專利名稱：一種叔醇水解酯酶、編碼基因、載體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種叔醇水解酯酶及其編碼基因，以及含有該編碼基因的載體和利用該載體轉(zhuǎn)化獲得的重組基因工程菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酯酶是一種能水解脂肪酸酯產(chǎn)生游離脂肪酸，將油脂水解為脂肪酸及甘油，同時也能催化酯合成和酯交換的酶。酯酶作為一類重要的生物催化劑，因其具有選擇性高、催化反應(yīng)條件溫和、無污染等特點，其在輕工、化工、醫(yī)藥、食品等行業(yè)有廣泛的用途。近年來，隨著非水酶學(xué)和界面酶學(xué)的不斷深入，酯酶應(yīng)用也不斷地擴(kuò)展，被廣泛應(yīng)用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中間體的選擇性基團(tuán)保護(hù)、高聚物的合成、肽合成等方面，因此該酶的應(yīng)用前景十分廣闊。近年來，將生物催化劑應(yīng)用于有機(jī)相中催化化學(xué)反應(yīng)已經(jīng)成為生物催化領(lǐng)域中的研究熱點。因其在有機(jī)相中催化具有諸多優(yōu)點如底物在有機(jī)相中溶解度高；產(chǎn)物易于回收；在有機(jī)相中能促進(jìn)反應(yīng)熱力學(xué)平衡向正向移動；酶作為生物催化劑具有高度的區(qū)域選擇性和立體選擇性，在有機(jī)相中可一定程度上提升酶的立體選擇性；生物催化酶在有機(jī)相中熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，因而可以提高反應(yīng)溫度增加反應(yīng)速度等等。酯酶作為一類廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等行業(yè)的重要生物催化劑，在有機(jī)相中的生物催化具有極其重要的應(yīng)用，例如在有機(jī)相中低水環(huán)境下能催化合成難溶于水的醫(yī)藥中間體和精細(xì)化工品，能運(yùn)用在一些重要藥物中間體的手性拆分中等等。然而，大多數(shù)的生物催化酶在有機(jī)溶劑中酶活性會受到極大影響，使其難以實現(xiàn)規(guī)模化的工業(yè)生產(chǎn)。在有機(jī)介質(zhì)中維持較高的酯酶活性及酯酶催化底物的廣泛性，是當(dāng)今生物催化過程中面臨的難題。因此，開發(fā)高活性、有機(jī)溶劑穩(wěn)定性強(qiáng)的酯酶具有巨大的應(yīng)用潛能。叔醇底物是一類非常有價值的手性平臺基化合物，可以廣泛的用于藥物中間體的合成，但是手性叔醇類底物具有較強(qiáng)的空間位阻，因此其化學(xué)合成工藝構(gòu)建是十分具有挑戰(zhàn)的，目前在大量合成高純度的手性叔醇工藝開發(fā)上，尤其是綠色環(huán)保的工藝，仍然具有十分迫切的需要。近年來，人們發(fā)現(xiàn)具備GGG(A)X結(jié)構(gòu)域特征的酯酶，因為在活性中心特異的苷氨酸側(cè)鏈，可以提供一個較大的底物結(jié)合位點，能夠高效的催化含有手性叔醇酯底物的水解，因此該類酯酶催化的手性叔醇酯底物的工藝具備廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種叔醇水解酯酶、編碼基因及其應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種叔醇水解酯酶htC23，所述叔醇水解酯酶具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列或其保守性變異多肽序列。所述保守性變異多肽，是指記載的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失或插入附加氨基酸序列，但不足以改變其性能，仍具有酯酶活性。優(yōu)選的，所述叔醇水解酯酶氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示
MSQQQLESIIQMLKSQPIAGKPSIAETRAGFEQMAAMFPVEADVKSEPVNAGGVKSEWVTAPGADPGRA VLYLHGGGYVIGSISTHRSFAGRISRAAKARVLVIDYRLAPEHPFPAAVEDSVAAYRWMLSTGLKPSRIAVA⑶SAG GGLTVATLVAIRDAKLPVPAAGVALSPWVDMEGVGDSMKTKAAVDPMVQKDGLIEMAKAYLGGKDPRTPLAAPLYAD LAGLPPLLIQVGTAETLLDDSTRLAERARKAGVKVTLEPWENMVHVFQIFASILDEGQQAIDKIGAFIRANAE.。本發(fā)明中所述酯酶與常規(guī)酯酶相比，具備活性高、耐受有機(jī)溶劑穩(wěn)定性好，并且PH 耐受范圍廣等特征。
本發(fā)明還涉及一種所述叔醇水解酯酶的編碼基因。 