專利名稱：白沙蒿尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(AsHPT)基因及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一新的基因序列，以及這種基因序列的制備方法和用途，確切講本發(fā)明涉及白沙蒿尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(AsHPT)及其制備與用途。
背景技術(shù)：
維生素E，又被稱作生育酚。是一種動(dòng)物正常繁殖所必須的物質(zhì)，能抗不育和防止早產(chǎn)、流產(chǎn)，參見(jiàn)宋曉燕，楊天奎“天然維生素E的功能及應(yīng)用”《中國(guó)油脂》2002，25(6) 45-48。維生素E作為飼料添加劑，可以提高動(dòng)物的免疫力、改善肉質(zhì)、奶質(zhì)并提高繁殖能力和緩解動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)參見(jiàn)肖雄.“維生素E的研究與應(yīng)用”《畜禽業(yè)》2002，4:2446。維生素E與人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)有著密切的關(guān)系，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明維生素E可以防治冠心病、高血壓、心肌梗塞、血栓等疾病參見(jiàn)Ajjawi I. and Shintani D. "Engineered plants with elevated vitamin E -.a nutraceutical success story"((Trends Biotech)) 2004,22(3) :104-107 ；Vertuani S,Angusti A and Manfredini S."The antioxidants and pro-antioxidants network :An overview.，，《Cur Pharmaceutical Design》2004,10(14) 1677-1694。維生素E還有美容、護(hù)膚、防衰老、抗癌等功效，參見(jiàn)雷炳?！拔覈?guó)天然維生素 E產(chǎn)業(yè)化前景初探”《中國(guó)油脂》2003，28 (4) :49_51。維生素E存在于植物的不同組織包括綠色光合組織和種子等。不同植物中維生素E的組成、含量及總量有著十分大的差異(參見(jiàn)表一)。尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因是介導(dǎo)維生素E合成的關(guān)鍵酶基因，控制著生育酚總量的合成。GenBank中已公布了擬南芥、木薯、玉米、小麥、蔥、芫荽等植物的尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因的核苷酸序列和氨基酸序列。表1沙蒿油與其他植物油VE含量(單位mg/kg)
權(quán)利要求
1.白沙蒿尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(AsHPT)基因，其特征是其基因序列為SEQ1。
2.權(quán)利要求1所述的白沙蒿尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(AsHPT)基因制備方法，其特征是首先提取白沙蒿的RNA，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；利用GenBank中已公布的其它植物的HPT基因的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)合成一對(duì)簡(jiǎn)并引物PI、P2 ；以得到的白沙蒿cDNA為模板擴(kuò)增得到白沙蒿HPT核心片段核苷酸序列；根據(jù)測(cè)序得到的HPT 基因核心片段序列分別設(shè)計(jì)白沙蒿HPT基因特異引物5’端外側(cè)引物P3和巢式引物P4， 分別與GeneRacer 試劑盒中自帶的5，P和5，NP配對(duì)，以白沙蒿cDNA為模板，進(jìn)行5，外側(cè)和巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到5’末端核苷酸序列；同樣根據(jù)測(cè)序得到的白沙蒿HPT基因核心片段序列分別設(shè)計(jì)白沙蒿HPT基因特異引物3’端外側(cè)引物P5和巢式引物P6，分別與 GeneRacer 試劑盒中自帶的3，P和3，NP配對(duì)，以白沙蒿cDNA為模板，進(jìn)行3，外側(cè)和巢式PCR擴(kuò)增，得到3’末端核苷酸序列；將所得到的三段序列，白沙蒿HPT核心片段核苷酸序列、5’末端核苷酸序列和3’末端核苷酸序列，進(jìn)行拼接，得到目標(biāo)基因。
3.權(quán)利要求1所述的白沙蒿尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(AsHPT)基因制備方法，其特征是采用白沙蒿的葉片提取RNA。
4.權(quán)利要求2或3所述的白沙蒿尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(AsHPT)基因制備方法中所用的相關(guān)引物，其特征是上游引物Pl為5’ -CACACRRTffATWGGMACWGC-3‘ -3，， 下游引物P2:5’ -YTCWGCRTARAAKAGCTTCC-3‘；P3 為5’ -TACTGCAAATCCTAACACCAAAAACC-3’P4 為5’ TCAGAGCAATGAGACCGGATAACGCC-3，，5’ P 為5’ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，5’ NP 為5’ -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’ ；P5 為HPT P3 5' -ATGGTACCGGTACACACAGTCTTGGC-3，，P6 為5’ -AGGGTACTACCGATTTGTATGGAAGC-3’ -3，，3’ P 為5’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’，3’ NP 為5’ -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3，。P7 :5’ -CGTCTAGAATGCTAAACTCAGATGAAAGG-3’P8 :5’ -CGCTCGAGTCAGATGAAAGGAAAAATG-3’其中R = A or G ;Y = C or T ;K = G or T = A or T ;M = A or C。
5.權(quán)利要求1所述的白沙蒿尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(AsHPT)基因在油料作物的轉(zhuǎn)基因工作中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的白沙蒿尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(AsHPT)基因在牧草作物的轉(zhuǎn)基因工作中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的白沙蒿尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(AsHPT)基因在在除權(quán)利要求4或5 所述的植物外的植物中的轉(zhuǎn)基因工作中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的白沙蒿尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(AsHPT)基因在在除植物外的其它生物的轉(zhuǎn)基因工作中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)白沙蒿尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(AsHPT)基因的序列，以及這種基因序列的制備方法和用途。白沙蒿尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(AsHPT)基因的制備是用白沙蒿的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再根據(jù)其它植物的(AsHPT)基因保守區(qū)設(shè)計(jì)相應(yīng)的簡(jiǎn)并引物與巢式引物進(jìn)行擴(kuò)增得到白沙蒿尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(AsHPT)基因的全長(zhǎng)翻譯區(qū)核苷酸序列；利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行的功能驗(yàn)證證明該基因表達(dá)可以使煙草葉片和種子維生素E含量分別升高7.6倍和9.8倍。本發(fā)明的白沙蒿尿黑酸葉綠基轉(zhuǎn)移酶(AsHPT)基因可用在油料作物、牧草作物以及其它的植物或非植物的轉(zhuǎn)基因工作中。
文檔編號(hào)C12N15/84GK102367446SQ20111028103
公開(kāi)日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2011年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者傅華, 張一弓, 張麗靜, 趙亞民 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)