干，約10分鐘；加入200 μ 1已滅菌的的TE溶液(ρΗ8. 0)，混勻后，即得DNA溶液，置于_20°C保存?zhèn)溆?；PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR反應(yīng)體系為10 μ 1，其中包括基因組DNA 30 ng，2.5 mmol · L_1 MgCl2, dNTPs各 0. 2mmol · L-1，引物 0. 5 μ mol · L_1，0. 3U Taq DNA 聚合酶；PCR反應(yīng)程序首先 94°C 3min;然后 94°C 30s, 46 °C 30s, 72 °C 30s，共 30 個(gè)循環(huán)；最后 72 °C 10 min ；PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行；凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量體積比濃度為8%的垂直板變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上進(jìn)行電泳，恒功率80W電泳，電泳結(jié)束后，將膠版置于固定液中固定20min，蒸餾水沖洗3次，每次至少2 分鐘，銀染30min，顯色后加入固定液固定，再用蒸餾水洗滌凝膠2次，每次至少2分鐘，然后晾干，將晾干的玻璃板置于燈箱上觀察結(jié)果或照相記錄。
全文摘要
本發(fā)明公開一種分子標(biāo)記鑒定雜交大豆種子純度的方法，以RN型細(xì)胞質(zhì)雄性不育“三系”育成的雜交大豆審定品種及其親本的基因組DNA為模版，通過SSR分析，建立了雜交大豆及其各自親本的SSR特異性指紋圖譜，成功地獲得了一個(gè)能將親本及雜交種明確區(qū)分的共顯性SSR標(biāo)記，根據(jù)特異性標(biāo)記可以進(jìn)行RN型細(xì)胞質(zhì)雄性不育“三系”育成的雜交大豆審定品種的種子純度檢驗(yàn)。通過對雜交大豆品種的隨機(jī)群體鑒定，其結(jié)果與田間鑒定相一致。本發(fā)明方法簡便，操作方便，該方法以篩選的特異分子標(biāo)記，可快速、準(zhǔn)確、可靠地通過實(shí)驗(yàn)手段鑒定RN型細(xì)胞質(zhì)雄性不育“三系”育成的雜交大豆審定品種種子純度，降低大豆雜交種銷售過程中，因種子純度不夠而可能招致減產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號C12N15/11GK102329869SQ20111029268
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月5日
發(fā)明者張井勇, 張偉, 張偉龍, 張春寶, 彭寶, 王玉民, 趙麗梅, 趙曉明 申請人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院