專利名稱：一種與奶牛氧化應(yīng)激相關(guān)性狀檢測(cè)的分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種與奶牛氧化應(yīng)激相關(guān)性狀檢測(cè)的分子標(biāo)記的制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國(guó)的奶牛業(yè)歷史悠久，但規(guī)?；a(chǎn)起步較晚，相對(duì)于發(fā)達(dá)國(guó)家來(lái)說(shuō)，還是存在一定的差距。牛奶對(duì)提高國(guó)民身體素質(zhì)的重要性是毋庸質(zhì)疑的，由于飲食習(xí)慣的差異，牛奶被大眾普遍接受經(jīng)歷了一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程。在我國(guó)，居民的人均擁有牛奶是25kg/年，只相當(dāng)于世界平均水平的1/13，同時(shí)奶牛業(yè)發(fā)展呈現(xiàn)南北不平衡，由于氣候，飼料資源等一系列原因，北方占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。奶牛是喜寒怕熱的動(dòng)物，在我國(guó)的南方，每年的7-9月份的高溫天氣， 會(huì)使奶牛產(chǎn)生熱應(yīng)激，往往造成產(chǎn)奶量的大幅下降和疾病的增加，使經(jīng)濟(jì)蒙受損失，這是一個(gè)不能避免的因素。彈丸之國(guó)以色列，位于亞洲西部，是亞、非、歐三大洲結(jié)合處，氣候炎熱干旱，缺乏水源和飼料資源，飼養(yǎng)奶牛條件比較差，但是他們結(jié)合本國(guó)的情況，依靠自主創(chuàng)新、科技投入和奶業(yè)協(xié)會(huì)的有效協(xié)調(diào)，使以色列成為世界著名的奶業(yè)強(qiáng)國(guó)，除了先進(jìn)的生產(chǎn)管理，另一個(gè)重要因素是加強(qiáng)了抗熱應(yīng)激奶牛品種的選育。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化左旋精氨酸(L-Arg)和分子氧產(chǎn)生的一氧化氮(notric oxide, NO)是炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激中重要的相關(guān)氣使分子之一。NO的生理效應(yīng)有兩面性，一方面可通過(guò)使cGMP升高激活蛋白激酶，發(fā)揮血管擴(kuò)張作用，抑制血小板聚集與粘附；通過(guò)與谷氨酸琉基結(jié)合下調(diào)谷氨酸受體調(diào)控的離子通道，防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載，防止NO+向N0_轉(zhuǎn)變，起到細(xì)胞保護(hù)作用。另一方面NO在高濃度狀態(tài)下，又可與超氧陰離子(Superoxide anion radical,O2-)反應(yīng)，生成超氧亞硝酸根離子(peroxyntrite,0N00_)，也可引起細(xì)胞核酸亞硝?；?，破壞DNA結(jié)構(gòu)及形成亞硝酞鐵絡(luò)合物，抑制細(xì)胞呼吸DNA復(fù)制相關(guān)的酶活性，發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。(司良毅，1999)NOS作為NO合成的關(guān)鍵酶，在NO的生成調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。迄今有多研究證實(shí)三種基因編碼不同，但結(jié)構(gòu)相似的一氧化氮亞型誘導(dǎo)型N0S(inducibleN0S，iNOS)、神經(jīng)型NOS (neuronal NOS, nNOS)和內(nèi)皮型 NOS endothelial N0S，eNOS)，(陳丹，2008)通過(guò)研究肢體缺血再灌注大鼠腦組織中iNOS、nNOS、eNOS的mRNA的表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)腦組織中的MDA含量和SOD的活性，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，在缺血再灌注4h組，MDA的含量達(dá)到最高，SOD的活力下降到最低。與對(duì)照組差異顯著(P < 0. 05)，iNOS、nNOS、eNOS的表達(dá)量與SOD的活力呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為(r = -O. 340，-O. 415，-O. 310)，說(shuō)明NOS的三種基因的超表達(dá)會(huì)對(duì)缺血再灌注后的腦組織構(gòu)成氧化損傷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于擴(kuò)增奶牛NOSl基因的部分DNA序列，以尋找該基因突變位點(diǎn)多態(tài)性，篩選一種與奶牛氧化應(yīng)激相關(guān)性狀檢測(cè)的分子標(biāo)記。