專(zhuān)利名稱(chēng)：一種黃牛tmem18基因的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測(cè)，特別涉及一種檢測(cè)黃牛TMEM18基因第3843位和第3873位單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。因此，通常所說(shuō)的SWs包括堿基的替換、插入、缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。一個(gè)SNP表示在基因組某個(gè)位點(diǎn)上有一個(gè)核苷酸的變化，主要由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起；具有轉(zhuǎn)換型變異的SNPs約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG 二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因內(nèi)或附近都可能找到數(shù)量不等的SNPs，根據(jù)它們?cè)诨蚪M中分布的位置可分為基因編碼區(qū)SNPs (cSNPs)、基因周邊SNPs (pSNPs)和基因間 SNPs(iSNPs)等三類(lèi)。總的說(shuō)來(lái)，cSNP比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)的變異率僅占周?chē)蛄械?1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關(guān)注。根據(jù)對(duì)遺傳性狀的影響， cSNPs又可分為兩種一種是同義cSNPs，即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)中氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的“含義”相同；另一種是非同義cSNPs，即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。因此，對(duì)編碼區(qū)SNPs的非同義突變來(lái)說(shuō)，它們可能對(duì)基因功能有直接的重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳標(biāo)記在群體遺傳和生物進(jìn)化的研究中也具有重要意義。由于SNPs是二等位基因分子標(biāo)記，所以，理論上在一個(gè)二倍體生物群體中，SNPs 可能是由2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)等位基因構(gòu)成，但實(shí)際上3個(gè)或4個(gè)等位基因的SNPs很罕見(jiàn)， 故SWs通常被簡(jiǎn)單地稱(chēng)為二等位基因分子標(biāo)記。目前，主要采用幾種不同的路線來(lái)發(fā)現(xiàn) SNPs 即DNA序列測(cè)定方法、PCR-SSCP與DNA測(cè)序結(jié)合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)等。在這些SNP檢測(cè)技術(shù)中，DNA序列測(cè)定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測(cè)方法， 但是，其檢測(cè)費(fèi)用極其昂貴，且需要有DNA測(cè)序儀等大型儀器，同時(shí)，在測(cè)序過(guò)程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗(yàn)，所以，DNA序列測(cè)定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的理想SNP檢測(cè)方法；當(dāng)然，利用PCR-SSCP與DNA測(cè)序結(jié)合法檢測(cè)SNP可以適當(dāng)降低檢測(cè)費(fèi)用，但是， PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)過(guò)程比較長(zhǎng)，操作比較繁瑣，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在假陽(yáng)性問(wèn)題，所以，也并非理想的SNP檢測(cè)手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測(cè)方法，在未來(lái)的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計(jì)特別的引物，且只能針對(duì)特定的基因位點(diǎn)，同時(shí)， 檢測(cè)過(guò)程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點(diǎn)；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)SNP位點(diǎn)，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)于一般的分子實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)可實(shí)施性不強(qiáng)。PCR-RFLP方法是一種檢測(cè)SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)后使用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別SNP位點(diǎn)。PCR-RFLP方法不僅具有DNA測(cè)序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣操作、假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，而且所檢測(cè)的序列位點(diǎn)無(wú)特殊性要求?？缒さ鞍?8(TMEM18)基因是通過(guò)GWA方法鑒定的與人類(lèi)肥胖相關(guān)的重要基因， 同 FTO 基因和 MC4R 基因一樣，TMEM18 基因起源很早(Cristen J Wilier, Elizabeth K Speliotes, Ruth J F Loos, et al. Six new loci associated with body mass index hightlight a neuronal influence on body weight regulation. Nature genetics 2008 ； 41 :25-34.)