優(yōu)選的，所述編碼基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示atgtcacaac aacagcttga atcaattatc cagatgctca agtcgcagcc tatcgcgggcaaaccctcga ttgcggagac ccgcgcggga tttgagcaga tggccgcgat gtttccggtcgaggctgacg tgaagagcga gccggtcaat gcgggcggcg tcaagtcaga atgggtgacggcgccgggcg cggacccggg ccgcgcggtg ctttacctgc acggtggcgg ctacgttatcggctcgatca gtacgcatcg ctcgttcgcg ggacgaatct cgcgcgctgc caaagcgcgagtgctggtga tcgactaccg gctcgcgcct gagcatccgt ttcccgcagc ggtcgaggattccgtcgccg catatcgctg gatgctctcg accgggttga agccctcgcg aatcgcagtcgcgggagact ccgccggtgg cggtctgacg gttgcgacgc tggtcgcgat tcgcgatgcgaagcttccag ttccggccgc gggtgtggcg ctgtcgccgt gggtcgatat ggaaggagtcggcgattcga tgaagacgaa ggcggctgtc gatccgatgg tccagaaaga cggcctgatcgagatggcaa aggcttatct cggcggcaag gatccgcgca cgccgctcgc cgcgccgctctatgccgacc tcgccggtct cccgccgctg ctgatccagg tcggcaccgc ggagactctgctcgacgact cgacgcggct agcggagcgc gcgcgcaagg cgggagtgaa ggtaacgctggaaccgtggg aaaatatggt ccacgtcttc cagatcttcg cgtcgattct cgacgaagggcagcaggcga tcgacaaaat tggagcgttc atccgcgcca acgccgagta a。編碼本發(fā)明酯_htC23蛋白質(zhì)的核苷酸序列可以編碼包括在一個或者多個位置上的一個或幾個氨基酸的缺失、取代、插入或者添加在內(nèi)的&憂23蛋白質(zhì)，且不破壞由其編碼的htC23蛋白質(zhì)的酯酶活性。例如通過修飾所述的核苷酸序列可以得到編碼與上述 EstC23蛋白質(zhì)基本相同的蛋白質(zhì)的DNA，通過定向誘變、易錯PCR、DNA重組、DNA雜交等技術(shù)從而使一個、多個或者部分氨基酸片段涉及到缺失、取代、插入或者添加，通過公知的突變處理可以獲得如上所述進(jìn)行了修飾的DNA。在適合的異源表達(dá)宿主中以多拷貝表達(dá)經(jīng)歷了如上所述的進(jìn)行修飾獲得的DNA， 可以獲得編碼與&憂23蛋白質(zhì)基本相同的蛋白。眾所周知的是蛋白質(zhì)的氨基酸序列與編碼它的核苷酸序列可以在菌種、菌株、突變株或者變株之間稍有不同，因此編碼基本上相同蛋白質(zhì)的核苷酸可以在埃希氏大腸桿菌的菌種、菌株、突變株或者變株中實現(xiàn)表達(dá)并獲得基本上相同的蛋白。因此，與前述SEQ ID NO. 1核苷酸序列相比具有不低于70%的同源性的DNA，以及包括不低于70%的同源性DNA的特異性雜交體可編碼具有酯酶活性的蛋白質(zhì)的DNA，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明還涉及含有所述編碼基因的重組載體，以及利用所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的
重組基因工程菌。本發(fā)明所述編碼基因可用于制備重組叔醇水解酯酶。
權(quán)利要求
1.一種叔醇水解酯酶，其特征在于所述叔醇水解酯酶具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列或其保守性變異多肽序列。
2.如權(quán)利要求1所述的叔醇水解酯酶，其特征在于叔醇水解酯酶氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.—種權(quán)利要求1所述叔醇水解酯酶的編碼基因。
4.如權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。
5.含有權(quán)利要求3所述編碼基因的重組載體。
6.一種利用權(quán)利要求5所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。
7.權(quán)利要求3所述編碼基因在制備重組叔醇水解酯酶中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為構(gòu)建含有權(quán)利要求3所述編碼基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)， 培養(yǎng)液分離得到含有重組叔醇水解酯酶的菌體細(xì)胞，菌體細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞碎、分離純化獲得所述重組叔醇水解酯酶。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述編碼基因核苷酸序列如SEQID NO. 1所
10.權(quán)利要求1所述叔醇水解酯酶在水解結(jié)構(gòu)如式(I)所示的叔醇酯中的應(yīng)用；
全文摘要
本發(fā)明提供了一種叔醇水解酯酶及其編碼基因，以及含有該編碼基因的載體和利用該載體轉(zhuǎn)化獲得的重組基因工程菌及其應(yīng)用。所述叔醇水解酯酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或其保守性變異多肽序列。本發(fā)明的酯酶易于原核表達(dá)，可以采用本專利中所述的重組載體、菌株及制備方法高效生產(chǎn)本發(fā)明酯酶；而且，本發(fā)明酶的制備方法簡便高效，易于大量表達(dá)，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/15GK102321594SQ20111024542
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者吳慧麗, 杜鵬飛, 熊小龍, 王秋巖, 金鵬 申請人:杭州師范大學(xué)