本發(fā)明還包括該分子標(biāo)記在奶牛標(biāo)記輔助選擇上的應(yīng)用。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種篩選奶牛氧化應(yīng)激相關(guān)基因NOSl分子標(biāo)記，按照以下步驟從Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ensembl.org)中獲得基因登錄號(hào)為ENSBTAG00000002023的牛NOSl基因DNA序列，以該基因的DNA序列設(shè)計(jì)引物；從牛血液基因組中提取總DNA，PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化，獲得如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，通過(guò)PCR-RFLP進(jìn)行基因型檢測(cè)和分型，在該序列表SEQ ID NO 1中的第121bp處有一個(gè)A121-G121的堿基突變，導(dǎo)致Hae III -RFLP多態(tài)性；以及，在該序列的第149bp處有一個(gè)C149-T149的堿基突變，導(dǎo)致Alu I -RFLP多態(tài)性。此處的第121bp處的堿基相當(dāng)于牛NOSl基因DNA序列全序列的371bp處，第149bp處相當(dāng)于牛NOSl基因DNA序列全序列的399bp處(在圖3，4，5，6中所示的序列中堿基對(duì)應(yīng)的位置是按照牛NOSl基因DNA序列全序列統(tǒng) 計(jì)的，而圖2和序列表SEQ ID NO 1是牛NOSl基因的片段及部分DNA序列)。更詳細(xì)技術(shù)細(xì)節(jié)如《具體實(shí)施方式
》所述。


序列表SEQ ID NO 1是本發(fā)明制備的分子標(biāo)記的核苷酸序列(牛NOSl基因的部分DNA序列)，序列長(zhǎng)度為300bp，在序列表SEQ ID NO 1的第121bp處有一個(gè)A121-G121的堿基突變，導(dǎo)致Hae III -RFLP多態(tài)性；同時(shí)在該序列的第149bp處有一個(gè)C149-T149的堿基突變，導(dǎo)致Alu I -RFLP多態(tài)性。圖I :是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2 :是本發(fā)明擴(kuò)增的NOSl基因的部分DNA片段(其對(duì)應(yīng)于上述序列表SEQ IDNO 1所示的序列，序列中的英文字母“R”，分別代表突變位置，括號(hào)內(nèi)顯示堿基替換)。圖3 :是用于PCR直接測(cè)序的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。瓊脂糖濃度為I. 5%。其中1-5泳道為PCR產(chǎn)物，長(zhǎng)度為345bp，M泳道DNA分子量標(biāo)記(IOObp DNA ladder)。圖4，圖5 :是371bp處和399bp處PCR測(cè)序的彩峰圖(此處的371bp處和399bp是NOSl基因的全序列中所處的位置，其中該371bp就是本發(fā)明擴(kuò)增的如SEQ ID NO :1序列所示的121bp，399bp就是本發(fā)明擴(kuò)增的如SEQ ID NO 1序列所示的149bp)。圖6 :是奶牛NOSl基因序列A121-G121和C149-T149的多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :牛NOSl基因部分DNA序列的擴(kuò)增及其多態(tài)性檢測(cè)I、奶牛NOSl基因部分DNA序列的擴(kuò)增I. I引物設(shè)計(jì)根據(jù)Ensembl提供的牛NOSl基因(基因登錄號(hào)ENSBTAG00000002023)的序列設(shè)計(jì)引物對(duì)，該引物對(duì)的核苷酸序列如下正向引物5’ -CACCACCAGCGTCTGCTCT-3 ’，反向引物5 ’ -GCCGCGGAGCAAAGCGGCCTCATCC-3，。I. 2奶牛血液基因組DNA的提取與檢測(cè)(I)分離白細(xì)胞(2)在含有白細(xì)胞的試管中加入Iml的I XSET，加入200ul蛋白酶K(10mg/ml)，10%十二烷基硫酸鈉(SDS) lOOul。置入恒溫水浴鍋55°C消化過(guò)夜。