。TMEM18基因主要是在神經(jīng)細(xì)胞中大量表達(dá)，其它組織肝臟，肺，腦垂體以及卵巢附睪中也有表達(dá)。黃牛TMEM18基因定位于1號(hào)染色體上，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成， 它的⑶S區(qū)長(zhǎng)419bp，共編碼140個(gè)氨基酸。TMEM18基因與皮下脂肪調(diào)節(jié)相關(guān)(Funda E. Orkunoglu-Suer，Brennan T. Harmon, et al. MC4R Variant Is Associated With BMI but Not Response to Resistance Training in Young Females. Obesity 2011 ；19 :662-666)。TMEM18蛋白是擁有三個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域的膜蛋白(Markus Sallman Almen, Karl JV Nordstrom, Robert Fredriksson, et al. Mapping the human membrane proteome :a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC biology 2009 ;7 :50.)有關(guān)該蛋白功能的報(bào)道非常少，Jaana Jurvansuu等(Jaana Jurvansuu, Ying Zhao, Doreen S. Y. Leung, et al ；Transmembrane Protein 18 Enhances the Tropism of Neural Stem Cells for Glioma Cell. Cancer research 2008 ；68 4614-4622.)的研究顯示，內(nèi)源性的TMEM18蛋白對(duì)于細(xì)胞遷移有重要的作用，該蛋白的過(guò)表達(dá)將會(huì)促進(jìn)刺激遷移信號(hào)途徑的應(yīng)答?，F(xiàn)在關(guān)于TMEM18基因的研究主要集中在對(duì)人類(lèi)及小鼠肥胖的影響方面(Cathy E Elks，John R B Perry, Patrick Sulem，et al ；Thirty newloci for age at menarche identified by a meta-analysis of genenome-wide association studies. Nature genetics 2010;42:1077-1085)。目前的研究發(fā)現(xiàn)，TMEM18基因的多態(tài)性對(duì)于不同人種、 不同年齡階段的肥胖都有一定的影響(Cathy E Elks，John R B Perry，Patrick Sulem, et al ；Thirty new loci for age at menarche identified by a meta-analysis of genenome-wide association studies. Nature genetics 2010 ；42 :1077-1085.)，該基因與牛生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析研究還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于利用PCR-RFLP方法檢測(cè)黃牛TMEM18基因的多態(tài)性，并將其與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，驗(yàn)證其是否可以作為黃牛分子育種中輔助選擇的分子標(biāo)記， 從而加快良種選育速度。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種檢測(cè)黃牛TMEM18基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含TMEM18基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，分別以引物對(duì)IF和2F為引物，PCR擴(kuò)增黃牛TMEM18基因；分別用限制性?xún)?nèi)切酶XspI和MluI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛TMEM18基因第3843和3873位的單核苷酸多態(tài)性；1.所述的引物對(duì)IF為:正向上游引物5，-GGCATGTTCATCTCCCTTGT-3，，反向下游引物5，-GCCCTGCACTGCTGTTTGTCC-3，，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min ；30個(gè)循環(huán)94°C變性30s，66°C退火 45s，72°C延伸 45s ；72°C終延伸 IOmin0所述的瓊脂糖凝膠電泳的質(zhì)量濃度為1. 5%。所述根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛TMEM18基因第3843位的單核苷酸多態(tài)性為AA基因型表現(xiàn)為247和的條帶；GG基因型表現(xiàn)為412bp的條帶；AG基因型表現(xiàn)為412、247和165bp的條帶。2.所述的引物對(duì)2F為:正向上游引物5，-AGCAGCCTGCTGTCCATACACGC-3，，
反向下游引物5，-GGGAGGGCCCTGCACTGCTGTTAG-3，，所述引物對(duì)的上游引物為引入MluI錯(cuò)配的引物。所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；30個(gè)循環(huán)94°C變性30s，68°C退火 30s，72°C延伸 30s ；72°C終延伸 IOmin0所述的瓊脂糖凝膠電泳的質(zhì)量濃度為3. 0%。