(3)加入等體積的平衡酚，(pH = 8. O)，緩慢顛倒離心管lOmin，以使管內(nèi)溶液混勻，4°C 8000rmp,離心 IOmin0(4)小心吸取上層含有DNA的上清液，移至另一離心管，再加入苯酚重復(fù)步驟(3)(5)同法，吸上清，加入等體積的平衡酚/氯仿/異戊醇(體積比為25 24 I),緩慢顛倒離心管lOmin,4°C 8000rmp離心lOmin。(6)吸上清后加入氯仿/異戊醇(體積比24 : I),緩慢顛倒離心管10MIN，與以上相同的離心條件。(7)吸上清，加入1/10體積的NaAc (3M，PH = 5. 2)及2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，振蕩離心管可見白色的絮狀物，即DNA，于-20°C放置30min?！?br> (8)取出冷凍后的樣品，于12000rmp高速離心5_8min,棄掉上層乙醇。(9)加入lmL70%的乙醇洗漆沉淀，同速離心5_8min。(10)小心棄掉70%乙醇，在室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇，加入適量的TE溶解DNA。(11)充分溶解后的DNA樣可在I. 5%瓊脂糖膠上電泳檢驗(yàn)，同時(shí)在DNA濃度測(cè)定儀上測(cè)定濃度。(12)或按照?qǐng)?bào)道的常規(guī)方法稀釋成一定濃度，存放于_20°C的冰箱內(nèi)備用。1.3 PCR 擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系為 20ul : 10 XBuffer (含 Mg2+) 2. Oul，IOmM dNTP I. 6ul，4uM 上引物、下引物各O. 4ul，5U/ul Taq酶O. 4ul，500ng/ul DNA I. 0ul,ddH20 14. 2ul，混勻，瞬時(shí)離心。擴(kuò)增條件為94°C預(yù)熱5min — 94°C變性 30s — 58. 2°C (67. 2°C >63. 9°C >67. 6°C )退火30s — 72°C延伸30s(從第二步變性到第四步進(jìn)行30個(gè)循環(huán))，然后72°C延伸5min — 16°C 6min。4°C保存。PCR產(chǎn)物用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。2、PCR-SSCP檢測(cè)及測(cè)序?qū)ふ襍NP位點(diǎn)2. I PCR-SSCP 檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，取5ul擴(kuò)增產(chǎn)物加入溴酚藍(lán)變性劑混合物(O. 25%溴酚藍(lán)變性劑=I 4)10111，991變性101^11，變性結(jié)束后立即將？0 管置于冰水混合物上冰浴2min，防止DNA單鏈復(fù)性。然后在交聯(lián)度為39 I的10%的聚丙烯酰胺凝膠上點(diǎn)樣進(jìn)行電泳檢測(cè)。(I) 10%非變性聚丙烯酰胺凝膠的配置(總體積35ml)
30%丙烯醜胺溶液11.7ml
ddH2016.1ml
5 X TBE 緩沖液7.0ml
10%AP23 Oul
TEMED 20ul將以上溶液于小燒杯中混合搖勻。(2)上樣、電泳凝膠聚合后拔出梳子，用注射器吸取I X TBE緩沖液(先制成5 X TBE儲(chǔ)備液，配方為稱取54gTris堿和27. 5g硼酸溶于750ml雙蒸水中，加入20ml O. 5MEDTA(PH = 8· O)，加水定容至IL ;然后稀釋成1XTBE)沖洗梳孔，以除去未聚合的膠液，使樣品容易沉降。組裝好電泳設(shè)備，用I. 5%瓊脂糖膠液封閉好玻璃板與電泳槽之間的縫隙，防止電泳緩沖液滲漏。在上下緩沖槽中倒入足量I XTBE緩沖液，用50ul移液器將PCR變性產(chǎn)物緩緩注入梳孔。上樣完畢后開啟電泳儀，開始用高壓250V電泳30min，后改用115V電壓電泳12個(gè)小時(shí)，直至二甲苯氰電泳指示條帶遷移到凝膠底部。(3)凝膠染色電泳完畢，取下玻板，小心地將凝膠從玻板上剝離下來(lái)，放入雙蒸水中漂洗一次，然后500ml固定液(無(wú)水乙醇45mL+冰醋酸2. 5mL加至500mL)放入搖床5_10min ;用雙蒸水漂洗后，加入500ml染色液(硝酸銀O. 75g+500mL水+37%甲醛O. 75mL)，加入甲醛，用黑色塑料袋包裹避光，脫色6-8min ;用雙蒸水沖洗后，加入500ml顯色液(無(wú)水NaOH 7. 5g+雙蒸水500mL+37%甲醛ImL)，并加入甲醛，直至黃色背景和條帶出現(xiàn)為止；用水停顯，用白光板觀察染色效果。