所述根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛TMEM18基因第3873位的單核苷酸多態(tài)性為AA基因型表現(xiàn)為160bp條帶；GG基因型表現(xiàn)為143和17bp條帶；AG基因型表現(xiàn)為160、 143和17bp條帶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供的黃牛TMEM18基因單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，第3843位G到A的轉(zhuǎn)換突變?cè)斐梢粋€(gè))(spl自然酶切位點(diǎn)的產(chǎn)生，而針對(duì)第3873位G到A的轉(zhuǎn)換突變，通過(guò)引物設(shè)計(jì)人為的在上游引物的5’端引入堿基錯(cuò)配，當(dāng)由A突變成G時(shí)，PCR擴(kuò)增TMEM18基因后在錯(cuò)配位置形成限制性?xún)?nèi)切酶MluI識(shí)別位點(diǎn)，而突變沒(méi)有發(fā)生時(shí)，PCR擴(kuò)增TMEM18基因后不能形成MluI識(shí)別位點(diǎn)；通過(guò)電泳檢測(cè)分型可以準(zhǔn)確、快速、方便的同時(shí)檢測(cè)到TMEM18基因在第3843位和第3873位的單核苷酸多態(tài)性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明把測(cè)序技術(shù)篩查SNP和CRS-RFLP技術(shù)結(jié)合起來(lái)解決了 SSCP的不穩(wěn)定性和普通RFLP的局限性，提供了一種用簡(jiǎn)單、快速、低成本、精確度高的，便于推廣應(yīng)用在DNA水平上篩查和檢測(cè)與黃牛生產(chǎn)性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記，可用于黃牛的分子育種。本發(fā)明對(duì)5個(gè)黃牛品種的SNP基因型進(jìn)行了檢測(cè)和基因頻率分析，對(duì)上述SNP位點(diǎn)與黃牛部分生長(zhǎng)性狀(初生重、體重和日增重)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為T(mén)MEM18基因的SNP與生長(zhǎng)性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國(guó)黃牛生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。


圖1為黃牛TMEM18基因，以引物對(duì)IF擴(kuò)增的包括XspI酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物電泳圖，目的條帶為412bp。圖2為黃牛TMEM18基因3843位呈現(xiàn)出多態(tài)性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖；圖3為黃牛TMEM18基因XspI酶切的電泳圖；AA基因型表現(xiàn)為247和的條帶；GG基因型表現(xiàn)為412bp的條帶；AG基因型表現(xiàn)為412、247和的條帶。圖4為黃牛ΤΜΕΜ18基因，以引物對(duì)2F擴(kuò)增的包括引入錯(cuò)配形成的MluI酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物電泳圖，目的條帶為160bp。圖5為黃牛TMEM18基因3873位呈現(xiàn)出多態(tài)性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖；圖6為黃牛TMEM18基因MluI酶切的電泳圖；AA基因型表現(xiàn)為160bp條帶；GG基因型表現(xiàn)為143和17bp條帶；AG基因型表現(xiàn)為160、143和17bp條帶。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明利用PCR-RFLP方法對(duì)黃牛TMEM18基因第3843位和第3873位密碼子突變可能產(chǎn)生編碼蛋白表達(dá)水平發(fā)生變化的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，下面結(jié)合對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。1、黃牛TMEM18基因含第五外顯子區(qū)域PCR引物的設(shè)計(jì)以NCBI所公布的牛(NW_003099175. 1)序列為參考，利用I^rimer 5. 0設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增包含黃牛TMEM18基因第五外顯子區(qū)域的PCR引物，其引物序列如下正向引物5，-TAGGTCCAGTTCTGACCACG-3，，反向引物5，-GCACTGAAGGGCACAAAGAG-3，，以上述引物對(duì)黃?；蚪M擴(kuò)增，能夠擴(kuò)增包含黃牛TMEM18基因(NW_001493824. 2 序列)第五外顯子區(qū)域的基因片段；對(duì)擴(kuò)增的片段進(jìn)行測(cè)序鑒定后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)?843bp的G 突變?yōu)锳時(shí)，導(dǎo)致編碼氨基酸密碼子由GGC突變?yōu)锳GC，從而形成了 Gly-Ser的錯(cuò)義突變； 并且這一突變形成了限制性?xún)?nèi)切酶XspI的酶切位點(diǎn)。而第3873位的突變無(wú)自然酶切位點(diǎn)形成，不能通過(guò)直接酶切檢驗(yàn)，而如果在第3873位處人工設(shè)計(jì)PCR引物錯(cuò)配，由G錯(cuò)配為 C ；當(dāng)該位點(diǎn)由A突變成G時(shí)，2F引物擴(kuò)增TMEM18基因產(chǎn)物的第3869bp 3875bp序列為 ACGCGT，形成了限制性?xún)?nèi)切酶MluI的酶切位點(diǎn)，而突變沒(méi)有發(fā)生時(shí)，PCR擴(kuò)增TMEM18基因后不能形成MluI識(shí)別位點(diǎn)；這樣就可以對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)的SNPs多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。2、以引物IF對(duì)和2F對(duì)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增待測(cè)黃牛的TMEM18基因片段(1)、黃牛樣本的采集本發(fā)明具體以5個(gè)中國(guó)地方黃牛品種的種群作為檢測(cè)對(duì)象，具體采集樣本見(jiàn)表1 河南南陽(yáng)牛025)，陜西秦川牛019)，河南平頂山市郟縣紅牛(389)；山東魯西牛(165)； 吉林草原紅牛(220)。表1黃牛樣本的采集
權(quán)利要求