(4)凝膠成像與電泳條帶分析講目標(biāo)條帶清晰的凝膠在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行掃描并保存電泳圖譜。根據(jù)電泳條帶判斷基因型。2. 2 PCR產(chǎn)物的純化與測(cè)序在紫外燈下從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mlEpendorff管中，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)純化PCR產(chǎn)物。純化方法在I. 5ml離心管中加入400ul吸附液，在凝膠完全溶解之前將其放置在室溫中，且不時(shí)進(jìn)行攪拌，如果想要快速溶解瓊脂糖凝膠或者凝膠難以溶解時(shí)，放入55°C水浴鍋溫浴5min，加入30ul磁珠，經(jīng)常用漩渦攪拌器攪拌，并放置2min (室溫)，然后放入離心機(jī)(6000rpm, 5sec),加入 600ul 洗凈液，攬祥 IOsec,離心(6000rmp, 5sec),加入 Iml 75%無(wú)水乙醇，攪拌lOsec，瞬時(shí)高速離心，徹底去除上清部分(打開微型試管的蓋子，55°C下放置5min,干燥),加入25_200ul蒸懼水,攪拌IOsec,放置2min后離心(6000rmp, 5sec),回收上清液。上清液中含有回收的目的片段。從兩個(gè)樣品的品種中分別挑選幾個(gè)DNA樣品送到上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。2. 3 DNA序列比對(duì)及突變位點(diǎn)的鑒定用測(cè)序獲得的基因序列進(jìn)行序列同源性比較，用DNASTAR5. 01軟件和PRMER5.軟件對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行了分析，以鑒定和獲得該DNA序列的突變信息。3、PCR-RFLP診斷方法的建立3.1 PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增如前面所述(見I. 3)3. 2 PCR產(chǎn)物酶切正向引物CACCACCAGCGTCTGCTCT，反向引物GCCGCGGAGCAAAGCGGCCTCATCC；引物酶切反應(yīng)體系為IOul :限制性內(nèi)切酶Alu I O. 5ul，10X緩沖液Iul，PCR產(chǎn)物4ul，加ddH20至IOul，55°C條件下水浴酶切3_4個(gè)小時(shí)。3. 3 PCR-RFLP 檢測(cè)
酶切產(chǎn)物檢測(cè)由于酶切后各片段之間的長(zhǎng)度差異性較小，瓊脂糖凝膠電泳的靈敏度較差，所以選用聚丙烯酰胺凝膠來(lái)檢測(cè)，所用的丙烯酰胺交聯(lián)度為29 I濃度為8%的凝膠。每板膠35ml,配制方法
權(quán)利要求
1.一種與奶牛氧化應(yīng)激相關(guān)性狀檢測(cè)的分子標(biāo)記，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NOI所示，在該序列表SEQ ID NO 1中的第121bp處有一個(gè)A121-G121的堿基突變，導(dǎo)致HaeIII -RFLP多態(tài)性；以及，在該序列的第149bp處有一個(gè)C149-T149的堿基突變，導(dǎo)致AluI -RFLP多態(tài)性。
2.一種檢測(cè)如權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記的引物對(duì)，其核苷酸序列如下所示 正向引物5’ -CACCACCAGCGTCTGCTCT-3’ 反向引物5’ -GCCGCGGAGCAAAGCGGCCTCATCC-3’。
3.權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記在奶牛標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述引物對(duì)在奶牛標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種與奶牛氧化應(yīng)激相關(guān)性狀檢測(cè)的分子標(biāo)記及應(yīng)用。從牛NOS1基因中克隆得到一特異片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，其中在序列表SEQ ID NO1的第121bp處有1個(gè)A121-G121的堿基突變，導(dǎo)致HaeⅢ-RFLP多態(tài)性；在序列表SEQ ID NO1第149bp處有一個(gè)C149-T149的堿基突變，導(dǎo)致Alu Ⅰ-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明為奶牛分子標(biāo)記輔助選擇提供了一種新標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102899320SQ201110218960
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月30日
發(fā)明者易建明, 周雄濤, 張淑君, 張軍偉, 張琨 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)