1.一種黃牛TMEM18基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟以包含黃牛TMEM18基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)IF為引物，PCR擴(kuò)增黃牛TMEM18基因，所述的引物對(duì)IF為，正向上游引物5，-GGCATGTTCATCTCCCTTGT-3，，反向下游引物5，-GCCCTGCACTGCTGTTTGTCC-3，，用XspI限制性?xún)?nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再對(duì)酶切后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛的TMEM18基因第3843位的單核苷酸多態(tài)性；以包含黃牛TMEM18基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)2F為引物，PCR擴(kuò)增黃牛TMEM18基因，所述的引物對(duì)2F為正向上游引物5’ -AGCAGCCTGCTGTCCATACACGC-3，，反向下游引物5，-GGGAGGGCCCTGCACTGCTGTTAG-3，，用MluI限制性?xún)?nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再對(duì)酶切后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛的TMEM18基因第3873位的堿基多態(tài)性。
2.如權(quán)利要求1所述的黃牛TMEM18基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于， 以引物對(duì)IF為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min ；35個(gè)循環(huán)的94°C變性 30s，66°C退火 45s，72°C延伸 45s ；72°C延伸 IOmin0
3.如權(quán)利要求1所述的黃牛TMEM18基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于， 所述的XspI限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別的酶切位點(diǎn)為第3843位所在的酶切位點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求1所述的黃牛TMEM18基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于， XspI酶切后所用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1. 5%。
5.如權(quán)利要求1所述的黃牛TMEM18基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于， 以引物對(duì)2F為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min ；30個(gè)循環(huán)的94°C變性 30s，68°C退火 30s，72°C延伸 30s ；72°C延伸 IOmin0
6.如權(quán)利要求1所述的黃牛TMEM18基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于， 所述的MluI限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別的酶切位點(diǎn)為第3873位所在的酶切位點(diǎn)。
7.如權(quán)利要求1所述的黃牛TMEM18基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于， MluI酶切后所用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為3. 0%。
8.如權(quán)利要求1所述的黃牛TMEM18基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于， 所述的黃牛TMEM18基因第3843位的單核苷酸多態(tài)性為AA基因型表現(xiàn)為247和的條帶；GG基因型表現(xiàn)為412bp的條帶；AG基因型表現(xiàn)為412、247和的條帶。
9.如權(quán)利要求1所述的黃牛ΤΜΕΜ18基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于， 所述的黃牛ΤΜΕΜ18基因第3873位的單核苷酸多態(tài)性為ΑΑ基因型表現(xiàn)為160bp條帶；GG 基因型表現(xiàn)為143和17bp條帶；AG基因型表現(xiàn)為160、143和17bp條帶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)黃牛TMEM18(transmembrane protein 18)基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其基因多態(tài)性包括在黃牛TMEM18基因第3843位為A或G的堿基多態(tài)性；在黃牛TMEM18基因第3873位為G或A的堿基多態(tài)性。上述黃牛TMEM18基因的單核苷酸多態(tài)性為以包含TMEM18基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)1F和2F為引物，PCR擴(kuò)增黃牛TMEM18基因；分別用限制性?xún)?nèi)切酶XspI和MluI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛TMEM18基因第3843位和第3873位的單核苷酸多態(tài)性；該方法是一種在DNA水平上篩查和檢測(cè)與黃牛生產(chǎn)性狀密切相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，以便于中國(guó)黃牛肉用生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102251038SQ201110201229
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月18日
發(fā)明者劉棟, 孫曉梅, 李?lèi)?ài)民, 胡沈榮, 藍(lán)賢勇, 陳宏 , 馬云, 馬偉 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)